PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p Fungerar som en tumörsuppressor i Gastric Cancer och regleras av DNA Methylation

Abstrakt

Bakgrund och & Syftar

Gastric cancer är den mest frekventa gastrointestinal tumör hos vuxna och är den mest dödliga formen av human cancer. Trots förbättringarna i behandlingarna, är den underliggande mekanismen av gastric cancer inte känt. Att definiera nya modulatorer som reglerar känsligheten för tumorgenesis har vi fokuserat på Mir-219-2-3p.

Metoder

Kvantitativ RT-PCR användes för att undersöka graden av MIR-219-2 -3p i magcancer (GC) vävnader (n = 113) och deras anpassade närliggande normala vävnader (n = 113). In vitro celltillväxt, apoptos-analyser, cellmigration och invasionsanalyser utfördes för att belysa biologiska effekter av MIR-219-2-3p. Sedan tysta av miRNA av promotor CpG-ö-metylering kan vara en viktig mekanism i tumorgenesis, var GC-celler behandlades med 5-aza-2'-deoxicytidin och trichostatin A och uttryck förändringar i MIR-219-2-3p därefter granskas av kvantitativ RT-PCR. Slutligen metylering status CpG-ö uppströms MIR-219-2-3p analyseras genom metylering specifik PCR i GC vävnader (n = 22).

Resultat

MIR-219- 2-3p var ned-regleras i GC och cellinjer. Dessutom experimenten dokumenterade lägre uttryck av MIR-219-2-3p i GC-prover med högre kvalitet och senare tumörer stadium. Samtidigt MIR-219-2-3p utövade antiproliferativ, proapoptotisk och antimetastatiska roller och minskade nivåer av p-ERK1 /2 i GC-celler. Dessutom ökade 5-aza-2'-deoxicytidin och trichostatin A uttrycket (~ 2-faldigt) av MIR-219-2-3p i GC-celler. Genom metylering-specifik PCR, har DNA-metylering i uppströmsregionen av MIR-219-2-3p detekteras i både intilliggande normala vävnader och cancervävnader. Som väntat var betydligt högre i Mir-219-2-3p metylering nivån nedregleras grupp än uppreglerat grupp.

Slutsatser

MIR-219-2-3p är potentiellt involverade i magcancer progression och metastasering genom att reglera ERK1 /2-relaterade signalvägar, som kan ge en ny terapeutisk strategi för behandling av magsäckscancer. Metylering mekanism kan vara involverad i modulering av expressionsnivån av MIR-219-2-3p i magcancer

Citation. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B, et al . (2013) MicroRNA-219-2-3p Fungerar som en tumörsuppressor i Gastric Cancer och regleras av DNA-metylering. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369

Redaktör: Arun Rishi, Wayne State University, USA

Mottagna: 14 december 2012, Accepteras: 26 februari 2013, Publicerad: 23 april 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Natural Science Foundation i Kina [2012, 91.129.716, till JY] och Pekings kommunala Science & Teknik kommissionen [2010B071 till JY]. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är 4 ^{e vanligaste cancerformen och den näst högsta dödsorsaken i cancer i hela världen. Numera patienter med sent skede GC med en total 5-års överlevnad på cirka 20% [1]. Cancer utvecklas som ett resultat av en anhopning av olika endogena och exogena orsaker. Matvanor och en ökning av Helicobacter pyloriinfection är viktiga exogena orsaker till GC [2], medan genetiska, liksom kost, nivåer av hormonet gastrin [3], och andra kroniska gastriska inflammationsframkallande faktorer har visat sig vara associerade med anlag till cancerutveckling. Genförändringar spelar en viktig roll i GC, och förändringar i ett stort antal av onkogener och tumörsuppressorgener har redan rapporterats i GC.}

Vissa prognostiska tumör biomarkörer i GC såsom human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2 ), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), har förknippats med sjukdomskarakteristika och kan därför användas för att informera patienten. Till exempel kan patienter med tumörer som testar positivt för HER2 behandlas med trastuzumab plus kemoterapi [4], och patienter med tumörer som testar positivt med avseende på VEGF kan behandlas med bevacizumab plus kemoterapi [5]. Men de molekylära mekanismer som ligger bakom utvecklingen av GC förblir en utmaning, vilket dessutom informativa biomarkörer finns ett akut behov.

