PLoS ONE: In vitro karakterisering af den hurtige cytotoksicitet Anticancer peptid HPRP-A2 gennem Membrane Destruction og intracellulære mekanisme mod mavekræft Cell Lines

Abstrakt

I denne undersøgelse HPRP-A2, et syntetisk 15-mer kationiske peptider med alle D-aminosyrer, hæmmede effektivt overlevelsen af ​​gastriske cellelinier på en dosis-afhængig måde. Gastriske tumorceller drab af HPRP-A2 involverer en hurtig kollaps af membranen integritet og intracellulære signalveje. Propidiumiodid (PI) og lactatdehydrogenase (LDH) analyser viste, at en times behandling med HPRP-A2 medførte membranpermeabilitet ændringer af BGC-823 celler på en dosisafhængig måde. Desuden HPRP-A2-induceret apoptose i BGC-823 celler indebærer en markant stigning i dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), caspase-3, -8 og -9 aktivering, en reduktion på mitochondriemembranpotential (MMP), og cellecyklus anholdelse i G1 fasen. Ud over sin iboende cytotoksicitet, HPRP-A2 synergieffekt kraftigt med doxorubicin (DOX) for at forbedre effektiviteten af ​​at dræbe gastriske tumorceller i n vitro
. Vi mener, at HPRP-A2 med alle D-aminosyrer kan være en potent kandidat for anticancer terapeutiske midler, især i kombination terapi

Henvisning:. Zhao J, Hao X, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) In vitro
Karakterisering af den hurtige cytotoksicitet Anticancer peptid HPRP-A2 gennem Membrane Destruction og intracellulære mekanisme mod mavekræft cellelinier. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10,1371 /journal.pone.0139578

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juli 2, 2015; Accepteret: September 15, 2015; Udgivet den 30. september, 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.373.445, YXC og nr 21.442.001, YBH) og Natural Science Foundation of Jilin provinsen (nr 20150101189JC , YC og nr 20140101042JC, YBH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

over de seneste årtier, selv om der er opnået gennembrud i udviklingen af ​​behandlinger mod kræft, modstand og uspecifik toksicitet konventionelle lægemidler er stadig flaske-hals emner for potentielle kliniske praksis [1-3]. Derfor er det presserende behov for at udvikle nye lægemidler med forskellige virkemåder, som kan afhjælpe manglerne i mange tilgængelige lægemidler.

I øjeblikket er de mulige anvendelser af anticancer peptider (AVS-landene) som terapeutiske midler til behandling af kræft progression tiltrække mere opmærksomhed end konventionel kemoterapi primært på grund af de følgende egenskaber: (1) høj specificitet. De positivt ladede peptider selektivt målrette cancerceller, der bærer negative ladninger og har forskellige membrankomponenter fra normale celler [4, 5], (2) nye virkningsmekanisme. Det kunne undgå etableret multidrug-resistensmekanismer [5-7]; (3) synergistisk anticancervirkning med kemoterapeutika. Det er blevet rapporteret, at visse AVS-stater kan producere synergistisk anticanceraktivitet når kombineret anvendelse med forskellige konventionelle anticancerlægemidler [8-10].

Den generelle mekanisme for peptid-induceret celledød er cytoplasmatiske membran afbrydelse via micelledannelse eller poredannelse , selvom nogle af AVS-landene er rapporteret at udløse apoptose ved døden receptor pathway og /eller mitokondriske pathway [8, 11]. Endvidere kan poredannelse på cellemembranen og ændringen af ​​membranpermeabiliteten give en bedre kanal til optagelse af andre anticancerlægemidler ind i celler og forbedre deres anticancer aktiviteter [8, 12].

Vores tidligere undersøgelse har bevist, at HPRP-A2 kan inducere celledød og samtidigt forbedret DOX /epirubicin (EPI) induceret apoptose i HeLa og HepG2 cellelinjer [12]. Desuden, på grund af D-aminosyre sammensætning, HPRP-A2 er resistent over for proteolytisk spaltning og bevarer tilsvarende anticancer aktiviteter til sine L enantiomerer [6, 12]. Baseret på de tidligere undersøgelser, vi sigter mod at opnå to mål i denne undersøgelse: at afgrænse den underliggende anticancer mekanisme HPRP-A2 og til at undersøge den synergistiske anticancer effekt på BGC-823 og SGC-7901 celler, når de kombineres HPRP-A2 med DOX.

