PLOS ONE: Wnt /β-catenin Signa Förbättrar cyklooxygenas-2 (COX-2) transkriptionsaktiviteten i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Bakgrund

Ökad expression av cyklooxigenas-2 enzym (COX2) är en av de viktigaste egenskaperna för magcancer (GC), som är en ledande dödsorsaken i världen, särskilt i Asien och Sydamerika. Även om Wnt /β-catenin signalväg har varit involverad i transkriptionell aktivering av COX-2-genen, är fortfarande okänd den exakta mekanismen modulera detta svar.

Metodik /viktigaste resultaten

Här har vi studerat transkriptions regleringen av COX-2-genen i GC cellinjer och bedömde huruvida detta fenomen moduleras av Wnt /β-catenin signalering. Vi undersökte först uttrycket av COX2 mRNA i GC-celler och funnit att det finns en differentialuttrycksmönster i överensstämmelse med höga halter av kärn lokaliserad β-catenin. Farmakologisk behandling med antingen litium eller valproinsyra och molekylär induktion med renat kanoniska Wnt3a avsevärt förbättrad COX2 mRNA-uttryck på ett dos- och tidsberoende sätt. Serial radering av en 1,6 Kbp COX2 promotorfragmentet och GAIN- eller förlust av funktions experiment tillät oss att identifiera en minimal Wnt /β-catenin svarar region bestående av 0,8 Kbp av COX-2-promotorn (pCOX2-0.8), som visade maximal respons i gen-reporter analyser. Aktiviteten hos detta pCOX2-0.8 promotorregionen bekräftades ytterligare genom riktad mutagenes och DNA-proteinbindningsanalyser.

Slutsatser /Betydelse

Vi har kommit fram till att pCOX2-0.8 minimala promotorn innehåller en nya funktionella T-cellfaktor /lymfatisk förstärkare faktor (TCF /LEF) och respons element (TBE Site II, -689 /-684) som svarar direkt till förbättrad Wnt /β-catenin signalering och som kan vara viktiga för uppkomsten /progression GC

Citation. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-catenin Signa Förbättrar cyklooxygenas-2 (COX-2) transkriptionsaktiviteten i Gastric cancerceller. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562

Redaktör: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Mottagna: 5 november 2010. Accepteras: 11 mars 2011. Publicerad: 6 april 2011

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av CTI-cancer, Prog Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) licensnummer PBCT-6 från den chilenska regeringen (MM och GVD). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

gastric cancer (GC) är en multifaktoriell sjukdom, som kännetecknas av mycket elakartade tumörer i magslemhinnan, och representerar den andra ledande orsaken av cancerdöd i världen med den högsta förekomsten i Asien och Sydamerika [1], [ ,,,0],2], [3]. Miljö associerade riskfaktorer inkluderar kost, snus konsumtion, övervikt och Helicobacter pylori
infektion [4]. Flera mutationer i tumörsuppressorgener, inklusive P53, adenomatös polypos coli (APC), E-cadherin och RUNX3 [3], [5], liksom i onkogener som k-ras, HER2 och β-catenin [3], [6], [7], har dokumenterats i GC. Dessutom, under uttryck av olika gener har dokumenterats, inklusive WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], och cyklooxygenas 2 (COX-2) enzym, som katalyserar avgörande steg i produktionen av prostaglandin E2, en viktig medlare av ledinflammation [10], [11].

det har observerats att uttrycket av COX-2-genen ökar signifikant i humana magsäcks vävnader, jämfört med parade magslemhinnan exemplar saknar av cancerceller [10 ]. Sådan ökad expression har föreslagits att påverka intensiteten av invasion, storlek, lymfkörtelmetastaser, tumörutveckling och dålig prognos [4], [12], [13]. I detta avseende, stora mängder data beskriver kemo-preventiv och anticanceraktivitet av icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), inklusive selektiva COX-2-hämmare som potentiella behandlingar för GC [10], [11], [14].

transkriptionskontroll av COX-2-genen beror på molekylära maskineriet interagerar med COX2 promotorn, som verkar styras genom aktiviteten hos olika signalvägar [15], [16], [17]. I själva verket var det först konstateras att CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) och NF-kB (-233 /-214) konsensussekvenser i COX2 promotorn var nödvändiga för uttryckningen av genen [16]. Senare funktionella studier i COX2 promotorn identifieras ett antal regulatoriska element som deltar i transkriptionen av genen, inklusive AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPp [18], [19], [20] och proteiner tillhör T-cellfaktor /lymfoid förstärkare faktor (TCF /LEF) familj av transkriptionsfaktorer, som är avgörande för Wnt /β-catenin signaltransduktion [21].

