PLoS ONE: Magenkrebs Exosomen Trigger-Differenzierung der Nabelschnur mesenchymalen Stammzellen aus Karzinom-assoziierten Fibroblasten durch TGF-β /Smad Pathway

Abstrakt

Hintergrund

mesenchymalen Stammzellen (MSCs) das Tumorwachstum durch Differenzierung in Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAFs) und Zusammensetzen der Tumor-Mikroumgebung zu fördern. Jedoch sind die Mechanismen, die für den Übergang von MSCs zu CAFs nicht gut verstanden. Exosomen regulieren zelluläre Aktivitäten von Zell-Zell-Kommunikation zu vermitteln. In dieser Studie wollten wir, ob Krebszellen stamm Exosomen bei der Regulierung der Differenzierung von humanen Nabelschnur abgeleitete MSCs (hucMSCs) zu CAFs beteiligt waren, zu untersuchen.

Methodik /
wichtigsten Ergebnisse

Wir zuerst gezeigt, dass Magenkrebs-Zellen abgeleiteten Exosomen, die Expression von CAF-Marker in hucMSCs induziert. Wir haben gezeigt, dann, dass Magenkrebs-Zellen abgeleiteten Exosomen die Phosphorylierung von Smad-2 in hucMSCs stimuliert. Wir bestätigten ferner, dass TGF-β-Rezeptor-1-Kinase-Inhibitor abgeschwächten Smad-2-Phosphorylierung und CAF Markerexpression in hucMSCs nach der Einwirkung von Magenkrebs-Zellen abgeleiteten Exosomen.

Schlussfolgerung /Bedeutung

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Magenkrebszellen ausgelöst, um die Differenzierung von hucMSCs zu CAFs von Exosomen-vermittelte TGF-β-Transfer und TGF-β /Smad Signalweg-Aktivierung, die einen neuen Mechanismus für MSCs CAFs Übergang in der Krebstherapie darstellen

Citation.: Gu J, Qian H, Shen L, Zhang X, Zhu W, Huang L, et al. (2012) Magenkrebs Exosomen Trigger-Differenzierung der Nabelschnur mesenchymalen Stammzellen aus Karzinom-assoziierten Fibroblasten durch TGF-β /Smad Pathway. PLoS ONE 7 (12): e52465. doi: 10.1371 /journal.pone.0052465

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama in Birmingham, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 30. Juni 2012; Akzeptiert: 13. November 2012 um; Veröffentlicht: 20. Dezember 2012

Copyright: © 2012 Gu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von den großen Forschungsplan des National Natural Science Foundation of China unterstützt (kein 91129718 Grant.), der National Natural Science Foundation of China (Förder-Nr. 81071421, 31140063), wissenschaftliche und technologische Provinz Jiangsu Rahmenprogramm (Förder-Nr. BE2010703 ), 333-Projekt in der Provinz Jiangsu (Förder-Nr. 2009055) und der Sci-Tech Innovation Team und Talente der Jiangsu University (Förder-Nr. 2008-018-02). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

die Tumorzellen beginnen ihre Mikroumgebung in der frühen Phase des malignen Progression zu formen [1]. Umfangreiche Berichte haben die weitverbreitete Wechselwirkungen zwischen Tumormikroumgebung und Krebszellen nachgewiesen, die für die Tumorentstehung und Tumorprogression [2] kritisch sind, [3]. Tumor-Mikroumgebung könnte reversible Veränderungen im Phänotyp von Krebszellen hervorrufen und zu erleichtern ihre Metastasierung [4], und Änderungen der Tumormikroumgebung sogar drastisch die Wirksamkeit der Krebstherapie betreffen. Tumor-Mikroumgebung ist von verschiedenen Typen von Zellen, einschließlich Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAFs) infiltrierenden Immunzellen, Blut und lymphatischen Gefäßnetze und mesenchymale Stammzellen (MSCs) [4], [5].

CAFs sind Schlüsselfaktoren in der malignen Progression des Krebswachstums, Vaskularisierung und Metastasierung. CAFs die Fibroblasten-aktivierendes Protein (FAP) und α-Glattmuskelaktin (α-SMA) könnte eine Nische für Krebszellen schaffen und zu fördern ihre Beweglichkeit [6], [7] zum Ausdruck bringen. Tatsächlich unterziehen CAFs einen Differenzierungsprozess von Tumorzellen induziert und entwickeln invasive und Migrationsfähigkeiten [8], [9].

