PLOS ONE: uppreglerade uttryck av CXC kemokinreceptorn 4 är en oberoende prognostisk Predictor för patienter med magsäcks Cancer

Abstrakt

Aberrant kemokin (CXC motiv) receptor CXCR4 uttryck i maligna vävnader har rapporterats, men dess roll i magcancer prognos är fortfarande okänd. Våra studier var utformade för att undersöka uttrycket och prognostiska betydelsen av CXCR4 i patienter med magcancer. CXCR4 uttryck i efterhand analyserades med immunohistokemi i 97 patienter med magcancer från Kina. Resultat bedömdes för tillsammans med kliniska tecken och total överlevnad med hjälp av Kaplan-Meier-analys. Prognostiska värden för CXCR4 uttryck och kliniska resultat utvärderades av Cox regressionsanalys. En molekylär prognos stratifiering system som innehåller CXCR4 uttryck bestämdes genom användning av Receiver Operating Characteristic (ROC) analys. Resultaten visar att CXCR4 övervägande lokaliserade i cellmembran och cytoplasma. Proteinnivån CXCR4 var uppreglering i magcancer vävnader och uppreglerade uttryck CXCR4 endast signifikant associerade med Lauren klassificering (P < 0,001). Ökad CXCR4 uttryck i magcancer vävnader positivt korrelerad med dålig överlevnad av patienter med ventrikelcancer (P < 0,001). Ytterligare multivariat Cox regressionsanalys föreslog att intratumoral CXCR4 uttryck var en oberoende prognostisk indikator för sjukdomen. Tillämpning av prognostiska värdet av intratumoral CXCR4 densitet TNM stegssystem visade ett bättre prognostiskt värde hos patienter med magcancer. Sammanfattningsvis var intratumoral CXCR4 uttryck erkänns som en oberoende prognostisk markör för den totala överlevnaden hos patienter med magcancer. På grundval av TNM skede kommer detektion av CXCR4 uttryck vara till hjälp för att förutsäga prognosen för patienter med magcancer

Citation:. Han H, Wang C, Shen Z, Fang Y, Wang X, Chen W, et al. (2013) uppregleras Expression av C-X-C kemokinreceptorn 4 är en oberoende prognostisk Predictor för patienter med magcancer. PLoS ONE 8 (8): e71864. doi: 10.1371 /journal.pone.0071864

Redaktör: Reury Flampunkt Bacurau, University of Sao Paulo, Brasilien

Mottagna: 14 april 2013, Accepteras: 4 juli 2013. Publicerad: 6 Augusti 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av bidrag från nyckelprojekt för vetenskap och teknik kommissionen i Shanghai kommun (09DZ1950101, 11.411.951 tusen) och Shanghai kommunala hälso Bureau Fund (20.124.290). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Trots en markant nedgång i förekomsten av magcancer i många industriländer fortfarande magcancer den fjärde vanligaste tumör i världen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet delvis på grund av att förlora läkande terapeutiska möjligheter vid tidpunkten för diagnos med långt framskriden sjukdom i de allra flesta patienter [1,2]. Några 400 tusen nya fall diagnostiseras varje år i Kina, som står för 42% av världens totala [3]. Gastric patienter med samma skede av sjukdomen cancer presentera olika kliniska kurser och har olika prognos [4]. Denna heterogenitet av gastrisk carcinom är närvarande på molekylär nivå och har en genetisk predisposition för det [5]. Nyligen har vissa molekylbaserade markörer rapporterats vara betydande prognostiska faktorer för patienter med magcancer [6,7]. Men få av dem har bekräftats som oberoende förutsägande faktor. Därför, identifiering av en postoperativ användbar indikator för att bättre förstå den biologiska grunden för överlevnaden av gastric cancerpatienter kan ge viktiga kliniskt relevanta insikter sjukdomsbehandling.