Wnt /β-catenin signalväg är allmänt erkänt som spelar en viktig roll i mänskliga sjukdomar, särskilt i början och utveckling av cancer [22], [23], [24]. Intressant nog har de senaste experiment i GC härledda celler visat ett samband mellan COX2 uttryck och hämning av glykogensyntaskinas-3β (GSK3P) enzym [25], som är en viktig Wnt komponent som fosforylerar β-catenin och främjar dess efterföljande nedbrytning via proteasom [26]. Förhållandet mellan Wnt /β-catenin och COX2 uttryck i olika cancercellmodeller stöds vidare från följande studier. För det första har det observerats i bröst epitel som Wnt /β-catenin spela en indirekt effekt på COX2 transkription, som kan förmedlas av uppreglering av en mellanhand faktor PEA3 [27]. För det andra, och i motsats till en indirekt verkningssätt, Araki och cols. [21] rapporterade att i koloncancerceller finns en induktion i COX2 uttryck genom en β-catenin /TCF beroende mekanism, och delvis kännetecknas en konsensus TCF /LEF bindningsställe (TBE: core CTTTG) placerade 1079 bp uppströms från transkriptionsstart plats i COX2 promotorn. Tredje, observerades det att hos patienter koloncancer och härledda cellinjer det finns ett samband mellan överuttryck av Wnt pathway associerade proteiner LEF-1 och Pontin52 /TIP49a och uppreglering av COX2 expression [28]. Slutligen, med hjälp av kondrocyter, har det demonstrerats att LEF-1, tillsammans med β-catenin, regleras COX2 expression genom direkt bindning av LEF-1 /β-catenin-komplexet till 3'UTR regionen av COX2 genomiska lokus [29] . Därför närvarande finns det inte en klar bild av om Wnt-signalering är involverad i COX2 genuttryck, eller dess roll i GC debut /progression. Här har vi försökt att förstå om det finns en direkt reglering av COX2 genexpression via Wnt /β-catenin-signalering och att identifiera Wnt /β-catenin regulatoriska element i promotorregionen av COX2-genen som kan uppreglera COX2 transkription i GC-celler.

Material och metoder

Celler och odlingsbetingelser

Human cellinjer MKN45 (japansk Insamling av forsknings bioresurser, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 och HEK293 (American Type Culture CoUection, Rockville, MD) användes i denna studie. MKN45, N87, SNU1 och KATOIII celler odlades i RMPI-medium (Gibco); AGS i F12K medium (Hyclone); WI38 i EMEM (Gibco); och HEK293 i DMEM (Gibco). Odlingsmedia kompletterades med 10% FBS (Gibco) (AGS med 20%) och 1% penicillin /streptomycin. Cellinjer upprätthölls vid 37 ° C i 5% CO _{2 och mättad fuktighet.}

Plasmider och ställesriktad mutagenes

SuperTOPFlash-luciferas och pRL-TK renilla- luciferas plasmider [30], den konstitutiva aktiva β-catenin (S33Y) [31] och de dominerande negativa ΔTCF4 expressionsplasmider [32] har beskrivits tidigare. Chimära COX2 promotor-luciferas-fragment genererades genom PCR från humant genomiskt DNA med användning av specifika primrar innehållande restriktionsställen och därefter sätts in i pGL3-Basic vektor (Promega). Mutationerna i TBE-Il-stället (-689 /-684) av COX2-promotorn genererades med användning av primrar pCOX-0,8-TBEMUT med Quickchange ställesriktad mutagesis kit (Stratagene). Konstruktioner verifieras genom direkt sekvensering (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Primers sekvenser beskrivs i tabell S1.