MicroRNAs (miRNA) är en klass av små RNA-molekyler som är involverade i regleringen av översättning och nedbrytning av mRNA [6 ]. MiRNA binda till komplementära sekvenser i den 3'-otranslaterade regioner (UTR) av deras mål-mRNA: n och inducera mRNA nedbrytning eller translationell repression [7]. Mest kända funktioner miRNA är relaterade till negativa genreglering: miRNAs tystnad genuttryck, vanligtvis genom att störa mRNA-stabilitet eller proteintranslation. Under senare år har miRNA tror att fungera som onkogen eller tumörsuppressorgen, och bidrar till cancer initiering och progression genom att reglera genuttryck [8]. Upptäckten av cancer specifika uppströms region hypermethylation av många miRNA har visat en epigenetisk mekanism för avvikande miRNA uttryck [9], [10].

I human och möss finns två genomisk lokus (MIR-219- 1 och miR-219-2) vilka kodar miR-219 föregångartranskript. MIR-219-1 är belägen på kromosom 6 (MI0000296) och mir-219-2 är belägen på kromosom 9 (MI0000740) [11] (Fig. 1A). Bearbetning av prekursor-transkript från dicer genererar tre mogna miRNA: miR-219-5p från 5'-ändarna av båda prekursorer, och MIR-219-1-3p och miR-219-2-3p från 3'-änden av pre- mIR-219-1 och pre-miR-219-2, respektive. Eftersom såddregionen av dessa tre mogna produkter är unik, är varje miRNA förutspått att reglera unika mål. Även MIR-219-5p är känt att nedregleras i flera cancer, såsom malignt astrocytom [12] och hepatocellulär cancer [13], har inte ett uttryck för MIR-219-1-3p och MIR-219-2-3p studerats. Intressant är miR-199B och miR-219-2-3p gener lokaliseras på närhet till ett segment av kromosom 9q34.11 (Fig. 1A). En tidigare studie visat att MIR-199B-5p var nedregleras i medulloblastom genom metylering av en CpG-ö 3 kb uppströms om 5'-platsen för MIR-199B-5p promotor [14]. Eftersom DNA-metylering kan påverka stora delar av kromatin och reglerar transkriptionen av avlägsna gener, är det nödvändigt att undersöka huruvida MIR-219-2-3p nedregleras och regleras genom metylering som MIR-199B-5p i cancer. I denna studie fann vi att miR-219-2-3p var nedreglerade i GC vävnader och associerade med progressiva fenotyper av GC. Dessutom återintroduktion av MIR-219-2-3p reducerade livskraft GC-celler och inducerade cell apoptos, vilket tyder på att MIR-219-2-3p var en kandidat tumörsuppressorgen i GC. Ytterligare metylering analys av MIR-219-2-3p promotor indikerade att dess uttryck regleras genom metylering av korrelerade CpG-öar i viss utsträckning. Slutligen fann vi att MIR-219-2-3p fungerade som en tumörsuppressor genom att hämma aktiviteten hos ERK1 /2 signalväg i GC-celler.

Resultat

MIR-219-2- 3p var differentiellt uttryckta i GC och GC-cellinjer

för att bedöma uttrycket av mIR-219-2-3p i GC var TaqMan RT-PCR-analys genomfördes i 113 par av GC vävnader och matchas intilliggande normala vävnadsprover . Jämfört med normala vävnadsprover, mer än hälften av de primära tumörer uppvisade låga nivåer av MIR-219-2-3p (58%, 65 av 113, fig. 1B). Dessutom var fyra patienter vars uttryck av MIR-219-2-3p betydande nedregleras valdes (Fig. 1D). Mir-219-2-3p uttryck i dessa patienter och fyra GC cellinjer (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) analyserades för att avslöja att MIR-219-2-3p också var ned- regleras i GC-celler (Fig. 1E). Dessa resultat tyder på att nedregleras MIR-219-2-3p var en frekvent händelse i mänsklig GC och kan vara inblandade i gastric cancer. På grund av den universella nedreglering av MIR-219-2-3p i testade GC cellinjer, MGC-803 och HGC-27 var slumpvis utvalda för vidare studier.