Materialer og metoder

cellelinjer og cellekultur

Humane mavekræft cellelinjer BGC-823 og SGC-7901 blev opnået fra American Type Culture Collection der godkender cellen linjer ved korte tandemgentagelse DNA-analyse, blev anvendt inden for 6 måneder efter genoplivning og dyrket i DMEM med føtalt bovint serum (FBS; 10% v /v), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 U /ml) i en fugtig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO _2.

peptidsyntese og oprensning

peptidet blev syntetiseret ved fastfase-peptidsyntese ved anvendelse af Fmoc (9-fluorenyl -methoxycar-nyl) kemi som beskrevet tidligere [13]. Yderligere karakterisering blev påvist ved massespektrometri og aminosyreanalyse. DOX · HCl blev købt fra Meilun Biologi Technology Co Ltd (Dalian, Kina).

Cell levedygtighed analyser

BGC-823 og SGC-7901 celler (5 x 10 ^{3) blev udpladet i tre eksemplarer på 96-brønds mikrotiterplader. Komplet medium blev udskiftet efter 24 timer med 100 pi frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af lægemidler. Efter yderligere 24 timer blev cellerne inkuberet med 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) ved 37 ° C i 4 timer. Derefter dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat for at opløse de formazankrystaller og absorbansen ved 492 nm blev målt med en mikropladelæser (GF-M3000; Gaomi CaiHong Analytical Instruments Co, Shandong, Kina). Jin formel blev anvendt til yderligere kvantificere den synergistiske virkning af kombinationen behandling af HPRP-A2 og DOX. Formlen er: Q = Ea + b /(Ea + Eb-Ea × Eb), hvor Q er kombinationen indeks; Ea + b repræsenterer den celleproliferative inhiberingshastigheden af ​​den kombinerede lægemiddel; Ea og Eb er tegn på den celleproliferative hæmning af hvert enkelt lægemiddel. Efter beregning:. Q < 0,85, Q > 1,15 og 0,85 < Q < 1,15 indikerer antagonisme, synergi og additiv effekt, henholdsvis [14]}

Hæmolyse aktivitet assay

Hæmolyse aktivitet analyse var udført som tidligere beskrevet [13]. Til opnåelse røde blodlegemer, blev frisk humant blod stabiliseret med EDTAK centrifugeret ved 1.000 rpm i 5 min, vasket to gange med PBS og fortyndet til en slutkoncentration på 2% i PBS. 70 pi 2% humane erythrocytter blev tilsat til en rundbundet plade med 96 brønde, efterfulgt af 70 pi af forskellige koncentrationer af HPRP-A2. Efter inkubation ved 37 ° C i 1 time blev pladen derefter centrifugeret ved 3000 rpm i 10 min og 90 pi supernatant blev overført til en fladbundet plade med 96 brønde. Frigivelsen af ​​hæmoglobin blev bestemt ved at måle absorbansen af ​​supernatanten ved 540 nm. Erythrocytter i PBS og destilleret vand (dH _{2O) blev anvendt som negative og positive kontroller, hhv. Den hæmolytiske aktivitet blev beregnet som procentdelen af ​​forsøgsgruppen og positiv kontrol, efter subtraktion af den negative kontrol hhv. Dataene er gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg.}

PI assay

BGC-823-celler (1 x 106 celler /brønd) blev podet i seks-brønds plader. Efter inkubation med HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 1 time, blev cellerne opsamlet og derefter behandlet med 5 ug /ml PI ved 4 ° C i 10 minutter i mørke. Celler blev vasket med PBS i tre gange og derefter detektere fluorescens intensiteten af ​​PI ved hjælp af flowcytometri (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA).

LDH-frigivelse

LDH-frigivelse aktivitet blev målt ved LDH-assay kit (Jiancheng Bioengineering, Ltd., Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger. BGC-823-celler blev podet ved 5 x 10 ^{3 celler /brønd i en plade med 96 brønde. Efter inkubation med HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 1 time, blev udgivelsen af ​​LDH i supernatanten målt med en mikropladelæser (GF-M3000, Gaomi CaiHong Analytical Instruments Co, Ltd Shandong, Kina) på 450 nm. Celler uden behandling eller lyseret med Triton X-100 blev anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Alle eksperimenter blev udført i triplikater. LDH-aktivitet blev beregnet som procentdelen af ​​forsøgsgruppen og positiv kontrol, efter subtraktion af den negative kontrol hhv.}