semikvantitativa och Realtid RT-PCR

Totalt RNA extraherades i RNas fritt förhållanden med användning av TRIZOL (Invitrogen) och 2 | j, g av RNA transkriberades omvänt med 200 U av Superscript II omvänt transkriptas (RT) (Invitrogen) med användning av 500 ng av oligo (dT) primrar. Experimentell bestämning av COX2, c-myc och CCND1-mRNA-nivåer utfördes enligt [33]. I korthet var cDNA utsattes för realtids-PCR i en iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories). Varje 25 | il reaktionsvolym innehöll en enhet av Platinum Taq DNA-polymeras (Invitrogen), 1X reaktionsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8,4, och 50 mM KCl), 1,5 mM MgCb _{2, 2,5 ^ g BSA, 0,01% glycerol , 200 ^ M dNTP, 0.3x SYBR Green-lösning och 0,4 | iM av specifika primrar (se tabell S1). PCR-betingelser var följande: 90 sekunder vid 94 ° C och därefter 30 cykler av 30 sekunder vid 94 ° C, 30 sekunder vid 62 ° C och 30 sekunder vid 72 ° C. Alla reaktioner utfördes i triplikat och resultaten som erhölls för varje gen normaliserades till de som erhållits parallellt med β-aktin. Kvaliteten på RNA och PCR-produkter övervakades under hela experimenten via elektrofores på 1% agarosgeler, färgades med etidiumbromid.}

Induktion av den Wnt /β-catenin signalväg

Wnt-signalering var farmakologiskt induceras i MKN45-celler sådda i 6 brunns odlingsplattor vid 80 till 90% av sammanflöde (dvs. 1, 2, 4 och 8 h inkubering) antingen med 10-20 mM LiCl (Sigma) eller 5-10 mM av valproinsyra (VA; Sigma) såsom beskrivits tidigare [34], [35]. Därefter uppsamlades celler för mRNA-extraktion och realtid-PCR bestämning såsom beskrivits ovan. På liknande sätt, var MKN45-celler stimulerades i 2 timmar med 200 och 400 ng /ml av renat Wnt3a protein. Rening av Wnt3a utfördes såsom beskrivits [36].

Transkriptionell aktivitet av COX2 promotorn

Aktivitet hos COX2 promotorn mättes i 80-90% konfluenta MKN45, AGS, WI38 och HEK293 celler såddes i 6 väl odlingsplattor. I korthet samtransfekterades med användning av Fugene (Roche) för 24 med pCOX2-luciferas eller de pSuperTOPFlash reportrar och antingen konstitutiv aktiv β-catenin (S33Y) [31] eller dominant-negativa ΔTCF4 [32] konstrukt celler. PRL-TK Renilla luciferas plasmid användes som en intern kontroll. Firefly och Renilla luciferas aktiviteter bestämdes med användning av Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) i en Victor-3 multiplate läsare instrument (Perkin Elmer), såsom beskrivits tidigare [30]. Relativa luciferas aktiviteter uttrycktes genom att dividera firefly luciferasaktiviteten med Renilla luciferasaktivitet för varje prov (N = 3, var och en i tre exemplar).

kromatin immunoprecipitation (chip) analyser

CHIP studier utfördes i MKN45-celler såsom beskrivits tidigare [37]. Fraktionen av kärn β-catenin bunden antingen till TBE webbplatser I, II, III eller IV i den humana COX2 promotorn immunutfälldes med anti β-catenin antikroppar (Santa Cruz) och bedöms av realtid-PCR med användning av specifika primrar (Tabell S1) . Dessutom, den del av RNA-polymeras II (Pol-II) och acetylerade histoner H3 och H4 (H3ac och H4ac) bunden antingen till TBE-II-regionen (-793 /-594) eller det proximala området (-118 /+ 62 ) av COX-2-promotorn liknande bedömning (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac och H4ac, Upstate). Som en positiv kontroll använde vi c-myc-TBE webbplatsen [38]. Antikroppsspecificitet analyserades med normalt kanin-IgG (Santa Cruz).

Elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA) Review

EMSA genomfördes med användning av oligonukleotider innehållande antingen vildtyp COX2 TBE-II konsensussekvens (se tabell S1) eller tidigare rapporterade muterade TBE-sekvenser [39]. I korthet, vildtyp och muterade ^{32P-märkta oligonukleotider inkuberades i bindningsbuffert med nukleära extrakt av MKN-45-celler under 30 min vid 30 ° C. Därefter tillsattes DNA-proteinkomplex separerades från fria oligonukleotider på en 5% icke denaturerande polyakrylamidgel. Efter elektrofores torkades gelén och exponerades för film under en dag. Visualiseringen av radioaktiva banden analyserades genom autoradiografi. Bindande specificitet kontrollerades genom inkubering av DNA-protein-komplex i närvaro av ett överskott av icke-märkt vildtyp eller muterade oligonukleotider [21], [39].}

Statistisk analys

Varje experiment upprepades åtminstone tre gånger med tre replikat. Data visas som medelvärdet ± SD. Flera gruppjämförelser utfördes genom en envägs ANOVA med användning av STATISTICA 9,0 programvara. P Hotel <. 0,05 ansågs signifikant

Resultat

COX2 uttryck korrelerar med kärn β-catenin nivåer i GC-celler

Vi bestämde från början uttrycket nivåer COX2 mRNA i human GC cellinjer MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII och AGS [40], [41], [42], liksom WI38 fibroblaster används här som en kontroll cellinje [43], att undersöka om de var korrelerade med Wnt /β-catenin signalering. Såsom visas i figur 1, var starka nivåer av COX2 expression observerades så tidigt som 26 cykler av PCR-amplifiering i metastatiska cellinjer MKN45, SNU16 och KATOIII, och även i AGS-cellinje som är härledd från en primär tumör. Detta resultat är i överensstämmelse med COX2 uttrycksnivåer detekterade tidigare i MKN45, KATOIII och AGS-celler [44], [45], [46]. Däremot COX2 mRNA-nivåer var antingen mycket låg WI38 fibroblaster eller odetekterbara i N87 och SNU1 celler (Figur 1A), vilket tyder på att denna skillnad uttrycksmönster inte är relaterad till metastatiska stadier eller graden av celltransformation. Anmärkningsvärt var kärn β-catenin nivåer närbesläktade med COX2 uttryck, eftersom höga halter av proteinet observerades i MKN45, AGS, SNU16 och KATOIII celler, jämfört med N87, SNU1 och WI38-celler (Figur 1B), vilket innebär en roll för Wnt signalering i COX2 mRNA-uttryck i GC-celler.

Förbättring av COX2 uttryck via Wnt /β-catenin signalering

för att undersöka om Wnt kaskaden är involverad i COX2 uttryck MKN45 celler farmakologiskt stimuleras för olika tidsperioder (dvs. 1, 2, 4 och 8 h) med antingen litium (LiCl) eller valproinsyra (VA), eftersom båda läkemedlen har tidigare visat att modulera Wnt-signalering via hämning av GSK3P-aktivitet och därmed öka kärn nivåer av β-catenin [34], [35]. Intressant, observerade vi en markant förbättring av COX2 uttryck induceras med 10-20 mM LiCl eller 5-10 mM VA, som började strax efter inkubation med föreningarna och som nådde en topp efter två timmars behandling (Figur 2A). Realtids bestämning av COX2 mRNA-nivåer i MKN45 celler behandlats på liknande sätt med LiCl eller VA (2 h) indikerade att COX2 var betydligt uppreglerad (figur 2B) och att denna effekt parallellt med den som observerats på Wnt /β-catenin målgener c-myc [47] och cyklin D1 [48]. Nästa, i syfte att utesluta möjligheten att den observerade fenomenet reflekterade ospecifika effekter av läkemedel som verkar på proteiner som påverkar olika signaleringskaskader, tillämpade vi direkt en fullt fungerande renat Wnt3a protein till MKN45 celler (se Metoder). Dessa experiment visade tydligt att 200-400 ng /ml renad Wnt3a avsevärt förbättrad COX2 mRNA-expression efter korta perioder av inkubation (figur 2), delvis förklara den snabba effekten av LiCl och VA och stödja en direkt korrelation mellan kanoniska Wnt /β-catenin aktivering och stimulering av COX-2-transkription i GC-celler.