Mesenchymale Stammzellen sind multipotente Zellen, die aus einer Vielzahl von Geweben isoliert werden kann, einschließlich Knochen Mark, Fettgewebe, Synovium, Skelettmuskel, Leber, Nabelschnurblut, Plazenta, Nabelschnur und [10] - [13]. MSCs könnte ausgelöst werden, in Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten und Myozyten zu unterscheiden wegen ihrer Regenerationsfähigkeit und multi Kapazität [14]. MSCs nach Hause und an den Standorten der Entzündung und Verletzung überleben sowie Tumoren, was zur Bildung von Tumor-assoziierten Stroma beitragen [15]. Studien haben bestätigt, dass MSCs in Myofibroblasten, Karzinom-assoziierten Fibroblasten, Fibrozyten oder Perizyten unter den Tumor-Mikroumgebung Bedingungen unterscheiden können [6], [16], [17]. In unseren früheren Untersuchungen haben wir gezeigt, dass Knochenmark-MSCs und die daraus gewonnenen Exosomen könnte das Tumorwachstum [18], [19] zu fördern. Jedoch bleibt der Mechanismus für diesen Effekt verantwortlich weitgehend unbekannt.

Tumorzellen, interagieren mit Tumor-Mikroumgebung von Zell-Zell-Interaktion und parakrine Mechanismen wie eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, Chemokine und Matrix-abbauende Enzyme produzieren, verbessern die Proliferation und Invasion des Tumors [20]. Zusätzlich zu den bekannten Mechanismen, einen neuartigen Mechanismus, der Tumorzellen Exosomen aktiv lösen können entsteht. Exosomen haben eine besondere Zusammensetzung Re fl ihren Ursprung ektierender und kann nicht nur Membrankomponenten übertragen, sondern auch Nukleinsäure zwischen verschiedenen Zellen [21], [22], ihre Rolle in der interzellulären Kommunikation betont [23]. Thesaurierend Beweise den Beitrag der Exosomen zu einem zellulären Kommunikationsmodus gezeigt, zu interzellulären Transfer von Molekülen führt [24]. Obwohl die regulatorische Rolle von Exosomen im Immunsystem und ihre Anwendung als Impfstoff in der Krebsimmuntherapie ist vielversprechend [25] - [28]., Das Ergebnis zwischen Krebs Exosomen und Stromazellen folgende Interaktion ist nicht gut verstanden

Bösartige Zellen zurückkehren MSCs zu CAFs, die zur Förderung der Tumorprogression beitragen Untersuchung der möglichen Mechanismen für den Übergang gefördert hat. Studien haben mindestens 20% der CAFs stammen aus dem Knochenmark und stammen aus mesenchymalen Stammzellen in Maus-Modellen der Entzündung induzierten Magenkrebs [16] zeigten, dass. Wir vermuten, dass Krebs mit MSCs durch Freisetzung mitgeteilt Zellen von Exosomen und Transfer von Proteinen, also die Differenzierung von MSCs zu CAFs induzieren. In der aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass MSCs ein CAF-Phänotyp erworben Krebs abgeleitete Exosomen und die Differenzierung von MSCs zu CAFs nach Exposition mit der Aktivierung von TGF-β /Smad-Signalweg verbunden war.

Materialien und Methoden

Cell Culture

Menschliche MSCs Nabelschnur gewonnen wurden, wie zuvor beschrieben [12], [29]. Frische Nabelschnur wurden informiert, zustimmende Mütter erhoben und verarbeitet werden innerhalb von 6 h. Die Schnüre wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Penicillin und Streptomycin gespült und wurden dann Kord Gefäßen entfernt. Die gewaschenen Schnüre wurden in Stücke geschnitten von 1-3 mm ^{2 groß und in DMEM mit 10% FBS (Invitrogen, USA), 1% Penicillin und Streptomycin schwebte. Die Stücke der Schnur wurden anschließend bei 37 ° C in feuchter Luft mit 5% CO _{2, und das Medium wurde alle 3 Tage nach der anfänglichen Plattierung verändert inkubiert. Wenn gut entwickelten Kolonien von Fibroblasten-ähnlichen Zellen 80% Konfluenz erreichten, wurden die Kulturen trypsinisiert und in neue Flaschen für die weitere Expansion agierten. Die Eigenschaften des isolierten hucMSCs einschließlich morphologisches Aussehen, Oberflächenantigene, Differenzierungspotential und die Genexpression wurden wie zuvor beschrieben untersucht [12]. Alle Experiment Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität Jiangsu genehmigt. Die hucMSCs von Passage 2 wurden für die Experimente ausgewählt. Menschlichen Magenkrebszellen (SGC7901 und HGC27) wurden von Cell Bank, Type Culture Collection Committee (Chinesische Akademie der Wissenschaften) erworben. Magenepithelzellen (GES-1) wurden von Cwbiotech Company erworben und in DMEM, das mit 10% FBS gehalten.}}