Förhållandet mellan kliniskt patologiska faktorer och MIR-219- 2-3p uttryck i GC

Denna studie inkluderade 113 GC patienter. För att utvärdera korrelationen mellan MIR-219-2-3p uttryck och kliniskt patologiska egenskaper patienterna delas in i grupper med nedreglering och uppreglering. Såsom visas i tabell 1 och fig.1C ades en statistiskt signifikant association observerades mellan uttrycket av MIR-219-2-3p och GC kliniska stadiet. De patienter med lägre nivåer av MIR-219-2-3p uttryck verkade vara associerade med hög kvalitet och slutskedet tumörer (p = 0,047, oberoende-prover t-test). Dessa data tyder på att förändringar av MIR-219-2-3p kan involveras i GC progression.

Uttryck av MIR-219-2-3p i GC-celler hämmar celltillväxt och cellöverlevnad

den anmärkningsvärda minskningen av mIR-219-2-3p uttryck i GC prover främjas oss att utforska möjliga biologiska betydelsen av mIR-219-2-3p i tumorgenesis. Med tanke på att MIR-219-2-3p spelat en roll i regleringen av celltillväxt [15], var MGC-803 och HGC-27-celler transfekterade med MIR-219-2-3p och scramble härmar och analyserades för celltillväxt, cell apoptos och cellcykelprogression respektive. Först av allt, var RT-PCR används för att mäta graden av MIR-219-2-3p efter överuttryck experiment. Vi fann att MIR-219-2-3p ökade med mer än 100 veck i miRNA transfekterade MGC-803 och HGC-27-celler (fig 2a). Dessutom CCK-8 tillväxtanalys visat att celltillväxthastigheten sänktes i MIR-219-2-3p härmar-transfekterade MGC-803 och HGC-27 celler jämfört med scramble-transfekterade celler eller obehandlade celler (Fig. 2B). Efter transfektion, hämningsförhållandet var 26% (48 h) och 28% (96 h) i MGC-803 celler och 13% (72 h) och 14% (96 h) i HGC-27 celler. Dessa resultat tyder på att MIR-219-2-3p verkligen var inblandad i den negativa regleringen av celltillväxt. Det fanns dock ingen signifikant effekt på cellcykelstopp i MIR-219-2-3p behandlade GC-celler (Fig. S1). För att ta itu om uppreglering av MIR-219-2-3p skulle framkalla GC cell apoptos och celldöd, antalet tidiga apoptotiska MGC-803 och HGC-27-celler efter behandling med MIR-219-2-3p härmar undersöktes. Som väntat, några tidiga apoptotiska celler (10% i MGC-803 eller 2,9% i HGC-27) konstaterades i scramble-behandlade celler, medan MIR-219-2-3p härmar behandling ökade andelen tidiga apoptotiska celler (17,5 % i MGC-803 eller 8,3 i HGC-27) såsom bedömdes genom Annexin V färgning (Fig. 2C). Därför drog vi slutsatsen att MIR-219-2-3p kan påverka cellöverlevnad i GC-celler.

Uttryck av MIR-219-2-3p i GC-celler hämmar cellmigration och invasion

För att ytterligare upptäcka om mIR-219-2-3p är förknippad med utvecklingen av GC, sårläkning och transwell analys utfördes för att analysera effekten av mIR-219-2-3p uttryck på migrations och invasiva beteende MGC-803 och HGC- 27 celler. Vi fann att införandet av MIR-219-2-3p i MGC-803 och HGC-27-celler resulterade i en signifikant minskning av cellmigration under stängningen av en konstgjord sår som skapats under en sammanhängande monoskikt (Fig. 3A). Dessa celler upprätthölls i serumfritt medium under loppet av sårläkning för att säkerställa att varje förstärkt flyttningsbeteendet inte skulle kunna påverkas av förändrad cellproliferation. Dessutom, restaurering av MIR-219-2-3p dramatiskt hämmade normalt starka invasiv kapacitet MGC-803 och HGC-27 celler, som bar låg endogen nivå av MIR-219-2-3p (Fig. 3B). Dessa resultat indikerade att MIR-219-2-3p uttryck bidrar till regleringen av GC cellrörlighet och progression in vitro.