Identifiering av nya TBE platser i promotorn av COX-2-genen

Tidigare studier visade att en Wnt /β-catenin svarar TBE webbplats ( konsensus kärna~~POS=HEADCOMP: CTTTG) är belägen vid -1079 /-1074 bp uppströms från transkriptionsstartstället (TSS) av den humana COX2-genen [21] (site IV, fig 3A, se även figur S1). Ytterligare scanning av 1600 bp uppströms sekvens från TSS [49] tillät oss att identifiera 3 nya förmodade TBE platser: -877 /-872 bp (Site III, riktning), -689 /-684 bp och -318 /-313 bp (platser II och jag, respektive, båda i antisense-orientering) (Figur 3A), som inte är konserverade mellan de humana och murina COX-2-gener (figur S1). Vi klonade därför 1600 bp-segment från det humana COX2 promotorn (pCOX2), inklusive alla fyra TBE ställen, in i pGL3-basvektor fuserad till luciferasgenen som skall användas senare i reporteranalyser (Figur 3A). Anmärkningsvärt, parallellt transfektion av 10 ng av denna konstruktion i MKN-45 och HEK293-celler avslöjade att pCOX2 visade en signifikant högre (9 gånger) basala promotoraktivitet i MKN45 celler (figur 3B och C). Vi antog att denna högre pCOX2 basal promotoraktivitet kan vara relaterat till den förhöjda halten av kärn β-catenin i denna GC-cellinje (Figur 1B). Därför MKN45 och HEK293-celler samtransfekterades med pCOX2 i närvaro av lägre doser av en konstitutiv aktiv β-catenin protein (S33Y) [31]. Som observerats i figur 3, pCOX2 aktivitet faktiskt förbättras i båda celltyperna, vilket tyder på att β-catenin kan binda och sedan aktivera TCF /LEF transkriptionsfaktorer vid de funktionella TBE platser inom pCOX2 promotorn.

bidrag TBE platser till COX2 promotoraktivitet i GC-celler

för att dissekera bidrag Wnt /β-catenin responsiva TBE platser på den transkriptionella aktiviteten av COX-2-promotorn fyra pCOX2 strykningar konstruktioner genererades: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); och pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (Figur 4A). Dessa konstruktioner därefter analyseras med avseende på sin aktivitet genom transienta transfektioner i MKN45 och AGS-celler med hjälp av WI38 fibroblaster som en kontroll-cellinje. Överensstämmer med de endogena COX2 expressionsnivåerna i dessa GC-cellinjer (Figur 1A), pCOX2 deletioner behöll olika nivåer av aktivitet i MKN45 och AGS-celler (figur 4B och C). Däremot var ingen promotoraktivitet detekteras i WI38-fibroblaster (fig 4D), även när de transfektion doser i dessa celler ökade 8-faldigt (dvs mellan 50 och 400 ng) (Figur S2). Viktigt, och i överensstämmelse med tidigare rapporter [50], WI38 celler uttryckte effektivt en luciferas-reporterkonstruktion som innehåller promotorn för p21-genen (Figur S2), vilket tyder på att i dessa kontrollceller molekylära maskineriet som ansvarar för att inducera COX-2-transkription är inte aktiv . Ytterligare experiment visade att transfektion i MKN45 och AGS celler med pCOX2-0.8 konstruktionen, som har 859 bp bort från 1,6 Kb pCOX2 reporter (Figur 4A), resulterade i en signifikant ökning i promotoraktivitet jämfört med pCOX2-1.2 reporter (Figur 4A-C). Eftersom inga signifikanta skillnader observerades mellan 1,6 Kb pCOX2 och pCOX2-1.2 konstruktioner (Figur S3), vi inte utföra ytterligare analyser med större konstruktion. Viktigare, pCOX2-0.8 representerade den minsta storleken promotorfragmentet som uppvisar det maximala basal aktivitet, eftersom ytterligare deletion av antingen 159 eller 370 bp från 5'-änden, som det är fallet med den pCOX2-0.65 eller pCOX2-0.4 konstruktioner, respektive , minskade mer än 2-faldigt nivåerna av pCOX2 basal aktivitet. Dessa resultat tyder på att regionen som ligger mellan 0,8 och 0,65 Kbp uppströms TSS av COX-2-genen, och som innefattar en ny TBE responselement (TBE Site II, -689 /-684), kan vara en viktig komponent under reglering av basnivån av COX2 genuttryck i GC-celler.