kemokinreceptorer uttrycks inte bara av leukocyter utan även av vissa epitel celler och flera typer av cancerceller [8]. Tidigare studier hade visat att CXCL12 /CXCR4 axeln spelar en viktig roll vid metastas av många maligniteter, inklusive magcancer [9]. CXCL12 är den enda kända liganden för CXCR4, som aktiverar receptorn CXCR4 och lockar cirkulerande CXCR4-expressionsceller till perifera vävnader genom att reglera ett stort antal olika nedströms signalvägar relaterade till proliferation, migration, kemotaxi, och cellöverlevnad [10]. Det har visats att cancer CXCL12 positivitet bestämdes att vara en oberoende prognostisk faktor för patientöverlevnad av magcancer [11]. CXCR4 har även visat sig att vara en prognostisk markör i olika typer av cancer, inklusive akut myeloid leukemi [12], bröstcancer [13], och prostatacancer [14]. Dock fortfarande en omfattande analys av CXCR4 uttryck i förhållande till överlevnaden hos patienter med magcancer till stor del okända och måste vidare upprättas.

I den aktuella studien, strävar vi efter att fastställa de kliniska och prognostiska konsekvenserna av CXCR4 uttryck i magcancer. Vår undersökning visar att proteinnivå av CXCR4 var uppreglering i magsäckscancer vävnader jämfört med de parade icke-tumörvävnad, och dess korrelation med dålig prognos för patienter med magcancer utvärderades. Dessutom kombination av intratumoral CXCR4 uttryck och TNM stadium visade ett bättre prognostiskt värde än vad TNM stadium ensam.

Material och metoder

Etik uttalande

etiskt godkännande beviljades av Clinical Research etikkommitté Zhongshan Hospital of Fudan University (Shanghai, Kina). Undertecknat informerat samtycke erhölls från alla patienter för förvärv och användning av patientvävnadsprover och anonyma kliniska data.

kliniska prover

Vi rekryterade prospektivt konsekutiva patienter med magcancer, samlat clinicopathologic uppgifter och proverna och detaljerad analys i efterhand proven för markörer som korrelerar med överlevnad och deras roll i raffinering ventrikelcancer prognostic skiktning [15]. Mänskliga gastric cancer vävnadsprover samlades vid tidpunkten för kirurgisk resektion från 97 patienter med magcancer utan kemoterapi eller strålbehandling före operation, som hade formalinfixerade, paraffininbäddade och kliniskt och histopatologiskt diagnostiseras från januari 2000 till December 2005 vid Zhongshan Hospital of Fudan University. Icke-tumörgastriska vävnader erhölls vid minst 5 cm från tumören samtidigt. Rutin kemoterapi hade givits till patienter med avancerad skede av sjukdomen efter operation, men ingen strålbehandling gjordes i någon av patienterna som ingår i vår studie. Patienter exkluderades om de tidigare hade utsatts för någon målinriktad terapi, kemoterapi, strålbehandling, eller interventionsterapi för magcancer. Samtliga prover patologiskt omvärderas självständigt av två gastroenterology patologer förblindade till de kliniska data.

Tissue microarray och immunohistokemi

Vävnads microarrays konstruerades såsom beskrivits tidigare [16]. De vävnadsmicroarray paraffinblock skars i 4 pm sektioner. Sektionerna upphettades vid 70 ° C under 1 h, awaxas i xylen och dehydratiserades genom en gradient koncentration av alkohol. Efter hämtning och blockera endogent peroxidas och icke-specifik färgning med 3% (volym /volym) HR _{2ROR 2R och normalt getserum, sektionerna inkuberades med anti-CXCR4-antikropp (R &D systems, Minneapolis , MN, USA) över natten vid 4 ° C. Objektglasen inkuberades därefter med HRP-konjugerad get-anti-mus-IgG sekundär antikropp under 10 min vid 37 ° C. Slutligen tillsattes sektionerna visualiserades genom DAB-lösning (DAKO, Carpinteria, CA, USA) och motfärgades med hematoxylin (DAKO, Carpinteria, CA, USA). Specificiteten hos antikroppen bekräftades genom immunohistokemi med peptid konkurrens. Intensiteten för immunohistokemi färgning av CXCR4 poängsattes självständigt av två gastroenterology patologer med hjälp av semikvantitativ immunreaktivitet scoring (IRS) systemet såsom tidigare beskrivits [15,17]. Negativa kontroller behandlades identiskt men med den primära antikroppen utelämnas.
Patienter
CXCR4 uttryck
Factor
Nej
%
vid låg
Hög
P
Alla patients971005443Age (years)P^{†0.266≤604849.482424>604950.523019Gender0.528Female3536.081817Male6263.923626Localization0.375Proximal1010.3164Middle4546.392817Distal4243.302022Differentiation0.160Well55.1614Moderately3637.112313Poorly5657.733026Lauren klassificering < 0.001Intestinal type7173.204922Diffuse type2626.80521T classification0.767T12626.801511T21010.3173T344.1322T45758.763027N classification0.053N03839.182216N11919.59145N21414.4395N32626.80917Distant metastasis0.697No9496.915242Yes33.0921TNM stage0.629i3030.931911ii1919.59118iii4546.392223iv33.0921Tumor storlek (cm) P † 0.450. < 3.55657.733323≥3.54142.272120 † Split på median.Table 1. Förhållandet mellan intratumoral CXCR4 uttryck och kliniska egenskaper hos patienter med magcancer
CSV Ladda ner CSV}}