exosome Isolierung und Reinigung

SGC7901, HGC27 und Magen-Epithelzellen (GES-1 ) abgeleitet Exosomen wurden isoliert und gereinigt, wie zuvor [30] beschrieben [31]. Kurz gesagt wurden in DMEM kultiviert, die Zellen mit 10% exosome abgereicherte fötalem Rinderserum ergänzt. Fetal bovine Exosomen wurden über Nacht Ultrazentrifugation bei 100.000 g für 16 Stunden entfernt mit einem Typ 90 Ti Fest-Angel Rotor (Optima L-90K, Beckman Coulter). Überstände aus konfluenten Kulturen (3-5 Tage) wurden bei 2000 g für 20 min zentrifugiert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Und der geklärte Überstand wurde durch Ultrafiltration durch eine 100 kD MWCO-Hohlfasermembran (Millipore) konzentriert bei 1000 g für 30 min. Der konzentrierte Überstand wurde in Zentrifugenröhrchen (Beckman) geladen und mit 30% Sucrose /D _{2O Dichtekissen (5 ml) Ausbilden eines sichtbaren Interphase und ultrazentrifugiert bei 100.000 g und 4 ° C für 1 h in einem SW-32Ti legter Schwenkbecherrotor (Optima L-90K, Beckman Coulter). Dann sowohl die Exosomen Saccharose-Dichtegradienten Kissen (Fraktion 3) gesammelt aus den Ultrazentrifugenröhrchen Boden und die nonbanded Fraktionen (Fraktion 6 und 7), die zur Verwendung nonmembrane Proteinkomplexe gesammelt enthalten als Exosomen Steuerung (E-Kontrolle), wurden vereinigt und dreimal durch ein 100-kDa Miniatur-Hohlfaserpatrone (Millipore) bei 1000 g für 30 min wie oben beschrieben. Der Proteingehalt wurde unter Verwendung des BCA-Assay-Kit (Pierce) gemessen. Die Exosomen wurden durch einen 0,22 &mgr; m Kapselfilter (Millipore) und gelagert bei -70 ° C bis zur Verwendung [30] sterilisiert.}

Elektronenmikroskopie

Ein Tropfen von Exosomen (etwa 20 ul) erhalten nach differentieller Ultrazentrifugation wurde auf Formvar-Kohlenstoff-beschichteten Gittern pipettiert und 1 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit mit einem Stück Filter wurde die Probe mit 2% gefärbt (w /v) Phosphorwolframsäure (pH 6,8) für 5 min und wurde unter einer elektrischen Glühlampe luftgetrocknet und mit einem Transmissionselektronenmikroskop analysiert (FEI Tecnai 12, Philips).

Exosomen Labeling und Internalisierung

SGC7901 Zellen abstammen Exosomen und die Exosomen wurden mit CM-Dil (rot) markiert Steuerung gemäß dem Protokoll des Herstellers (Invitrogen). Exosomen von GES-1-Zellen wurden als Zellkontrolle verwendet. Die markierte exosome Suspension wurde mit einer 100-kDa MWCO-Hohlfasermembran (Millipore) und der Durchfluß wurde als ungebundene Farbstoff Steuerung verwendet filtriert. HucMSCs (1 × 10 ^{4 /Vertiefung) wurden in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät Lamellen und inkubiert bei 37 ° C mit markiertem Exosomen (800 &mgr; g /ml) für 4 h vor der Ernte enthält.}

Immunofluoreszenzfärbung

HucMSCs wurden für 10 min in 4% Paraformaldehyd fixiert. Markierten Zellen wurden für die Fluoreszenzmikroskopie, hergestellt durch per-Mobilisierung für 3 min mit 0,1% Triton-X100, blockiert mit 5% BSA gewaschen und mit Kaninchen-monoklonalem anti-β-Actin-Antikörper über Nacht, gefolgt von einer Inkubation mit Cy2-markiertem Anti-Kaninchen-IgG sekundärem Antikörper bei 37 ° C für 45 min (Jackson ImmunoResearch). Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Die konfokale Bilder wurden nacheinander mit TCS SP5 II-System erworben (Leica) [32].