uppreglering av pCOX2-0.8 via Wnt /β-catenin signalering

Vi undersökte nästa effekten av Wnt /β-catenin signalering på romanen TBE Site II. Vi transfekterade MKN45-celler med pCOX2-0.8 reporterkonstruktion och samuttrycks den konstitutiva aktiva β-catenin S33Y protein observera att det fanns en signifikant (2-faldig) ökning av den transkriptionella aktiviteten av pCOX2-0.8. Denna β-catenin-medierad ökning var specifik eftersom pCOX2-0.4 konstruktet inte stimulerades i denna β-catenin överuttryck tillstånd (figur 5A och B). För att kontrollera för Wnt /β-catenin signalering i MKN45 celler använde vi Wnt /β-catenin svarar SuperTOPFLASH (STF) reporter bär 12 kopior av en TBE i tandem [32], som transfekterades ensam eller i närvaro av plasmiden kodning för mutanten β-catenin S33Y protein. Intressant, medan samexpression med den mutanta β-catenin S33Y proteinet i MKN45-celler kunde öka (1,9-faldig) av aktiviteten hos STF reporter, var höga nivåer av basal STF aktivitet detekterades i frånvaro av den mutanta β-catenin (figur 5C). Detta resultat är i överensstämmelse med våra tidigare fynd av höga halter av endogen kärn β-catenin i denna celltyp (se figur 1B), och bekräftar att denna nukleär faktor är funktionell. För att ytterligare bekräfta detta fynd, utförde vi identiska experiment i HEK293-celler och erhållna väsentligen liknande resultat även om i detta fall ett klart dos-responskurva erhölls då pCOX2-0.8 transfekterades i närvaro av ökande koncentrationer av den konstitutivt aktiva β-catenin S33Y protein (Figur S4). Dessutom fann vi att STF aktivitet i HEK293-celler var mycket mottaglig för nivåerna av det exogena mutant β-catenin (figur S4C).

För att ytterligare undersöka effekterna av Wnt /β-catenin vägen på aktiviteten av pCOX2-0.8 utförde vi förlust-of-funktion experiment med en dominant negativ TCF4 (ΔTCF) konstruera, som kodar för en transkriptionsfaktor som saknar 30 rester från dess amino-terminus och som inte kan binda β-catenin [32] . Vi fann att i MKN45 celler ΔTCF uttryck minskat de höga nivåerna av pCOX2-0.8 basal transkription i en dosberoende sätt (figur 5D). Detta resultat bekräftar den nyckelroll som TCF /LEF transkriptionsfaktorer bland tillsynsmyndigheterna i aktiviteten hos pCOX2-0.8 promotorsekvensen och ytterligare stöder tanken att TBE Site II (-689 /-684) är involverad i svaret på Wnt /β-catenin signalering.

Slutligen, för att direkt ta itu med den roll som TBE site II i Wnt /β-catenin-förmedlad reglering av COX2-promotorn, vi infört genom ställesriktad mutagenes en förändring i två nyckel nukleotider i konsensussekvensen av TBE Site II kärna (dvs. pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Dessa förändringar har visat tidigare att avskaffa Wnt /β-catenin-medierad transkription [39]. Transienta transfektionsstudier avslöjade att mutation av TBE Site II minskade betydligt (2-3 faldigt) den basala aktiviteten av pCOX2-0.8 konstrukt i MKN45-celler (Figur 5E) jämfört med vildtyp pCOX2-0.8 promotorkonstruktionen. Dessutom och i samförstånd med våra tidigare resultat, mutation av denna TBE ställe II nästan helt blockerade β-catenin-medierad förstärkning av pCOX2-0.8 konstruktionen (Figur S4). Sammantaget indikerar dessa resultat att den TBE Site II (-689 /-684) är en funktionell komponent i COX2-genen transkriptionsreglering.