statistisk analys

Statistic analys utfördes med MedCalc Software (version 11.4.2.0; MedCalc, Mariakerke, Belgien). Patient baslinjedata och sjukdomsfaktorer sammanfattades med hjälp av beskrivande statistik. Numeriska data analyserades med användning av Students t-test, medan kategoridata studerades med användning av Pearsons χ ^{2 För Fishers exakta test. Kumulativ överlevnadstiden beräknades genom Kaplan-Meier-metoden och analyserades genom log-rank test. Siffror i riskzonen beräknades för början av varje tidsperiod. Cox proportional hazards regressionsmodell användes för att utföra univariata och multivariata analyser. Receiver Operating Characteristic (ROC) -analys användes för att jämföra den sensitivitet och specificitet för förutsägelse av överlevnad av parametrarna. Alla P-värden var dubbelsidigt, och skillnader ansågs signifikanta vid värden av P < 0,05. Resultaten redovisas i enlighet med anmärkning (Rapportering Rekommendationer för tumörmarkör Prognostiska Studies) riktlinjer [18].}

Resultat

Proteinnivån av CXCR4 var uppreglering i magcancer vävnader

för att avgöra huruvida CXCR4-proteinet är förhöjd i magcancer vävnader, vi först utvärderas CXCR4 uttryck genom immunohistokemiska analyser i tumör och parade icke-tumörprover från 97 patienter med magcancer. Såsom visas i figur 1, De flesta av de stromaceller var negativ färgning, även om sporadiska positiv färgning på dessa celler observerades också (Figur 1B till 1D). CXCR4 immunoreaktivitet var främst i membranen och cytoplasma av gastric cancerceller (Figur 1C och 1D) och intensiteten av immunhistokemisk färgning var variabel. Jämfört med veckan icke tumör CXCR4 densitet i gastric epitelceller (figur 1B), ökad intratumoral CXCR4 uttryck både i tarm-typ (figur 1C) och diffus-typ (figur 1D) magcancer. Tillsammans står dessa observationer tyder på att CXCR4 uttryck ökar i magsäckscancer vävnader jämfört med de parade icke-tumörvävnad.

Förhållandet mellan CXCR4 uttryck och kliniskt patologiska faktorer hos patienter med magcancer

Enligt IRS kriteriet, ca 44,33% (43 av 97) tumörer bedömdes som hög CXCR4 uttryck. Immunhistokemisk färgning av CXCR4 nivåer analyserades statistiskt för att fastställa deras relation med olika clinicopathologic funktioner i övergripande 97 gastric cancerpatienter. Som framgår av tabell 1, intratumoral CXCR4 uttryck endast i samband med Lauren klassificering (P < 0,001). Det finns fler patienter med diffus typ magsäckscancer presenteras hög intratumoral CXCR4 uttryck än med intestinal-typ. Det finns ingen signifikant skillnad i ålder, kön, primärtumör plats, differentiering, T klassificering, N klassificering, fjärrmetastaser, TNM stadium, eller tumörstorlek mellan den höga intratumoral CXCR4 uttryck grupp och den låga intratumoral CXCR4 uttryck grupp. Dessutom var icke-tumör CXCR4 uttryck inte förknippat med några clinicopathlogic faktorer gastric cancerpatienter (data visas ej).

