PLoS ONE: Identifizierung und Charakterisierung von CXCR4-positivem Magenkrebs Stammzellen

Abstrakt

Diffuse-Typ soliden Tumoren sind oft aus einem hohen Anteil besteht aus wuchernden selten (dh ruhende) Krebszellen, was darauf hinweist stark die Beteiligung von Krebsstammzellen (KSZ) Obwohl diffus-Typ Magenkrebs (GC) der Patienten haben eine schlechte Prognose aufgrund der hohen häufige Entwicklung der Peritonealdialyse Verbreitung (PD), ist es begrenztes Wissen, dass die PD-assoziierte CSCs und Wirksamkeit von CSC-Targeting-Therapie bei diffusem-Typ GC. In dieser Studie haben wir metastasierendem GC-Zelllinien stark von in vivo
Auswahl für die Anreicherung von PD-assoziierten GC-Zellen entwickelt. Durch Mikroarray-Analyse fanden wir CXC-Chemokin-Rezeptor-Typ 4 (CXCR4) für hochmetastatisch CSCs a novel Marker sein, da CXCR4-positive Zellen verankerungs unabhängig wachsen können, zu initiieren Tumoren in Mäusen zu zytotoxisches Arzneimittel resistent sein, und differenzierte Tochter erzeugen Zellen. In klinischen Proben wurden diese CXCR4-positiven Zellen aus nicht nur spät Metastasierung Stufe (akkumulierte Aszites), sondern auch früher (Peritonealspülung) gefunden. Außerdem Behandlung mit Wachstumsfaktor-β transformiert verstärkte die Antikrebswirkung von Docetaxel via Induktion von Zelldifferenzierung /asymmetrische Zellteilung der CXCR4-positive Magen CSCs auch in einem ruhenden Zustand. Daher halten Versprechen Differenzierungsinduktoren für von derzeit verfügbaren Anti-Krebs-Medikamente durch Re-cycling von CSCs die maximale therapeutische Ergebnis zu erhalten

Citation. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identifizierung und Charakterisierung von CXCR4-positivem Magenkrebsstammzellen. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808

Editor: Masaharu Seno, Universität Okayama, Japan

Empfangen: 18. Februar 2015; Akzeptiert: 25. Mai 2015; Veröffentlicht: 25. Juni 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien. Alle Microarray-Daten wurden in einer MIAME kompatiblen Datenbank, GEO hinterlegt; Zugangsnummer GSE53276

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde teilweise durch das National Institute of Biomedical Innovation (für die Advanced Research für Medizinprodukte Mining Programm ID10-41), das Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales von Japan unterstützt (für die dritte umfassende 10-Jahres-Strategie für Cancer Control H22-007), National Cancer Center Forschungs- und Entwicklungsfonds (25-A-6, 26-A-3). Drs T Fujita, M Tamaoki und T Nishimura sind die Empfänger eines Forschungs Einwohner-Stipendium der Stiftung zur Förderung der Krebsforschung in Japan

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist eine der führenden Ursachen von Krebs verursachten Todesfälle weltweit. Histopathologisch können GCs in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: Darm-Typ und diffus-Typ. Darm-Typ GC überwiegt in hohem Risiko geografischen Gebieten und entwickelt sich durch einige aufeinanderfolgenden Stufen einschließlich Helicobacter pylori
( H
. pylori
) -assoziierte atrophische Gastritis, intestinale Metaplasie (IM) und Dysplasie. Im Gegensatz dazu diffus-Typ GC, die für die Hälfte aller GC Patienten ausmacht, hat eine breite geografische Verteilung und entwickelt sogar von H
. pylori
-frei, morphologisch normalen Magenschleimhaut ohne atrophische Gastritis oder IM, und diffundieren-Typ GC kann vom Darm-Typ unterscheiden sich sowohl genetisch und phänotypisch [1-5]. Im Gegensatz zu der abnehmenden Häufigkeit des Darmtyps, die Prävalenz der diffuse-type steigt angeblich weltweit [6]. Die Prognose für fortgeschrittene diffuse-Typ GC Patienten hat eine hohe Rate der Peritonealdialyse Verbreitung (PD) (78%) schlecht in der letzten Dekade blieb wegen im Vergleich zu der Darm-Typ (45%) [7]. Insbesondere Patienten mit Bormann Typ IV GC haben eine extrem schlechte Prognose, auch wenn sie multidisziplinäre Behandlung [8] erhalten. Daher PD Adressierung ist ein dringendes Problem für Verbesserung der Prognose von diffusem-Typ GC-Patienten.