β-catenin binder till COX2 genpromotorregionen innehållande TBE Site II

Eftersom en transkriptionellt aktiv konformation av kromatinstrukturen reflekteras av en förhöjd nivå av histonacetylering [51], och de utfällda vi tvärbundna kromatin fragment (medelstorlek 300 till 500 bp) som isolerats från MKN45-celler med användning av polyklonala antikroppar som är specifika för acetylerade histoner H3 och H4. På samma sätt upptäckte vi bindning av RNA-polymeras II (Pol II) som en parameter som normalt förknippas med transkriptionsaktivitet. Vi undersökte anrikningen i våra utfällningar av två promotorsekvenser: den proximala promotorn (PP) region (-118 /+ 62 från TSS) och den distala regionen (-793 /-594) av COX-2-promotorn innehåller konsensus TBE Site II ( -689 /-684). Framför allt var TBE Site II riktade sedan tidigare experiment indikerade företrädesrätt bindning av β-catenin till denna promotorregion (Figur S5). Som en positiv kontroll, utvärderade vi bindning vid TBE-stället i promotom av c-myc-genen (-1447 /-1144 från TSS), som tidigare beskrivits i koloncancerceller [38].

Acetylerad histoner H3 och H4 och enzymet polymeras II befanns binda inom den proximala promotorregionen (Figur 6A), vilket indikerar att kromatinstrukturen runt COX2 promotorn i MKN45-celler är i en öppen konformation, vilket således i överensstämmelse med våra tidigare resultat som visar att den COX-2-genen är aktivt transkribera. Noterbart var β-catenin protein immunoutfälldes från MKN45 prover till största delen i association med promotorregionen som spänner över -684 /-689 TBE-sekvensen i COX2-genen (Figur 6B). Denna faktor var nästan omöjlig att upptäcka vid den proximala promotorregionen, vilket indikerar att endogena kärn β-catenin i första hand rekryteras till TBE Site II i dessa GC celler. Som väntat var endogena β-catenin liknande bunden till c-myc-promotor TBE plats, på nivåer som är jämförbara med de som observerats i COX2 genpromotorn (Figur 6C).

Tillsammans står dessa experiment visar att TBE Site II är direkt involverade i β-catenin-medierad transkriptionell aktivering av COX-2-promotorn. För att ytterligare bekräfta dessa resultat vi utfört elektromobilitetsförskjutningsanalyser (EMSA) i kärnextrakt av MKN45 celler. För detta ändamål beredd vi 34 baserade-parade oligonukleotider; varav den andra innehåller vildtyp -689 /-684 TBE Site II-sekvensen (dvs. CTACAAAGA; rester understrukna representerar kärnan), och två oligonukleotider innehållande missense-mutationer i antingen kärnan i TBE Site II (dvs. CTACGAGGA: TBE-MUT1) eller i den flankerande sekvensen (dvs. CGCCAAAGA: TBE-Mut2), som tidigare rapporterats [21], [39]. Såsom visas i fig 6D, den radiomärkta vildtyp TBE proben var kapabla att bilda retarderade DNA-proteinkomplex när de inkuberas med nukleära extrakt från MKN45-celler. Dessa protein-DNA-komplex var specifika eftersom tillsatsen av ett överskott av kalla oligonukleotider av vildtyp (50-faldiga) dramatiskt inhiberade bildningen av DNA-proteinkomplexet (figur 6D, spår 3 och 4, respektive). Den mutanta radiomärkt TBE-MUT1 proben var varken i stånd att bilda DNA-proteinkomplex på egen hand, och inte heller för att konkurrera med vildtyp-oligonukleotid när de tillsätts i överskott som en kall sond (Figur 6D, spår 5 och 6, respektive). Liknande resultat erhölls när andra kall TBE-Mut2 prob användes som en konkurrent (figur 6D, spår 7). Sammantaget visar dessa resultat att den nya TBE Site II i COX2 promotom är involverad i transkriptionell aktivering av COX2-genen genom att rekrytera de maskiner som ansvarar för transduktion av Wnt /β-catenin signalering (figur 6E).