ROS assay

ROS assaykit (BestBio, Co. Shanghai, Kina) blev anvendt til detektere dannelsen af ​​ROS. Celler (1 × 106) blev behandlet ved HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 1 time. De efterfølgende procedurer blev udført i overensstemmelse med producentens protokol. Kort fortalt blev celler fordøjet med trypsin centrifugeret ved 1.500 rpm i 3 min, vasket tre gange med PBS og derefter suspenderet i 500 pi PBS. Efter inkubering med 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) fluorescerende probe i 20 minutter ved 37 ° C blev cellerne vasket med PBS i tre gange og detekteres den grønne fluorescensintensitet (i GEOMEAN) ved flowcytometri. Den grønne fluorescensintensitet var positivt korreleret med niveauet af ROS.

Måling af MMP

MMP blev bestemt ved mitokondriemembranen potentielle assay kit med 5,5 ', 6,6'-tetrachlor -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid (JC-1), som er en sonde af mitokondriel aktivitet (BestBio, Co, Shanghai, Kina). JC-1 anvendes altid til at detektere mitochondrial depolarisering, der forekommer i de tidlige stadier af apoptose. Når celler med høj MMP, JC-1 samlet i den mitokondriske matrix, danner J-aggregater og producere røde fluorescens. Omvendt celler indeholdende JC-1 monomer-monomer monomermonomer har lav MMP og viser grøn fluorescens. Mitokondrie depolarisering blev bestemt ved et fald i den røde (590 nm, FL-2 kanal) /grøn (530 nm, FL-1 kanal) fluorescensintensitet ratio. Kort fortalt, efter behandling med HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 1 time, blev BGC-823 celler opsamlet og inkuberet med 0,5 ml JC-1 arbejdsopløsning i 20 min ved 37 ° C, derefter vasket to gange med PBS, suspenderet i PBS og analyseret med flowcytometri (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA).

Caspase aktivitetsassay

Celler blev behandlet med HPRP-A2 (10, 15 uM) i 24 timer og derefter niveauer af caspase aktiviteter blev målt under anvendelse af de tilsvarende caspaseaktivitet afsløring kits (BestBio, Co, Shanghai, Kina), ifølge producentens anvisninger. Gennemsnitsdata præsenteres som middelværdi ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

Cellecyklusanalyse

BGC-823 celler (1 x 10 ^{6) blev podet i 6-brønds plader i 24 timer. Efter induktion med HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 24 timer blev cellecyklusfordeling bestemt ved en FACScan-cytometer and Cell Quest software (FACS Calibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Alle eksperimenter blev udført i triplikater.}

Statistisk analyse

Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige bestemmelser. Statistisk signifikans af forskelle mellem grupper blev analyseret af t
-test, med signifikans accepteres på P
< 0,005 (*) og P
< 0,001 (**).

Resultater

Peptide og cytotoksicitet

Som vist i figur 1, peptid HPRP-A2 er et 15-rest α-helix amfipatisk membran-aktive peptid sammensat af alle D-aminosyrer. Sammenligne den selektive toksicitet HPRP-A2 i retning gastriske cancerceller og normale celler (humane røde blodlegemer), kan vi let finde, at IC _{50 (koncentrationen af ​​lægemiddel, ved hvilken cellelevedygtigheden blev reduceret med 50% sammenlignet med ubehandlet celler) værdier er langt mindre end den minimale hæmolytiske koncentration (koncentration af lægemiddel, der resulterede i 20% celle hæmolyse) af det HPRP-A2. Disse resultater indikerede, at HPRP-A2 selektivt kan dræbe mavens cancerceller og skåne normale celler (fig 2 og 3). Lignende anticancer aktiviteterne i de to cellelinier (BGC-823 og SGC-7901) viste, at der var en bredspektret effekt i anticancer virkning af HPRP-A2. På grund af sin membran-aktive karakteristik, HPRP-A2 viser anticancer terapeutisk potentiale, da det er mere selektivt toksisk dybt tumorceller end normale celler.}

HPRP-A2 inducerede forøgelse af membranpermeabilitet

for at kontrollere ændringen af ​​membranpermeabilitet efter inkubation med HPRP-A2, den cellulære optagelse af PI og ekstracellulær frigivelse af LDH blev undersøgt med flowcytometri og mikropladelæser mod BGC-823 celler. Som vist i figur 4, de flowcytometriske grafer af PI bevæger gradvist til retningen af ​​høj fluorescens intensitet i en koncentrationsafhængig måde, og den øgede frigivelse af LDH blev også observeret i de celler inkuberet med HPRP-A2. Det vil sige, HPRP-A2 kan forårsage beskadigelse af cellemembranen og resultere i en forbedring af cellemembranens permeabilitet.