MIR-219-2-3p uttryck är epigenetiskt reglerad

Baserat på ovanstående resultat drar vi slutsatsen att mIR-219-2-3p var en viktig regulator i GC. Men de reglerande mekanismerna för MIR-219-2-3p uttryck var fortfarande okänd. Eftersom många miRNA identifierades som mål för metylering reglering, såsom MIR-9, MIR-34b /c och MIR-148a i metastatiska karcinom [16], och MIR-137 och MIR-193a i oral cancer [17], MIR 193B och mIR-145 i prostatacancer [18], [19], bestämde vi att analysera regleringsmekanism av miR-219-2-3p uttryck från sitt genom metylering. Efter att ha analyserat den genomregion som spänner över Mir-219-2-3p genen, identifierade vi en stor CpG-ö (Fig. 4A). För att undersöka om miR-219-2-3p ades epigenetiskt reglerade i GC, MGC-803, HGC-27-celler behandlades med demethyltransferase hämmare, 5-aza-2'-deoxicytidin (5-aza-CdR) och histon-deacetylas hämmare trichostatin A (TSA). Då uttrycket av MIR-219-2-3p genom RT-PCR analyserades (Fig. 4B). Resultaten visade att uttrycket av MIR-219-2-3p var uppreglerat i två situationer: för 5-Aza-CdR behandling, var ett uttryck för MIR-219-2-3p uppreglerat i MGC-803 ( 5-aza-CdR 1,5 | imol /l; 2,14-faldig) och HGC-27 (5-aza-CdR 0,5 | imol /l; 3,07-faldigt) i jämförelse med DMSO behandlade kontrollgruppen; för 5-Aza-CdR och TSA kombinationsbehandling, ett uttryck för MIR-219-2-3p var mycket högre i MGC-803 (5-Aza-CdR 1,5 mikromol /L, 1,98 gånger) och HGC-27 (5 -Aza-CdR 1,5 mikromol /L, 1,28-faldig) jämfört med TSA kontrollgruppen. Dessa resultat indikerade att epigenetiska faktorer kan påverka MIR-219-2-3p uttryck i GC. Samverkan mellan demetylering och histondeacetylas hämning ledde till återuttryck av MIR-219-2-3p i GC. För att ytterligare upptäcka om MIR-219-2-3p associerades med metylering av GC, undersökte vi metylering status Mir-219-2-3p uppströms regionen med hjälp av metylering-specifik PCR (MSP, Fig. 4C). 22 par av vävnader (primära tumörer och deras matchade intilliggande normala vävnader) i 113 par valdes, inklusive 11 patienter som besatt lägre MIR-219-2-3p nivåer (nedreglering grupp) och 11 patienter som hade högre MIR-219 -2-3p nivåer (uppreglering grupp). Vi fann att DNA-metylering i uppströms regionerna MIR-219-2-3p fanns i både närliggande normala vävnader och cancervävnader. Emellertid hypermetylering förhållandet mellan uppströmsregionen av MIR-219-2-3p genen i nedreglering gruppen var 63,6% (7 av 11), vilket var högre än det uppreglering gruppen (36,3%, 4 av de 11 ). Dessa resultat tyder på att metylering nivå uppströms CpG regionen MIR-219-2-3p var högre i Mir-219-2-3p nedregleras gruppen än i uppreglerade ett.

Uttryck av mIR-219-2-3p dämpar ERK1 /2 signalväg

Aktivering av ERK1 /2 vägen var väl dokumenterade i olika tumörtyper, såsom GC [20], pankreascancer [21] och bröstcancer [ ,,,0],22]. Tidigare studier har visat hur viktigt det är ERK1 /2 signalväg i regleringen av migration, invasion och metastas av cancercellinjer [23]. För att undersöka huruvida MIR-219-2-3p påverkar cellaktiviteter genom ERK1 /2 vägen, var fosforylering nivån ERK1 /2 i MGC-803 och HGC-27 celler undersöktes efter MIR-219-2-3p uttryck. Cellulära nivåerna av p-ERK1 /2 minskat betydligt i MIR-219-2-3p härmar-transfekterade celler jämfört med scramble-transfekterade eller obehandlade celler. Dock ingen uppenbar skillnad observerades i totalt ERK1 /2 nivå (Fig. 5A). Dessa fynd tyder på att den accelererade GC celltillväxt kan vara delvis på grund av aktiverade ERK1 /2 vägar.