CAF Differenzierung

HucMSCs wurden in 6-Well-Platten ausgesät (5 x 10 ^{3 /well) . Zwölf Stunden nach dem Aussäen wurden hucMSCs mit Exosomen behandelte (800 ug /ml) auslösen, die CAF Differenzierung in Anwesenheit oder Abwesenheit von TGF-β-Rezeptor-1-Kinase-Inhibitor SD208 (Sigma) oder rekombinantem humanen TGF-β (5 ng /ml; Sigma). Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt für 14 Tage. Die Zellen wurden dann gesammelt und für die Western-Blotting und quantitative PCR-Analyse vorbereitet.}

Western Blotting

Die Zellen wurden mit RIPA-Puffer (10 mM Tris gesammelt und lysiert, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 0,1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4, 1 mM PMSF, 1 mg /ml Aprotinin, 1 mg /ml Leupeptin). Aliquots identische Mengen an Protein enthielten, wurden fraktioniert und dann Methanol voraktiviert PVDF-Membranen (Millipore, USA) übertragen. Nach sequentieller Inkubation mit dem primären und sekundären Antikörper wurde das Signal von MD Bild Quant Software mit dem HRP-Substrat (Millipore, USA) und analysiert visualisiert. Quellen und Verdünnungsfaktoren von primären Antikörper waren: polyklonalen Kaninchen-anti-CD9 (1:1000; Bioworld), anti-CD81 (1:1000; Epitomics), anti-TGF-β (1:1000; Bioworld), anti-FAP ( 1:1000, Abcam), monoklonaler Maus-anti-α-SMA (1:1000; Santa Cruz), anti-VEGF (1:1000; Santa Cruz) und anti-Vimentin (1:2000; Santa Cruz), anti-N -cadherin (1:1,000; Bioworld), Anti-E-Cadherin (1:500; SAB) und monoklonalen Maus-anti-GAPDH. (1:5000; Kangcheng)}

Quantitative RT-PCR

Gesamt-RNA wurde mit dem Trizol-Reagens (Invitrogen) extrahiert und die cDNA wurde unter Verwendung eines Reverse-Transcription Kit (Toyobo, Japan) synthetisiert gemß den Anweisungen des Herstellers. Die Primer wurden von Invitrogen Company (Shanghai, China) produziert. Echtzeit-RT-PCR wurde durchgeführt, um die Änderung von FAP, alpha-SMA, N-Cadherin und IL-6 Genexpression (Rotor-Gene 6000, Australien) zu erfassen. Um Variationen in der Eingangs RNA und die Effizienz der reversen Transkription zu kompensieren, ein endogenes "housekeeping" Gens (β-Actin) war ebenfalls quantifizierte die Ergebnisse zu normalisieren. Alle Proben wurden dreifach durchgeführt, und alle Reaktionen wurden 3 mal wiederholt unabhängig die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Migration Assay

HucMSCs (8 × 10 ^{4 in 200 &mgr; l) in Serum suspendiert -freien Medium wurden in das obere Kompartiment eingelegt und 500 &mgr; l serumfreiem Medium (SFM) 800 &mgr; g /mL Exosomen in Gegenwart oder Abwesenheit von TGF-β-Rezeptor-1-Kinase-Inhibitor SD208 (2 uM) enthält, an der Unterseite der zugegeben Transwell (Corning). Nach der Kultivierung bei 37 ° C für 6 Stunden wurden die Zellen Ober die Membran mit einem Baumwolltupfer abgewischt. Die Zellen, die durch die Membran wurden mit 4% Paraformaldehyd und mit Kristallviolett gefärbt gewandert waren. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop beobachtet und mindestens 10 Feldern von Zellen wurden für jede Gruppe untersucht.}

TGF-β Neutralization

HucMSCs mit Tumor Exosomen (800 ug /ml) behandelt wurden, die zu triggern CAF Differenzierung in Anwesenheit oder Abwesenheit von TGF-β-Antikörpers (R & D). Vor den Experimenten, anti-TGF-β-Antikörper (20 ug /ml) wurde für 2 Stunden mit Exosomen bei 37 ° C inkubiert.