HPRP-A2 forårsagede skader af mitokondriefunktionen

Den intracellulære reaktive ilt arter (ROS) frigivelse og mitokondrie membran potentiale (MMP) blev påvist med FACS at afspejle mitokondrier funktion BGC-823 celler in vitro
. Som vist i fig 5A, den flowcytometriske histogram af cellerne inkuberet med højere koncentration af HPRP-A2 afslørede højere fluorescensintensitet efter inkubation i 1 time. Den tilsvarende flowcytometrisk kvantitativ sammenligning af fluorescens intensitet i GEOMEAN på disse forskellige koncentrationer viste en lignende tendens, nemlig at den øgede frigivelse af ROS i BGC-823 celler i tilstedeværelsen af ​​HPRP-A2 var koncentrationsafhængig. Tilsvarende koncentrationsafhængig skiftende tendens blev også observeret i fig 5B, forholdet mellem FL2-H /FL1-H markant nedsat, hvilket indikerer en depolarisering af MMP.

caspaseaktivering og cellecyklusanalyse

aktivering af caspase-3, -8 og -9 i HPRP-A2-inducerede celler blev målt under anvendelse af en med en mikropladelæser ved 405 nm. Som vist i fig 5C, caspase-3, -8 og -9 blev alle forøget efter behandling med HPRP-A2 i 24 timer i BGC-823-celler, hvilket antyder, at induktion af apoptose ved HPRP-A2 kan være caspase-afhængig . Som vist i figur 6, BGC-823-celler behandlet med de forskellige koncentrationer af HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) i 24 timer resulterede i stigningerne i sub-G1 arrest og i G1 arrest. Disse resultater styrkede også den øgede caspase-3 aktivitet efter behandling af HPRP-A2.

HPRP-A2-inducerede stigning i DOX cytotoksicitet

BGC-823 og SGC-7901 celler blev udvalgt til studere den synergistiske anticancervirkning af HPRP-A2 og kemoterapeutisk lægemiddel DOX. Celler blev behandlet med HPRP-A2 (6 uM) og /eller Dox (1,6 ug /ml) i 4, 24 og 48 timer. MTT-assays blev anvendt til at evaluere de kombinatoriske anticancer virkninger på celler. Lægemiddelkoncentrationerne udvalgt i denne undersøgelse var baseret på IC _{50 værdier af hvert lægemiddel alene. Der var ingen indlysende cytotoksicitet eller vækst nedsættelse ved hvert lægemiddel blev brugt alene. I modsætning hertil, når der anvendes i peptidet /lægemiddelkombinationer (HPRP-A2 /DOX) ved de samme doser af bruges alene, kombinationen udviste signifikant cytotoksicitet (figur 7). Det er også klart, at anticancer aktivitet af HPRP-A2 ikke var meget påvirket af inkuberingstiden; derimod med stigningen i inkubationstiden til 48 h, DOX viser meget større anticancer aktivitet end 4 timer, med angivelse af de dramatisk forskellige virkningsmekanismer mellem AVS og kemoterapeutiske stof. Ifølge Jin formel, alle Q (kombination indeks) værdier var større end 1,15, hvilket indikerer, at der var betydelige synergieffekter mellem α-helix peptid HPRP-A2 og den konventionelle anticancer narkotika DOX i BGC-823 og SGC-7901 celler .}

diskussion

Anticancer peptider (AVS-landene) for nylig har fået store opmærksomhed som lovende kemoterapeutiske midler, som undgår ulemperne ved nuværende lægemidler. Mange undersøgelser har bekræftet, at nogle syntetiske og naturlige kationiske peptider besidder en hurtig og bredt spektrum af anticancer aktivitet over tumorceller snarere end normale celler, såsom humane røde blodlegemer [4, 15]. Desuden blev ACP'er også bekræftet at have evnen til at overvinde den multidrug-resistens mekanisme, og synergistiske virkninger i kombinationsbehandling [11].