Diskussion

Tidigare studier har antytt en roll för Wnt /β-catenin signalering under uppkomsten och /eller utveckling av olika typer av cancer via modulering av expression av COX2-genen [25]. I detta arbete har vi presenterat starka bevis som stöder en direkt roll för Wnt /β-catenin signalering i kontrollen av COX2 uttryck i GC-celler. För det första har vi visat att det finns en tät korrelation mellan COX2 uttryck och kärninnehåll av β-catenin, vilket verkar vara oberoende av antingen malignitet eller omvandling delstaten CG celler. För det andra, var tids- och dosberoende förstärkning av COX2 uttryck observeras strax efter induktion (2 h) med antingen farmakologiska föreningar som efterliknar Wnt /β-catenin signalering. Tredje, gene reporter analyser utvärderar COX2 promotoraktivitet som svar på GAIN- och förlust-av-funktion experiment, bland annat en konstitutivt aktiv β-catenin protein och dominant negativ TCF4 transkriptionsfaktor, demonstrerar att Wnt /β-catenin komponenter är involverade i transkriptionell reglering av COX-2-genen

Vi har också visat här att inom två Kbp uppströms om mänskliga COX2 promotorn finns fyra förmodade TBE platser. (kärna: CTTTG), en av som tidigare har studerats av Araki och cols [21], [28]. Genom gen reporter analyser med olika pCOX2 deletionskonstruktioner vi visade att pCOX2-0.8 uppvisade den högsta basala transkriptionsaktiviteten i GC-celler MKN45 och AGS. Intressant pCOX2-0.8 bibehöll TBE Site-II (-689 /-684) integritet som anger dess viktiga bidrag till regleringen av transkriptionsaktivitet av COX-2-genen. Noterbart är den kompletta pCOX2 TBE Site II signatur (dvs 5'-WWCAAAGS-3 '; S = C /G; W = A /T), liknar den optimala TCF beskrivna området från van de Wetering och cols. [52], som sedan användes för att identifiera äkta Wnt-transkriptions mål i Drosophila
gener NKD Köpa och CG6234
[53].

funktionaliteten i denna TBE Site II bekräftades också av våra mutagenesstudier. Så när vi muterade TBE-signatursekvensen i pCOX2-0.8 konstruktionen (MpCOX2-0.8), konstaterades det att basala COX2 promotoraktivitet var signifikant påverkas MKN45 celler. Dessutom våra marker och EMSA-analyser bekräftade att β-catenin är företrädesvis rekryteras till -689 /-684 COX2 promotorregionen i GC-celler, på en nivå som liknar den som finns i c-myc-promotor [38]. Sådan interaktion sker företrädesvis på denna region av COX2 genpromotorn eftersom ingen β-catenin är visat sig binda till den proximala promotorregionen av COX2-genen. Sammantaget indikerar dessa resultat att den TBE Site II är en funktionell Wnt /β-catenin mottagligt element i den mänskliga COX2 promotorn. Våra data, dock inte utesluter bidraget från andra genomregioner i den mänskliga COX2 genen [21]. I stället föreslår vi att i GC-celler en komplex väv av interaktioner föreligger där TBE Site II samarbetar med andra responselement till uppreglera COX2 uttryck.

Eftersom våra resultat i GC-celler är i överensstämmelse med de som rapporterats för koloncancerceller, är det frestande att spekulera i att Wnt /β-catenin signalering kan på samma sätt involverade i COX2 regleringen i andra tumörer [21], [28]. Faktum är måttliga till starka proteinnivåer av β-catenin kan observeras i ca. 72% av all cancer som analyseras i Human Atlas Protein vävnads databas [54]. På samma sätt, stark till måttlig cytoplasmisk COX2 färgning och enstaka membran reaktivitet observeras i 50% av alla cancerformer, inklusive kolorektal, prostata, livmoderhalscancer, endometrial, uroteliala, bukspottskörteln, levern och i körtelceller från gastric tumörvävnad.

• PLOS ONE: MicroRNA Låt-7F hämmar tumörinvasion och metastas genom att rikta MYH9 i Human Gastric Cancer
• PLOS ONE: Sonic Hedgehog Pathway är viktigt för underhåll av cancer Stem-liknande celler i Human Gastric Cancer