Statistical Analysis

Alle Daten als Mittelwert ± exprimiert wurden SD. SPSS-Software wurde verwendet, um die Daten zu analysieren. Die Mittel der verschiedenen Behandlungsgruppen wurden durch Zwei-Wege-ANOVA-Test oder Student-t-Test verglichen. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse |

Exosomen Charakterisierung und Internalisierung

Wir isoliert und identifiziert die Exosomen auf der Grundlage ihrer einzigartigen Größe und Dichte.. Wie in gezeigt. 1A-a, hatten die Exosomen eine charakteristische untertassenartige Form begrenzt durch eine Lipiddoppelschicht mit einem Durchmesser lag im Bereich von 40 bis 100 nm. Wir bestätigten die reichliche Expression von exosomalen Marker CD9 und CD81 in unserer isolierten Exosomen durch Western Blot (Abb. 1A-b). Nach unserer früheren Studien wurden menschliche Nabelschnur abgeleitete MSCs hergestellt und charakterisiert (Daten nicht gezeigt). Um die Internalisierung von Exosomen von hucMSCs untersuchen, beschriftet wir die Exosomen mit CM-Dil. Wie in 1B gezeigt, wurden SGC7901 Zellen abstammen Exosomen internalisiert und 4 Stunden in hucMSCs nach Inkubation akkumuliert während Exosomen Steuer minimale Wirkung zeigte. Im Vergleich mit SGC7901 Gruppe, weniger GES-1 abgeleitet Exosomen wurden von hucMSCs aufgenommen.

tumorabgeleiteten Exosomen fördern hucMSCs Differenzierung zu CAFs

die Hypothese aufgestellt, dass tumorabgeleiteten Exosomen könnte die Differenzierung induzieren hucMSCs zu CAFs in-vitro-
. CAFs wurden als die erhöhte Expression von FAP und α-SMA-Proteine ​​definiert. HucMSCs einschichtigen wurde kultiviert in Medium, das 800 ug /ml SGC7901 Exosomen und GES-1 Exosomen. Quantitative RT-PCR-Analysen zeigten, dass SGC7901 Exosomen aber nicht GES-1-Exosomen, die Expression von Markern CAF in MSCs bei 36 h gefördert (Fig. 2A) und 14d (Fig. 2B) nach der Induktion. Im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe, Exosomen Tumorbehandlung führte zu Erhöhungen der FAP, α-SMA, N-Cadherin und Vimentin Protein-Spiegel (Fig. 2C). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass hucMSCs CAF Differenzierung als Antwort auf Tumor unterziehen Exosomen Exposition.

tumorabgeleiteten Exosomen fördern hucMSCs Migration

Um zu analysieren, ob die Migrationsfähigkeit von hucMSCs von Tumor Exosomen betroffen war, hucMSCs wurden in der Transwell kultiviert und induziert durch Tumor Exosomen zu migrieren. Wie in den 3A und 3B gezeigt, bei 6 Stunden nach der Inkubation gefördert Tumor Exosomen, die Migration von hucMSCs effizienter als normale Zelle abgeleitet Exosomen. Wir zeigten auch, dass die erhöhte Migration von hucMSCs durch Tumor Exosomen durch gleichzeitige Behandlung mit TGF-β R1-Inhibitor blockiert wurde, SD208. Zusätzlich untersuchten wir die Wirkung von SGC7901 Exosomen auf die Migration von hucMSCs von Scratch Assay. Die Ergebnisse wurden im Einklang mit der Transwell-Migrationstest, einen reduzierten Spaltabstand in Tumor exosome behandelten Gruppe (Abb. S1) zeigt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Tumor Exosomen, die Migration von hucMSCs fördern können In-vitro-
.