HPRP-A2 har en hurtig og bredspektret anticanceraktivitet imidlertid nogle forskelle også forekomme i følsomheden af ​​HPRP-A2 til forskellige cellelinier. Baseret på den anden IC _{50 værdier for HPRP-A2 til BGC-823 (8,65 ± 0,38 uM), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 uM), PC3 (21,38 ± 0,56 uM), og B16 (19,16 ± 0,38 uM ), valgte vi BGC-823 og SGC-7901 celler som forskningsmål. Desuden har anticancer aktiviteter HPRP-A2 til andre kræft cellelinjer, såsom HeLa og HepG2 blevet offentliggjort i vores tidligere papir [12]. Begge BGC-823 og SGC-7901 celler hører til gastrisk cellelinjer, således valgte vi BGC-823 som et eksempel til at undersøge anticancer mekanisme HPRP-A2 in vitro
.}

i denne undersøgelse har vi vist, at HPRP-A2 er en amfipatisk α-helix peptid med signifikant anticanceraktivitet til BGC-823 og SGC-7901 cellelinier. Vores undersøgelser har indikeret, at HPRP-A2, udviste en cancer-selektiv toksicitet, primært fordi at cancerceller er sammensat af flere anioniske phospholipider og indeholder O-glycosyleret mucin, hvilket øger den negative ladning på kræft celleoverfladen [16, 17]. Desuden kan flere mikrovilli på kræftceller øge koncentrationen af ​​bindende peptid ved at udvide membranen overflade og dermed vise stærkere cytotoksicitet mod kræft cellemembraner [11, 18].

AVS-landene er i stand til at ødelægge cellemembranen, hvilket kan forårsage cellemembranpermeabilitet ændringer. I denne undersøgelse blev ændringen af ​​BGC-823 cellemembranen observeret ved påvisning PI-permeabilisering og LDH frigivelse. De gradvise stigninger på PI permeabilisering og LDH frigivelse er i koncentrationsafhængige manerer efter behandlingen med HPRP-A2. Desuden HPRP-A2-induceret celledød er associeret med genereringen af ​​reaktive oxygenspecies, depolarisering af MMP, aktiveringen af ​​caspase aktiviteter og blokeret G1-fasen af ​​cellecyklussen.

Ud over den cytotoksicitet HPRP-A2, vi bevist, at det kunne øge effektiviteten af ​​DOX mod BGC-823 og SGC-7901 celler, der er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse. I vores tidligere undersøgelse har vi undersøgt multikombinerbare anticancer behandling med α-helix peptider HPRP-A1 og HPRP-A2 med de kemiske stoffer DOX og EPI i HeLa og HepG2 cellelinjer [12]. Den viste synergi tillader brugen af ​​relativt lave koncentrationer af peptider og lægemidler for at opnå betydelige anticancer effekter in vitro
in vivo
. Denne reduktion dosis minimerer drug bivirkninger på normale celler og muliggør en effektiv apoptose-medieret anticancervirkning. Vores nuværende undersøgelse har konsekvenser at HPRP-A2 kan blive en lovende anticancer terapeutisk middel med høj anticancer selektivitet og stærk synergistisk effekt i kombinationsbehandling. Vores undersøgelser primært illustrere mekanismen for HPRP-A2-induceret celledød og kan være nyttige i design af kemoterapeutika mod gastrisk cellelinjer.

Konklusioner

HPRP-A2 viser stærk anticancer aktivitet BGC- 823 og SGC-7901 cellelinier og lav toksicitet mod humane røde blodlegemer. HPRP-A2-induceret celledød både ved direkte membran-destruktiv virkning og intracellulære mekanismer, herunder en dramatisk stigning i caspase-3, -8 og -9 aktivering, en reduktion af mitokondriel membranpotentiale (MMP), og generering af ROS og standsning af cellecyklus i G1. Desuden HPRP-A2 synergieffekt stærkt med DOX for at øge effektiviteten af ​​at dræbe gastriske tumorceller in vitro
. Vores resultater understreger den brede anticancer potentiale HPRP-A2 og belyse dets virkningsmekanisme. Vi mener, at tilføre AVS-landene med mere effektive og tumor målretning egenskaber vil åbne nye måder at bekæmpe kræft med succes.

• PLoS ONE: intratumoral Uensartede regler om HER2, FGFR2, cMET og ATM i Gastric Cancer: Optimering Personlig Healthcare gennem Innovativ Patologisk og statistisk analyse
• PLoS ONE: Kvantificering af jodindholdet af Perigastric fedtvæv af Dual-Energy CT: en ny fremgangsmåde til Præoperativ Diagnose af T4-Stage Gastric Cancer