bioinformatik metod för att söka efter potentiella mål för MIR-219-2-3p

miRNA modulera gen uttryck genom att interagera med sina mål mRNA resulterar i mRNA nedbrytning eller translationella repression. För att ytterligare undersöka mekanismen för MIR-219-2-3p i GC, vi bioinformatically (TargetScan Release 5.2 och miRDB) och funktionellt inblandad MIR-219-2-3p i GC, och fann de gener som omfattas av MIR-219-2- 3p (Tabell S2). Bland de 371 förväntade målen för MIR-219-2-3p, 31 av dem visade stor potential, eftersom de förutsågs av båda programmen, medan andra endast förutspåtts av ett av programmen. Av dessa 31 gener, erbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 var SOX4 befunnits vara onkogen eller apoptosrelaterade gener genom tidigare publicerade artiklar. (Fig. 5B och 5C).

Diskussion

Under de senaste åren, ackumulerade bevis har lett onkologer att spekulera i att unrevealed molekylära faktorer, i synnerhet icke-kodande RNA som tidigare klassificerats som "skräp" play viktiga roller i tumörgenes och tumörprogression. Beroende på deras mRNA-mål, kan miRNA fungera som tumörsuppressorer eller främjare av onkogenes. De mekanismer som oreglerad miRNAs har inte studerats ingående, inklusive avvikande miRNA biogenes och transkription [24], [25], epigenetisk förändring [26], [27], och förstärkning eller förlust av genomiska regioner som kodar miRNAs [28] .

som framgår av denna rapport analyserade vi uttrycket av mIR-219-2-3p 113 GC patienter och fann att nivåerna verkar vara lägre i GC. Även MIR-219-2-3p har rapporterats vara nära besläktad med diabetesretinopati [29], oligodendrocyter [15], förblir alzheimers sjukdom [30] och glioblastom [12] sin funktion i GC som skall fastställas. Dessutom är vi visat att re-expression av MIR-219-2-3p i GC-celler resulterade i induktion av cellapoptos och reducerad cellviabilitet. Dessa resultat tillät oss att spekulera i att nedreglering av MIR-219-2-3p kan ge en överlevnadsfördel för GC-celler. Men nedreglering i GC är fortfarande okänd mekanism som ansvarar för MIR-219-2-3p. Eftersom förlusten på 9q34.11, där MIR-219-2-3p ligger sällan upptäcks i GC [31], är det osannolikt att allel förlust är ansvarig för dess nedreglering. Å andra sidan, fann vi att MIR-219-2-3p var markant uppregleras när GC-celler, MGC-803 och HGC-27, behandlades med både 5-Aza-CdR och TSA. Dessutom visar beräknings analys att MIR-219-2-3p ligger i en CpG-ö på kromosom 9q34.11. Därför verkar det möjligt att DNA-metylering och histon deacetylering kan associeras med MIR-219-2-3p reglering. Av MSP prover metylering frekvenser detekteras i uppströmsregionen av MIR-219-2-3p var högre i Mir-219-2-3p ner reglerad gruppen än i uppreglerade grupp. Denna specificitet möblerade hypotesen om en relation mellan MIR-219-2-3p uttryck och DNA-metylering. Sammantaget föreslog resultat som metylering var en viktig mekanism för MIR-219-2-3p nedreglering i GC.

Vi utförde förutsägelse av TargetScan och miRDB program och fann att 6 gener kan vara potentiella mål för miR -219-2-3p. Bland kandidat målen för MIR-219-2-3p, kinaser receptorn tyrosin ErbB3 (epidermal tillväxtfaktorreceptor familj) drog vår uppmärksamhet. Höga nivåer av erbB3 är starkt förknippad med tumörprogression och dålig prognos för patienter med GC [32] - [34] och EGFR-kinashämmare gefitinib kan förhindra EGFR och erbB2 aktivering av erbB3. Samtidigt erbB3 uttryck fungerar också som en effektiv prediktor för känslighet för gefitinib [35]. Det är känt att undertryckt ErbB3 transkriptionen hämmar signaleringskaskader från ERK1 /2 vägar [36]. De förutspådda mål gener behöver ytterligare experimentellt valideras. Dessutom kan miRNA fungera enligt en kombinatorisk kretsar modell, där en enda miRNA kan rikta flera mRNA, och flera samuttrycks miRNA kan rikta en enda mRNA. Nyligen genomförda studier har antytt att den biologiska begreppet "en hit-multipel mål" skulle kunna användas i kliniska läkemedel [37]. Det är troligt att en viss miRNA kan fungera genom samarbete nedreglering av flera mål och miRNAs fungerar också genom att undertrycka omräkning av sina målgener. För att undersöka den fulla effekten av en miRNA, genomomfattande proteomik studier bör göras.