tumorabgeleiteten Exosomen aktivieren Smad2 /3 und p38 in hucMSCs

TGF- β wurde CAF Differenzierung auf der Oberfläche von Exosomen [33] und kritisch erwiesen. Wir untersuchten dann, ob TGF-β-Weg war verantwortlich für die Induktion von MSCs Übergang zu CAFs durch Tumor Exosomen. Wir haben gezeigt, zuerst das Vorhandensein von TGF-β in Tumor Exosomen (Fig. 4A). Im Vergleich zu Tumor Exosomen, normalen Zelle abgeleitet zeigte Exosomen niedrigeren Niveau von TGF-β-Expression. Um zu beurteilen, ob die Differenzierung von hucMSCs zu CAFs ist im Zusammenhang mit TGF-β Signalweg-Aktivierung, die wir untersucht den Status phosphoryliert Smad 2/3 nach der Tumor Exosomen Behandlung. Die Ergebnisse zeigten, dass Smad 2/3 Phosphorylierung durch Tumor Exosomen bei 15 min nach der Behandlung erhöht und erreichte das höchste Niveau bei 60 min nach der Behandlung, während die Summe der Smad 2/3 Proteinspiegel nicht betroffen waren. Wir stellten fest, auch das Niveau der phosphoryliert p38 und fand heraus, dass p38-Phosphorylierung auch durch Tumor Exosomen (Abb. 4B) erhöht wurde. Im Gegensatz dazu konnte GES-1 abgeleitet Exosomen nicht aktivieren Smad2 /3 und p38 (Fig. 4C). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Tumor Exosomen speziell Smad2 /3 und p38 in hucMSCs aktivieren.

TGF-β Pathway Inhibition hemmt das Tumor Exosomen-induzierte Smad2 /3 und p38 Aktivierung

Um zu zeigen, ob die Aktivierung von Smad2 /3 und p38 zu TGF-β-Signalisierung durch Tumor Exosomen ausgelöst spezifisch ist, wir blockiert TGF-β-Signalwegs mit TGF-β R1inhibitor und detektiert die Pegel von phosphorylierten Smad2 /3 und p38. Wie in gezeigt. 5A, die erhöhte Phosphorylierung von Smad2 /3 und p38 nach der Tumor Exosomen Behandlung wurde durch TGF-β R1 Inhibitor umgekehrt, SD208, in einer dosisabhängigen Weise. Zur weiteren TGF-β aus Tumor Exosomen zeigen, dass hucMSCs aktiviert, wir neutralisiert TGF-β in Tumor Exosomen unter Verwendung eines Anti-TGF-β-Antikörper. Übereinstimmend mit den Ergebnissen aus TGF-β R1 Inhibitor, die erhöhte Phosphorylierung von Smad2 /3 und p38 in hucMSCs wurden auch durch TGF-β-Antikörper (Fig. 5B) umgekehrt wird. Zusammenfassend legen diese Daten nahe, daß TGF-β aus Tumor Exosomen interagiert mit TGF-β-Rezeptor auf hucMSCs, auf die sequentielle Aktivierung von Smad2 /3 und p38 in hucMSCs führt.

TGF-β Pathway Inhibition Kehrt Tumor Exosomen -induzierte hucMSCs Differenzierung zu CAFs

TGF-β /TGF-β R1 Wechselwirkung ist verantwortlich für die Differenzierung von hucMSCs zu CAFs durch Tumor Exosomen induziert um zu demonstrieren, wir blockierten TGF-β Signalisierung mit SD208 und TGF-β Neutralisierung Antikörper, der durch Tumor gefolgt Exosomen Behandlung. Wie in 6A-a gezeigt ist, die Behandlung mit SD208 (2 uM) für 14 Tage umgekehrt stark die Tumor Exosomen-induzierte Expression von Markern einschließlich CAF FAP, α-SMA, N-Cadherin und Vimentin in hucMSCs. Wir haben bestätigt, diesen Effekt auch durch Exosomen von HGC-27 Magenkrebszellen (Abb. 6A-b) verwendet wird. Darüber hinaus führte die Behandlung mit anti-TGF-β-Antikörpers führte zu ähnlichen Effekten wie in TGF-β R1 Inhibitor beobachtet (Fig. 6B). Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass Tumor Exosomen die Differenzierung von hucMSCs zu CAFs durch die Aktivierung von TGF-β /Smad-Signalweg vermitteln.

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine neuartige identifiziert Mechanismus, durch den Tumorzellen induzieren die Differenzierung von MSCs zu CAFs. Unsere Daten zeigen, dass: (1) Magenkrebszelle abgeleitet Exosomen durch hucMSCs internalisiert werden; (2) Magenkrebszelle abgeleitet Exosomen auslösen hucMSCs Differenzierung CAFs und (3) TGF-β /Smad Stoffwechselweg vermittelt den Übergang der hucMSCs zu CAFs. Unsere Ergebnisse legen nahe, daß TGF-β in Tumor Exosomen mit dem auf hucMSCs TGF-β R1 in Wechselwirkung treten können, was zu der Aktivierung von Smad Stoffwechselweg in hucMSCs und der anschließenden Differenzierung der hucMSCs zu CAFs.