Association of CXCR4 uttryck med total överlevnad av patienter med magcancer

För att ytterligare undersöka det prognostiska värdet av CXCR4 uttryck i gastric cancerpatienter, jämförde vi cancerspecifik överlevnad enligt intratumoral CXCR4 uttryck, och Kaplan-Meier överlevnadsanalys utfördes. Som framgår av tabell 2, visade Kaplan-Meier överlevnadsanalys att den totala överlevnaden av gastric patienter med hög intratumoral CXCR4 uttryck cancer var betydligt sämre än de patienter med låg CXCR4 intratumoral uttryck (P < 0,001; figur 2A, tabell 2), vilket indikerar en avgörande inverkan intratumoral CXCR4 uttryck på kliniskt utfall i patienter. Men Kaplan-Meier överlevnadsanalys visade att icke-tumör CXCR4 uttryck inte var förknippad med total överlevnad av patienter med ventrikelcancer (data visas ej). Dessutom, för att avgöra huruvida intratumoral CXCR4 uttryck kan skikta patienter med TNM stadium stratum utvärderade vi prognostiska värdet av intratumoral CXCR4 uttryck och gjorde stratifierat analyser av gastric cancerpatienter med TNM stadium I + II och TNM stadium III + IV. Som framgår av tabell 2, endast patienter med TNM stadium III + IV kan avsevärt stratifierat efter intratumoral CXCR4 uttryck, den totala överlevnadstiden för TNM stadium III + IV patienter med låg intratumoral CXCR4 uttryck var betydligt längre än de med hög intratumoral CXCR4 uttryck (P < 0,001; figur 2B och 2C, tabell 2).
Patienter
faktor
Nej
%
P
alla patients97100CXCR4 uttryck < 0.001Low5455.67High4344.33TNM steget i + ii4950.52CXCR4 expression0.189Low3030.93High1919.59TNM stadium III + iv4849.48CXCR4 uttryck < 0.001Low2424.74High2424.74Table 2. log-rank test på total överlevnad för TNM etapp split av CXCR4 uttryck.
CSV Ladda ner CSV

uppreglerade uttrycket av CXCR 4 är en oberoende prognostisk prediktor för patienter med magcancer

för att uppskatta den kliniska betydelsen av olika prognostiska faktorer som kan påverka överlevnaden i studiepopulationen var univariat analyser utförs för total överlevnad i 97 patienter med magcancer. Som framgår av tabell 3, Lauren klassificering (P = 0,025), T klassificering (P = 0,002), N klassificering (P = 0,001), fjärrmetastaser (P < 0,001), TNM stadium (P < 0,001), och CXCR4 uttryck ( P < 0,001) var statistiskt signifikanta riskfaktorer som påverkar överlevnad av patienter med magcancer. Hög intratumoral CXCR4 uttryck är en betydande negativ prediktor för total överlevnad (hazard ratio [HR], 4,90; 95% CI, 2,19-10,97, P < 0,001). För att utvärdera robusthet prognostiska värdet av intratumoral CXCR4 uttryck, var Cox multivariat regressionsanalys för att härleda oberoende uppskattningar Risker relaterade till överlevnad med covariates visar betydelse i univariata analyser. Som framgår av tabell 3, intratumoral CXCR4 uttryck (HR, 5,07; 95% CI, 2,02-12,68, P = 0,001) och TNM stadium (HR, 15,50; 95% CI, 4,64-51,85, P < 0,001) båda erkänts som oberoende prognostiska faktorer för överlevnad i 97 patienter med magcancer. Sammantaget våra resultat tyder på att intratumoral CXCR4 uttryck kan vara en användbar markör för att förutsäga överlevnaden hos patienter med magcancer.
Överlevnad
Univariat
Hazard Radio (95% CI) katalog P
Ålder (år) P ^{† P: > 60 vs ≤601.61 (0,79-3,27) 0.190Gender: Man vs Female0.98 (0,46-2,05) 0.948Localization: Distal vs Proximal + Middle1.52 (0,74 till 3,12) 0.251Differentiation: Dåligt vs Well + Moderately1.63 (0,76-3,50) 0.206Lauren klassificering: Diffus vs Intestinal2.31 (1,11-4,80) 0.025T klassificering: T3 + T4 vs T1 + T223.36 (3,18 till 171,71) 0,002 N klassificering: N1 + N2 + N3 vs N025.79 (3,51 till 189,58) 0.001Distant metastaser: Ja vs No14.54 (3,84-55,06) < 0.001TNM scen: III + IV vs I + ii13.12 (3,97-43,41 ) < 0.001Tumor storlek (cm) P † P: ≥3.5 vs < 3.51.13 (0,55-2,33) 0.736CXCR4 uttryck: Högt vs Low4.90 (2,19-10,97) < 0.001MultivariateHazard Radio (95 % CI) PLauren klassificering: Diffus vs Intestinal1.29 (0,59-2,82) 0.520TNM scen: III + IV vs I + ii15.50 (4,64-51,85) < 0.001CXCR4 uttryck: Högt vs Low5.07 (2,02-12,68) 0.001Table 3. univariata och multivariata Cox regressionsanalyser för total överlevnad hos patienter med magcancer
Förkortning:. 95% CI, 95% konfidensintervall † Split på median. CSV Ladda ner CSV}