Sammanfattningsvis vårt uttryck och funktionella studier föreslog att MIR-219-2-3p differentiellt uttrycktes genom metylering mekanism och hade en tumör undertryckande funktion genom att reglera ERK1 /2-relaterade signalvägar i GC. Samtidigt var lägre uttryck av MIR-219-2-3p i GC-prover korrelerade med högre kvalitet och senare skede. Återinföra uttryck av MIR-219-2-3p på GC-celler undertryckta celltillväxt, migration, invasion och apoptos indikerade att miRNA-baserad patient mönster kan ligga till grund för utveckling av nya potentiella behandlingar i magcancer.

Material och metoder

vävnadsprover

Gastric tumörer och deras morfologiskt normala vävnader (beläget > 3 cm från tumören) erhölls mellan november 2009 och november 2011 från 113 GC patienter som genomgår kirurgi vid Cancer Hospital av Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS, n = 21), kinesiska PLA General Hospital (301 sjukhus, n = 31), och den första Anslutna sjukhuset i Shanxi Medical University (n = 61). Användningen av vävnadsprover för alla experiment godkändes av den etiska styrelsen för Institutet för grundläggande medicinska vetenskaper, Chinese Academy of Medical Sciences. Alla deltagare, förutsatt att deras verbala informerat samtycke att delta i denna studie, och deras verbala informerade medgivanden skrevs ned. Detta godkännande process har också godkänts av etikprövningsnämnd. Vävnadsprover skars i två delar, var en fixerades med 10% formalin för histopatologisk diagnos, och den andra var omedelbart snabbfrystes i flytande kväve, och lagrades vid -196 ° C i flytande kväve tills RNA-extraktion. Denna grupp bestod av 95 män, 17 kvinnor och en utan information kön med en medianålder på 58 år (intervall 31-82 år) .Formalin fixerade paraffininbäddade vävnadsblock av GC samlades från Cancer Hospital av Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS, n = 4) mellan 2009 och 2011. på grund av individuella skillnader mellan patienter, saknade vi information vissa clinicopathologic uppgifter. Användningen av vävnadsprover för alla experiment har godkänts av alla patienter och av etiska kommittén vid institutionen. Egenskaperna hos patienter beskrivs i Tabell 1.

cellkulturer och transfektion

Totalt 4 humana GC cellinjer MGC-803 (mucinous magcancer, dåligt differentierad), HGC-27 ( metastaserande lymfkörtel, odifferentierat karcinom), MKN-45 (Klackring ring~~POS=HEADCOMP carcinoma dåligt differentierad), var SGC-7901 (adenokarcinom, måttligt differentierade) undersöktes i denna studie. MGC-803 HGC-27, MKN-45, var SGC-7901 cellinje köpt från Cell Resource Center för Institutet för grundläggande medicinska vetenskaper, Kinesiska akademin för medicinska vetenskaper och Peking Union Medical College (Beijing, Kina). MGC-803 förökades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (Gibco; Invitrogen; Life Technologies, Tyskland), som kompletterats med 10% fetalt bovint serum (FBS; PAA, Pasching, Österrike) och streptomycin (100 | ig /ml), penicillin (100 U /ml). HGC-27, MKN-45, SGC-7901 hölls i RPMI 1640-medium (PAA) kompletterat med 10% FBS (PAA). De humana GC cellinjerna MGC-803, HGC-27 transfekterades med MIR-219-2-3p härmar och negativa kontroll miRNA härmar (GenePharma, Shanghai, Kina, Tabell S1) vid en slutlig koncentration av 10 nmol /L med hjälp av Dharmafect en (Thermo Fisher; IL, USA) i enlighet med tillverkarens instruktioner