Obwohl es wurde berichtet dass Tumor Exosomen können die metastatische Aktivität der Tumorzellen [34] zu verbessern, hat die Rolle der Tumor Exosomen in MSCs noch nicht offenbart worden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Tumorzellen, kann die Mobilität von MSCs zu regulieren, was darauf hindeutet, dass Tumorzellen MSCs aus Knochenmark oder anderen Geweben zu dem Tumor-Mikroumgebung von Exosom-vermittelten Mechanismus rekrutieren kann.

Die Exposition gegenüber Tumor Exosomen erhöht die Expression von CAF-Marker in MSCs, was darauf hindeutet, dass Tumor Exosomen induziert die Schalter des Phänotyps von MSCs zu CAFs. Während dieses Papier war in Vorbereitung, Cho et al. berichtet, dass Exosomen von Brust- und Eierstockkrebs-Zellen könnte das Fettgewebe abgeleitete MSCs induzieren erwerben physiologischen und funktionellen Eigenschaften von Tumortragenden myofibroblasts [35], [36]. Unsere Arbeit ist in Einklang mit ihren Erkenntnissen und zeigt weiter, dass dieser Prozess Smad abhängig ist.

In der aktuellen Studie zeigen wir die Beweise dafür, dass Tumor Exosomen bieten eine effiziente Plattform für die Übertragung von bestimmten Nachrichten an MSCs, die Förderung MSC-CAF Übergang. Mehrere frühere Studien haben gezeigt, dass TGF-β durch Krebszellen stamm Exosomen und diese Form des TGF-β ausgedrückt ist biologisch aktiv in Antriebs Smad-abhängigen Signal [33], [37]. TGF-β ist ein Schlüsselregulator der Stammzellerneuerung und Differenzierung [38]. Wir bestätigten die Anwesenheit von TGF-β in Magenkrebszelle abgeleitet Exosomen und bestätigte die TGF-β /TGF-β R1 Wechselwirkung die Smad2 /3-Aktivierung und Differenzierung CAF in hucMSCs vermittelt.

Es wurde gezeigt, dass MSCs Förderung von Krebsmetastasen könnte [4], [39]. Wir haben auch berichtet, dass menschliche MSC konditioniertem Medium abgeleitet und Exosomen vascular endothelial growth factor (VEGF) Expression in Tumorzellen zu verbessern und das Tumorwachstum in vivo
[18], [19] zu fördern. Ob die Exosomen von MSCs könnte eine Rolle bei der Metastasierung von Krebs spielen wurde nicht angesprochen. Wir haben beobachtet, dass MSCs Exosomen die epithelial-to-Mesenchym Transition (EMT) in Magenkrebszellen fördern, aber die zugrunde liegenden Mechanismen muss noch in den zukünftigen Studien untersucht werden.

Abschließend wir in dieser Studie zeigen, dass Magen-Krebszelle abgeleitet Exosomen haben die Fähigkeit, die Differenzierung von MSCs zu CAFs und die Aktivierung von TGF-β /Smad Signalweg durch Tumor Exosomen trägt zum Übergang von MSCs zu CAFs zu induzieren. Unsere Ergebnisse liefern einen neuen Mechanismus, mit dem Tumorzellen MSCs induzieren Tumor Stroma-Zellen differenzieren sich in und bei der Bildung von Tumor-Mikroumgebung teilnehmen.

Grundinformationen
Abbildung S1.
Magenkrebszelle abgeleitet Exosomen fördern hucMSCs Migration. HucMSCs wurden mit Magenkrebszellen (SGC7901) abgeleitet Exosomen (800 &mgr; g /ml) behandelt. Scratch-Array wurde durchgeführt, die Migrationsfähigkeit der Zellen zu analysieren. (A-c) Unbehandelte hucMSCs; (D-f) SGC7901-Exosomen behandelt hucMSCs. Maßstabsbalken = 50 &mgr; m
doi:. 10.1371 /journal.pone.0052465.s001
(TIF)

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