Förlängning av TNM scenen prognosmodell med intratumoral CXCR4 uttryck

Att utveckla en mer känslig prediktiva verktyg, vi konstruerat en prognos poäng modell som kombinerar två oberoende prognostiska faktorer, intratumoral CXCR4 uttryck och TNM stadium, och jämförde sin prognosförmåga med intratumoral CXCR4 enbart uttryck och TNM stadium enbart modeller med hjälp av receiver Operating Characteristic (ROC) analys. Kombination av intratumoral CXCR4 uttryck och TNM stadium (AUC [95% CI] 0,906 [0,830-0,956]) visade ett bättre prognostiskt värde än vad TNM stadium (AUC [95% CI] 0,825 [0,734-0,894]; P = 0,0109 ) eller intratumoral CXCR4 uttryck (AUC [95% CI] 0,719 [0,619-0,806]; P < 0,0001) enbart (Figur 3) Review

Diskussion

Avancerat magcancer prognos tenderar att vara. dyster, trots aggressiv terapi [19]. Definiera molekylära grupper kan identifiera patienter som kan dra nytta av riktade behandlingar och personlig behandling anses vara det bästa alternativet att minska magcancer dödligheten [2,20]. Vid utvecklingen och metastasering till avlägsna organ, magsäckscancer delar många likheter med leukocyter handel, som ytterst styrs av kemokiner och deras receptorer [21]. Kemokinreceptorn CXCR4 tillhör den stora supperfamily av G-proteinkopplade receptorer och har identifierats att spela viktiga roller i den målsökande av hematopoetiska celler och metastas av många fasta tumörer [22]. Dessutom har CXCR4 också visat sig vara en prognostisk markör i olika typer av cancer, inklusive akut myeloid leukemi [12], bröstcancer [13], och prostatacancer [14]. I vår studie har vi först identifierat hög intratumoral CXCR4 uttryck som en självständig dålig prognostisk faktor för total överlevnad efter gastrektomi av gastric cancerpatienter, och endast de patienter med TNM stadium III + IV kan avsevärt stratifierat efter intratumoral CXCR4 uttryck. Dessutom i denna studie införlivande av intratumoral CXCR4 densitet i aktuellt clinicopathologic TNM scensystemet förbättras prognosvärde för total överlevnad. Dessa data tyder på att intratumoral CXCR4 tätheten kan lägga till några prognostisk information för patienter med magcancer och leda till en mer noggrann klassificering enligt TNM scensystemet. Dock bör resultaten av integrationen av intratumoral CXCR4 uttryck i nuvarande prognosmodellen och den potentiella klinisk praxis förändras valideras på ett oberoende och större datamängd. Och djupgående molekylära roller CXCR4 i gastric cancer progression förblir långt ifrån helt klarlagd och väntar ytterligare utredning.