Diffuse-Typ GCs werden in der Regel durch eine umfangreiche Stromatumoren Fibrose mit schlechter Durchblutung und seltene proliferative gekennzeichnet ( i
. e
. dormant) Krebszellen, die zu einer erheblichen therapeutischen Widerstand führt. Unter dem Gesichtspunkt der Chemotherapie, transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) gedacht wurde auf die aggressive Progression über epitheliale-mesenchymale Transition und durch Induzieren Fibrose [9] beizutragen. Jedoch TGF-β inhibiert auch die Zellproliferation, Apoptose, vermittelt und Differenzierung in Epithelzellen, was darauf hindeutet, dass die Komponenten der TGF-β Signalwege tumorunterdrückende Aktivität in epithelialen Tumoren [10, 11]. Obwohl vermehrt Hinweise, die kritische Rolle von TGF-β in Krebsstammzellen (CSC) Biologie gezeigt hat, gibt es nur begrenzte Informationen in Bezug auf ihre Rolle bei der diffusen Typ GCs.

Es wurde berichtet, dass jede Population von Tumorzellen funktionelle Heterogenität zeigen durch unterschiedliche Proliferation und Differenzierungsfähigkeit in verschiedenen Arten von Tumoren charakterisiert [12]. Zur Berücksichtigung solcher Tumorheterogenität, zwei Modelle vorgeschlagen: die klonalen Evolution Modell [13] und das CSC-Modell [14]. Letzteres Modell hat große Aufmerksamkeit erhalten, da es eine vernünftige Erklärung für die Resistenz gegen herkömmliche Chemo- und Strahlentherapie bietet, in der Ruhe- oder langsam Radfahren CSCs überleben, und führt zu einer eventuellen Tumorrezidiv [15-17]. Deshalb, um therapeutische Strategien zielen CSCs zwingend notwendig sind Resterkrankung zu beseitigen und nicht nur GC eine Wiederholung zu verhindern, sondern auch andere Krebsarten. Weiterhin mit aktuellen Einblicke in die zellulären Mechanismen der Karzinogenese wird das metastatische Potential von Tumorzellen CSCs zugeschrieben, die klonal Tumorbildung an entfernten Stellen [18 19] initiieren kann. Obwohl eine Anzahl von Molekülen der Zelloberfläche als CSC-Marker in einer großen Vielzahl von menschlichen Tumoren vorgeschlagen worden sind, besteht in GCs für PD-assoziierter CSCs kein Marker identification [20-23] wurde. Um solche Marker zu identifizieren, als wir den Begriff, die funktionell und genetisch heterogene Tumoren haben gemeinsame und innere Mechanismen der Tumor Wartung entsprechend dem Kontext eines bestimmten Mikroumgebung. Dementsprechend nahmen wir an, dass CSCs sollten funktional von gut validierten Tests wie in vivo
Transplantation definiert werden. Im diffusen Typ GC, konzentrierten wir uns zunächst auf das Peritoneum spezifische Besiedlung von Zellen und bereichert die PD-assoziierten CSCs durch wiederholte in vivo
Auswahlen [24, 25]. Dabei fanden wir CXC Chemokin-Rezeptor-Typ 4 (CXCR4) ein Marker für PD-assoziierten Magen CSCs sein kann und gezeigt, dass TGF-β die Wirksamkeit von Anti-Tumor-Medikamente via Induktion von Zelldifferenzierung /asymmetrische Zellteilung in den CXCR4 verbessert ^{+ CSC Bevölkerung sogar in einem Ruhezustand.}

Materialien und Methoden

Klinische Proben

Klinische Proben durch das National Cancer Center Hospital (Tokyo, Japan) nach Erhalt zur Verfügung gestellt wurden eine schriftliche Einverständniserklärung von jedem Patienten und Genehmigung durch National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

Die Zelllinien und Primärkulturen

Ein Mensch GC-Zelllinie, HSC-60 wurde durch einen Mitarbeiter wird das Verfahren unter Verwendung von wie zuvor beschrieben [26]. Ein hoch Peritonealdialyse-metastatischen Zelllinie wurde 60As6 von HSC-60 etabliert orthotoper Gewebe Implantation in SCID /SCID-Mäusen, wie kurz folgt: Der xenografted Tumor von HSC-60-Zellen in der Magenwand einer Maus transplantiert wurde. Wir wiederholten sechs Zyklen des Erntens Aszites-Tumorzellen und die orthotope Inokulation dieser Zellen. Diese zwei Zelllinien wurden in einem RPMI-1640-Medium gehalten, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt. Wir stellten auch zwei Luciferase-exprimierenden Zelllinien (HSC-60Luc und 60As6Luc). Sechs weitere GC-abgeleiteten Zelllinien (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 und KATO III) wurden ebenfalls unter den gleichen Bedingungen gehalten. Von diesen sechs HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58 und 58As9 wurden durch das obige Verfahren festgelegt [27, 28], und KATO III wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Für Primärkulturen von Patienten Peritonealspülung und Aszites (NSC-16C, NSC-20C und NSC-22C) und kultiviert in RPMI-1640-Medium wurden die Zellen mit 10% fötalem Kälberserum gesammelt.