TaqMan RT-PCR för miRNA Expression

Totalt RNA extraherades från cellerna och vävnader med Trizol-reagens (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). MiRNA kvantifierades genom realtids-PCR med användning av TaqMan MicroRNA analys (Invitrogen, USA). Första sträng komplementärt DNA (cDNA) Syntesen utfördes från 1 | ig av totalt RNA i 12 | il slutlig volym innehållande 2 M stam-ögla-primer, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, USA). Mixen var platta vid 65 ° C under 5 min, och blandades sedan med 5 x RT-buffert, 0,1 M DTT, 200 U /^ il MultiScribe omvänt transkriptas och 40 U /| il RNas-inhibitor (Invitrogen, USA). Mixen var platta vid 37 ° C under 55 min, 70 ° C under 15 min och hölls sedan vid -20 ° C. Realtids-PCR utfördes med användning av en standard TaqMan PCR-protokoll. 20 il PCR reaktioner ingår 1 pl RT produkt, 1 x Universal TaqMan Master Mix och 1 x TaqMan sond /primer mix (Invitrogen, USA, tabell S1). Alla RT reaktioner inklusive no-mall kontroller kördes i tre exemplar. Alla mRNA kvantifiering uppgifter normaliserades till U6. Den relativa mängden transkript beräknades med användning av jämförande Ct metoden.

5-Aza-CdR och trichostatin A behandling av cellinjer

linjer GC cell MGC-803 behandlades med 5-aza- 2'-deoxicytidin (5-aza-CdR; Sigma-Aldrich, USA) vid 0,7 | imol /l, 1,5 ^ mol /L, 3 | j, mol /L och HGC-27 behandlades med 5-aza-CdR på 0,5 | j, mol /L, 1 | j, mol /L, 1,5 | amol /l under 3 dagar eller 300 nmol /L trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, USA) under 24 timmar. För kombinationsbehandlingen, behandlades celler med 5-aza-CdR under 48 timmar för det första. Sedan TSA (300 nmol /L) tillsattes, och cellerna behandlades under ytterligare 24 timmar. Odlingsmedium innehållande läkemedel ersattes med 24 timmars mellanrum. RNA av cellinjer renades med TRIzol reagens följa instruktionerna från tillverkaren. cDNA-syntes utfördes som beskrivits tidigare, och 1 ml av den utspädda cDNA för varje prov amplifierades genom RT-PCR med användning av det protokoll som tidigare beskrivits.

DNA-isolering och bisulfit modifiering

Genomiskt DNA erhölls från -196 ° C i tumörer flytande kväve primära, och deras matchade närliggande normala vävnader (n = 22, omfattar 11 patienter som uttryck av mIR-219-2-3p var ned-reglerade och de andra var upp-reglerade) och Begagnade Biomed DNA Kit (Biomed, Beijing, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Bisulfit behandling och återvinning av prover genomfördes med Epitect bisulfit kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomiskt DNA (2 ug) i 20 ul vatten användes för varje reaktion och blandades med 85 pl bisulfit mix och 35 pl DNA skydda buffert. Bisulfit omvandling utfördes på en termocykler enligt följande: 99 ° C under 5 min, 60 ° C under 25 min, 99 ° C under 5 min, 60 ° C under 85 min, 99 ° C under 5 min, 60 ° C under 175 min och 20 ° C på obestämd tid. Bisulfit-behandlad DNA utvanns genom Epitect spinnkolonn och därefter sekvenserades för att bekräfta effektiviteten hos bisulfit-omvandling.

Metylering analys

MSP användes för att analysera metylering av MIR-219-2-3p uppströmsregionen i cellinjer och vävnader. Methprimer användes för att utforma MSP-primer (tabell S1). MSP reaktioner på nya primrar optimerades med användning Methylated positiv kontroll (M-DNA), som med användning av normala humana perifera lymfocyt-DNA behandlades in vitro med Sss I metyltransferas (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA från två normala humana perifera lymfocyter användes som normal kontroll. Touchdown PCR bestod av två faser: fas 1 inkluderade en initial denaturering av 95 ° C under 5 min, följt av 45 cykler av denaturering vid 95 ° C under 30 s, hybridisering vid variabla temperaturer under 30 s och förlängning vid 72 ° C under 40 s. I den första cykeln, var glödgningstemperaturen inställd på 58 ° C och, vid var och en av de 10 efterföljande cykler, var glödgningstemperaturen minskade med 0,6 ° C. Fas 2 bestod av 35 cykler av 95 ° C under 30 s, 52 ° C under 30 s och 72 ° C under 40 s. MSP-produkterna analyserades på 3% polyakrylamidgeler