Cytostatika är en oumbärlig del av behandling för patienter med ventrikelcancer och fluoropyrimidiner, platinainnehållande medel, ensamma eller i kombinationer, är de mest effektiva och som vanligen används kemoterapiregimer [23]. Metastas och läkemedelsresistens är stora problem i magcancer kemoterapi [24]. Tidigare studie hade rapporterats att CXCR4 var en potentiell markör för docetaxel chemosensitivity i magcancer [25]. I vår studie visade vi att den totala överlevnaden av gastric cancerpatienter presenterade hög intratumoral CXCR4 uttryck med TNM stadium III + IV var betydligt sämre än de patienter med låg CXCR4 intratumoral uttryck (P < 0,001; figur 2C, tabell 2). Dessa gastric patienter med TNM stadium III + IV cancer rutinmässigt behandlas med kemoterapi postoperation. Dessa data tyder på att intratumoral CXCR4 uttryck kan vara en potentiell prediktiv markör vid kemoterapi känslighet magcancer. Medan de molekylära mekanismer som ligger bakom läkemedelsresistens gastric cancerceller måste analyseras i framtiden.

Det har rapporterats att metastaser var associerad med kemokin signalering genom CXCL12 /CXCR4 axel i många tumörer, inklusive magcancer [26]. Cancer CXCL12 positivitet bestämdes att vara en oberoende prognostisk faktor för patientöverlevnad av magcancer och CXCR4 uttryck i samband med lymfkörteln och levermetastaser av magcancer [9,11]. Kwak et al. sökte CXCR4 uttryck immumohistochemically i mer än tre hundra gastric cancerpatienter, drog de slutsatsen att det inte fanns några betydande kliniska betydelsen av CXCR4 uttryck i magcancer utom tumörhistologi, och uttrycket av kemokinreceptorn CXCR4 befanns vara hög i differentierade och intestinal typ gastric cancer [27]. Men i vår studie, finns det inget signifikant samband mellan CXCR4 uttryck och kliniska egenskaper magcancer utom Lauren klassificering, och det finns fler patienter med magcancer diffus typ presenteras hög intratumoral CXCR4 uttryck än med intestinal-typ. Detta i motsats hitta kan återspegla de olika IRS kriteriet och olika genetisk bakgrund av patienter med magcancer, och de djupgående molekylära roller CXCR4 i magcancer differentiering förblir långt ifrån fullt förstås och meriter ytterligare utredning. Dessutom är CXCR7 också en receptor för CXCL12 som binder denna kemokin med större affinitet [28], kliniska och prognostiska konsekvenser CXCL12 /CXCR4 /CXCR7 axel hos patienter med magcancer återstår att belysas i framtiden.

CXCR4 signalering har varit inblandad i tumörtillväxt, intravasering, migration och överlevnad, och optimal användning av CXCR4 hämning kan vara en del av den potentiella strålterapi för magcancer behandling [29]. Den bicyclamderivat AMD3100 är känd som en liten syntetisk hämmare av CXCL12 bindande kemokinreceptorer CXCR4 och CXCR7 [30]. AMD3100 kan störa interaktionen av tumörceller med mikro av fjärrmetastaser platser och öka känsligheten för behandlingen [31]. Och säkerhet AMD3100 har fastställts i kliniska prövningar där läkemedlet gavs antingen som en enda dos eller som en kontinuerlig infusion. Tidigare studie har visats CXCR4-antagonister kanske är användbara för behandlingen av peritoneal karcinomatos av magcancer i en musmodell [32]. Dessa data tyder på att rikta CXCL12 /CXCR4 signal med AMD3100 kan vara en ny och effektiv strategi för behandling i avancerade gastric patienter med fjärrmetastaser potential cancer.

Sammanfattningsvis våra resultat visar att ökad intratumoral CXCR4 uttryck förutspår oberoende dålig postoperativ överlevnad av patienter med magcancer. Integration av intratumoral CXCR4 densitet i aktuellt clinicopathologic TNM scensystemet kan lägga till några prognostisk information för patienter med magcancer.

Tack till

Författarna vill tacka Haiying Zeng (Fudan University, Shanghai, Kina ) för experimentell teknisk assistans.

• PLOS ONE: rött och bearbetat kött intag är förknippad med högre Gastric Cancer Risk: en meta-analys av epidemiologiska observationsstudier
• PLOS ONE: Frekvensrisk och varaktighet risk Relationer mellan Aspirin användning och Gastric Cancer: en systematisk genomgång och meta-analys