Microarray-Analyse

die Gesamt-RNA von 60As6, 60As6Luc, HSC-60 und HSC-60Luc Zellen wurde durch Suspendieren der Zellen in einem ISOGEN Lysepuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan), gefolgt von Isopropanol-Fällung isoliert. Wir haben Microarray-Analysen zweimal von Human Genome U133 Plus 2.0 Array mit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Die Verfahren wurden gemäß den Protokollen des Lieferanten durchgeführt. Die Arrays wurden mit einem GenChip Scanner 3000 (Affymetrix) gescannt und die Daten wurden von Microarray Suite Version 5.0 mit Affymetrix Standardanalyseeinstellungen und globale Skalierung als Normalisierungsmethode analysiert. Die getrimmten Mittelwert Zielintensität jedes Feldes wurde willkürlich festgelegt bis 1000. Alle Microarray-Daten wurden in einer MIAME kompatiblen Datenbank, GEO hinterlegt worden ist; Zugangsnummer GSE53276. Durch eine 2-fache Änderung wurden 684 Gene spezifische Gene für 60As6 und 60As6Luc Zellen ausgewählt, und 1150 Gene wurden für die HSC-60 und HSC-60Luc Zellen ausgewählt.

Tierversuche

Sechs -week alte weibliche C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) Mäusen (Clea Japan, Japan) wurden mit einem 12 h Hell /dunkel-Zyklus täglich bei Raumtemperatur gezüchtet. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und zur Verfügung gestellt sterile Nahrung, Wasser und Käfige. 1 × 10 ^{4 bis 1 × 10 6 von Krebszellen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und dann injiziert in die Bauchhöhle durch die Verwendung eines 1 26/2-Gauge-Nadel suspendiert. Die Mäuse wurden gewogen und wöchentlich gemessen. Humane Endpunktkriterien enthalten erhebliche Ansammlung von Bauch Aszites, Dyspnoe, Piloerektion, Anämie oder Gewichtsverlust von 10% des Anfangsgewichts übersteigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien der Internationalen Gesellschaft zum Studium des Schmerzes durchgeführt und wurden von der Kommission für Ethik in Tierversuchen des National Cancer Center genehmigt. Es wurden Anstrengungen unternommen, die Zahlen und das Leiden der Tiere in den Experimenten verwendet zu minimieren.}

RT-PCR

Die Gesamt-RNA durch Suspendieren der Zellen in einem ISOGEN Lysepuffer gefolgt von Isopropanol-Fällung isoliert. Semi-quantitative RT-PCR wurde im linearen Bereich von 25 bis 30 Zyklen für MUC5AC
durchgeführt, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
, LGR5
, TGFBR1
, TGFBR2
und ACTB
mit folgenden Primer: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'und 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 'für MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' und 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'für CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' und 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 'für CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'und 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' für CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'und 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' für LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'und 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' für TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'und 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' für TGFBR2
und 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'und 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' für ACTB
.

Immunzytochemie

Indirekte Fluoreszenz Immunzytochemie wurde für CXCR4 durchgeführt, MUC5AC und Smad2 /3 in 4-Well-Kammerobjektträger gezüchteten Zellen. Zellen wurden für 20 min in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. (R & D Systems, Minneapolis, MN) - Nach dreimaligem Waschen in PBS (), wurden sie mit anti-human CXCR4 monoklonalen Antikörper inkubiert, anti-human MUC5AC-Antikörper (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA) oder anti- menschliche Smad2 /3-Antikörper (BD Biosciences, Bedford, MA), gefolgt von Inkubation mit einer 1: 1000 Verdünnung von Esel-anti-Maus-Alexa 488-konjugiertes Serum (Invitrogen, Grand Island, NY) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Zellkerne wurden gefärbt mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Für Zell-Linie Test, sortiert einzelne CXCR4 ^{+ kleine Zellen wurden gefärbt von Celltracker Green (Invitrogen), um die lebenden Zellen zu verfolgen.}