Cell proliferation, apoptos och cellcykelanalys

Celler inkuberades i 10% CCK-8. (Dojindo; Kumamoto, Japan) utspätt i normalt odlingsmedium vid 37 ° C tills visuell färg omvandlingen inträffade. Förökningshastigheter bestämdes vid 0, 24, 48, 72, 96 timmar efter transfektion. Absorbansen för varje brunn mättes med en mikroplattläsare inställd på 450 nM och 630 nM. Alla experiment utfördes i fyra exemplar. Apoptosanalys utfördes på MGC-803 och HGC-27 cellinjer 72 timmar efter transfektion med användning av PE Annexin V Apoptos Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) och analyserades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) . Cellcykelanalys utfördes på MGC-803 och HGC-27 cellinjer 48 timmar efter transfektion med MIR-219-2-3p härmar och scramble respektive. Celler skördades, tvättades två gånger med kall PBS, fixerades i iskall 70% etanol och inkuberades med propidiumjodid (PI) och RNas A, analyserades sedan med FACS. Varje prov kördes i tre exemplar.

Cell migration och invasionsanalyser

MGC-803 och HGC-27 celler odlades till konfluens på 12 brunnar plastskålar och behandlades med rusning eller MIR-219 -2-3p härmar. 24 timmar efter transfektion, var linjär skrap sår (i tre exemplar) skapas på de konfluenta cellmonoskikt med användning av en 200 mikroliter pipettspets. För att avlägsna celler från cellcykeln före sårskada ades celler upprätthölls i serumfritt medium. Att visualisera migrerade celler och sårläkning, var bilder tagna vid 0, 12, 24, 36, 48, 60 och 72 h timmar. Totalt tio områden valdes ut slumpmässigt från varje brunn och cellerna i tre brunnar i varje grupp kvantifierades. För invasionsanalyser, efter 24 timmar transfektion, 1 × 10 ^{5 celler i serumfria medier såddes på de transwell migrationskamrarna (8 | am porstorlek; Millipore, Schweiz), som var belagda med Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) på den övre kammaren. Medium innehållande 20% FBS tillsattes till den undre kammaren. Efter 24 timmar avlägsnades de icke-invaderande cellerna avlägsnades med vadd, invasiva celler placerade på den nedre ytan av kammaren färgades med May-Grunwald-Giemsa-färgning (Sigma Diagnostics, St Louis, Missouri, USA) och räknades med användning av ett mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Experiment var oberoende upprepades tre gånger.}

Proteinisolering och western blotting

Vid de angivna tiderna, MGC-803 celler och HGC-27-celler skördades i iskall PBS och lyserades på is i kall beredning av modifierad radioimmunfällning buffert kompletterad med proteashämmare. Proteinkoncentrationen bestämdes med BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milano, Italien) och lika stora mängder av proteiner analyserades genom SDS-PAGE (10% akrylamid). Gelerna elektroblottades på nitrocellulosamembran (Millipore, Bedford, MA, USA). För immunoblot experiment membranen blockerades under 2 h med 5% fettfri torrmjölk i Tris-buffrad koksaltlösning innehållande 0,1% Tween-20, och inkuberades vid 4 ° C över natten med primär antikropp. Detektion genomfördes med peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar med användning av det förbättrade systemet kemiluminiscens. Primära antikroppar som användes var: GAPDH från Zhong Shan Jinqiao (Beijing, Kina); ERK1 /2 (kanin anti-ERK1 /2, New England Biolabs, NEB) och fosfor-ERK1 /2 (kanin anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolabs, NEB) katalog

histologi
<

• PLOS ONE: högt uttryck av värmechockprotein 90 är associerad med tumör aggressivitet och dålig prognos i patienter med avancerad magsäckscancer
• PLOS ONE: Noninvasiv Visualisering av MicroRNA-16 i Chemoresistance av gastric cancer med hjälp av en Dual Reporter Gene Imaging System