Durchflusszytometrie und Zellsortierung

60As6 Zellen (1 × 10 ^{6 Zellen) mit den folgenden Antikörpern bei 4 ° C für 30 min co-inkubiert wurden: von BioLegend erhaltenen APC-Anti-Human CD184 (CXCR4) (IgG2a, Klon 12G5) oder APC-Maus IgG2a, k Isotypkontrollreagenzien ( San Diego, CA). Tote Zellen wurden mit Propidiumiodid markiert und aus der Analyse ausgeschlossen. In Zellsortierung wurden die CXCR4-positiven und CXCR4-negativen Subpopulationen gereinigt, um einen Jsan Zellsortierer mit (Bay Bioscience, Kobe, Japan), und wurden von einer Software analysiert, FlowJo (Baum Star, Inc., Ashland, OR). Für die Zellzyklus-Analysen wurden die Zellen für 5 Tage auf einem serumfreies Medium überführt und anschließend mit 0,05% Trypsin-EDTA geerntet und dann in kaltem 80% igem Ethanol suspendiert. über Nacht bei -20 ° C nach dem Fixieren wurden die Proben in PBS (-) gewaschen und in 500 ul PI /RNase Färbepuffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) inkubiert pro 1 × 10 6 Zellen für 30 min bei Raumtemperatur vor der Analyse. Die Durchflusszytometrie wurde unter Verwendung von FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ) und analysiert durch eine Software, FlowJo.}

Anchorage-unabhängige Zellwachstum Assay

Eine Koloniebildung in Weichagar-Test wurde durchgeführt mit der CytoSelect 96-Well Zelltransformation Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, 5 x 10 ^{3 CXCR4-positiven oder CXCR4-negativ wurden suspendiert kleine Zellen in DMEM 0,4% niedrigschmelzender Agarose und 10% FBS und ausgesät auf 1% niedrig schmelzender Agarose, das DMEM und 10% FBS enthält. Nach dem Inkubieren CO die Zellen für 5 Tage bei 37 ° C in 5% _{2 wurden die Zellen lysiert und mit CyQuant GR Farbstoff nachgewiesen. Die Fluoreszenz der Kolonie-bildenden Zellen wurde in Multifunktionale Mikroplatten-Reader (Safire, Tecan, Männedorf, Swizerland) bei Anregungs- /Emissionswellenlängen von 485/520 nm.}}

Invasion Assay

Zellinvasion lesen unter Verwendung von BD BioCoat Tumorinvasion-Testsystem (BD Biosciences) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, 4 x 10 ^{5 von 60As6 Zellen mit serumfreiem Medium wurden in die obere Kammer des Systems beimpft. Boden Vertiefungen wurden mit Medium mit 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA) gefüllt. Nach 24 h Inkubation wurden die Zellen in der oberen Kammer entfernt und die Zellen, die durch die Matrigel-Membran eingedrungen wurden mit Diff-Quick-Färbung (BD Biosciences) und gezählt manuell gefärbt.}

Caspase Assay

Die 60As6 Zellen wurden in einer 96-Well-Platte (5 x 10 ^{3 Zellen /Vertiefung) vorbereitet. (; D Systems 240-B, R &) in die Zellkultur bei der Caspase 3/7-Assay wurde bei 24 Stunden nach der Zugabe von rekombinantem TGF-β1 unter Verwendung des Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI) durchgeführt, eine Konzentration von 2 ng /ml.}

Zellwachstumsassays

IC zu bestimmen _{50 Werte gegen Docetaxel (Doc), beide HSC-60 und 60As6-Zellen wurden in Gegenwart von 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) für 4 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 durch das herkömmliche MTT-Assay gefolgt. Für die Validierung der Kombinationsbehandlung mit Doc und TGF-β, die alle 60As6 Zellen und 2 Primärkulturen (NSC-16C und -22C) wurde in einer 6-Well-Platte vorbereitet (1 x 10 ^{5 Zellen /Well), gefolgt von eine Behandlung mit Doc (2,5 nM) und TGF-β1 für 72 h (0 oder 2 ng /ml) bei 37 ° C in 5% CO 2. Zellen wurden durch Trypanblau gezählt und mit TC20 Automatisierte Zellzähler (Bio-Rad, Hercules, CA) gefärbt.}}

Statistical analysis

Alle Daten wurden als Mittelwert ± SE ausgedrückt, und analysiert unter Verwendung von das ungepaarte t-Test. Die akzeptierte Signifikanzniveau war p
< 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) wurde für alle statistischen Analysen verwendet.

Ergebnisse

• PLoS ONE: SIRT3 Verstärkt Glykolyse und Proliferation in SIRT3-exprimierenden Magenkrebszellen
• PLoS ONE: MicroRNA-137 Trägt zur Gedämpfte Tumorigenesis in menschlichen Magenkrebs durch AKT2