PLoS ONE: CCR7 Expression och Intratumoral foxp3 + regulatoriska T-celler är korrelerade med total överlevnad och Lymph Node Metastaser i Gastric Cancer

Abstrakt

Syftet med denna studie var att undersöka det prognostiska värdet av kemokinreceptor CCR7 uttryck och intratumoral fOXP3 ^{+ regulatoriska T-celler (tregs) i magcancer. CCR7 + tumörceller och foxp3 + tregs bedömdes genom immunhistokemi i vävnads mikroarrayer innehållande magcancer från 133 patienter. Prognostiska effekter av lågt eller högt CCR7 och foxp3 uttryck utvärderades av Cox regression och Kaplan-Meier analys, liksom sambandet mellan CCR7 positiv värdering och intratumoral FOXP3 + antalet celler i en längsgående bedömning. Analysen visade att de höga expressionsnivåer av CCR7 och foxp3 detekterades i 69,9% respektive 65,4% av fallen, respektive. Hög CCR7 uttryck i gastric cancerceller var signifikant associerad med dålig överlevnad (OS) ( P
= 0,010) och lymfkörtel metastas ( P
= 0,009), och var en oberoende faktor för sämre OS ( P
= 0,023) av multivariat analys. Höga antal intratumoral FOXP3 + tregs signifikant korrelerad med kortare OS ( P
= 0,021) och lymfkörtel metastas ( P
= 0,024), och var också en oberoende faktor för ogynnsamma OS ( P
= 0,035). Dessutom fanns det en signifikant positiv korrelation mellan CCR7 positiv värdering och intratumoral FOXP3 + cellantal (r = 0,949, P Hotel < 0,001). Dessa resultat visade att CCR7 uttryck i gastric cancerceller och intratumoral foxp3 + tregs skulle kunna betraktas som en co-indikator för klinisk prognos för magcancer}

Citation. Zhou S, Xu S, Tao H, Zhen Z, Chen G, Zhang Z, et al. (2013) CCR7 Expression och Intratumoral foxp3 ^{+ regulatoriska T-celler är korrelerade med total överlevnad och Lymph Node Metastaser i magcancer. PLoS ONE 8 (9): e74430. doi: 10.1371 /journal.pone.0074430}

Redaktör: Udai P. Singh, University of South Carolina School of Medicine, USA

Mottagna: 26 april 2013, Accepteras: 1 augusti, 2013; Publicerad: 5 september 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 31.000.527), Shanghai Health Bureau forskningsfonden Young Investigator (Dr Shuang Zhou) och Hongkong Scholar program (nr XJ2011025). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

CCR7 är en sju transmembran-G-proteinkopplad kemokinreceptor, huvudsakligen uttrycks på cellytan av naiva T-celler och dendritiska celler (DC), SLC (sekundär lymfoid kemokin, CCL21) och ELC (EB11-ligand kemokin , CCL19) är de två höga affinitetsligander. CCR7 är väsentlig för migration av T-celler och DC till den omgivande lymfoidvävnad eller platsen för immunsvar genom att binda till sina ligander [1]. CCR7
är uttrycks inte bara
i naiva T-celler och DCS, men även i vissa tumörceller. Tumörer med hög CCR7 expression är mer benägna att uppvisa extrathyroidal förlängning, angiolymphatic invasion, lymfkörtel metastas, anti-apotosis och cellproliferation [2] - [4]. CCR7 befrämjar tumörtillväxt och metastas som svar på endogent SLC eller ELC. Många studier har visat att maligna celler med CCR7 uttryck kan riktas till motsvarande organ med hög närvaro av deras ligander [5] - [8]. Därför CCR7 medierad cell kemotaxi inte bara i samband med fastställandet av den antitumörimmunmikro, men kan också bidra till tidig utvärdering av den biologiska beteende av tumörer. CCR7 uttryck i tumörceller är starkt korrelerad med deras metastaser och malignitet [2].

regulatoriska T-celler (tregs) tros dämpa T-cellsimmunitet och att vara det främsta hindret anlöp immunoterapi. En växande mängd bevis tyder på att tregs inom tumörmikro kan spela en viktig roll i att undertrycka lokala antitumörimmunsvar [9], [10]. Foxp3, en forkhead /bevingad helix transkriptionsfaktor, är den mest specifika markören av tregs och det är möjligt att definiera tregs mer strikt som CD4 ^{+ CD25 + regulatoriska T-celler [11]. FOXP3 tycks vara kritisk för utveckling och funktion av tregs, och förlusten av foxp3 expression leder till brist på tregs och hyperaktivering av CD4 + T-celler, vilket resulterar i dödlig autoaggressive lymfoproliferation, medan överuttryck av Foxp3 resulterar i allvarlig immunbrist [11] - [13]. Det har rapporterats att en ökad foxp3 + tregs är förknippade med en högre risk för återfall och dålig överlevnad av patienter med vissa fasta tumörer [14] - [20]}

Gastric cancer är den fjärde vanligaste. cancer i världen, och den totala överlevnaden hos patienter förblir dålig trots förbättrade diagnostiska och behandlingsstrategier, bland vilka resektion är en av de främsta prioriteringarna [21]. Ytterligare undersökningar rekommenderas att undersöka prognostiska effekter CCR7 uttryck och tregs i magcancer.

I denna studie undersökte vi prognostiska värdet av CCR7 uttryck i gastric cancerceller och intratumoral FOXP3 ^{+ tregs, och förhållandet mellan dem i magsäckscancer. Resultaten tyder på att de inte bara var associerade med dålig överlevnad och lymfkörteln metastasering, men också positivt korrelerade med varandra.}

Material och metoder

Etik Statement

Detta studien godkändes av den etiska kommittén vid Tongji University School of Medicine och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter innan inskrivning. Förfarandet för att samla in de mänskliga magcancer resektion exemplar från patienter överensstämde med de principer som anges i Helsingforsdeklarationen.

Patienter och uppföljning

133 patienter med magcancer som genomgick utökade lymfkörtel dissektion (D2 resektion) mellan 2001 och 2007 vid Tongji Hospital (Shanghai, Kina) rekryterades i vår studie. Utvärderingen av resektion exemplar utfördes i enlighet med riktlinjerna i den japanska Gastric Cancer Association (JGCA) 1998. Ingen av patienterna fick strålbehandling, kemoterapi eller andra medicinska ingrepp före operationen. Prover valdes enbart på grundval av tillgången på lämpliga formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader och fullständig clinicopathologic och uppföljningsdata för patienterna.

Uppföljning fördes den 15 november 2010. Ett minst tre års uppföljning krävdes. Median uppföljning var 43 månader (intervall 36 till 104 månader). Uppföljningsförfaranden bestod av interims historia, fysisk undersökning, tumörmarkörer (CEA, CA199), buken ultraljud och röntgen var 4-6 månader beroende på den postoperativa tiden. För patienter med testresultat som tyder på återfall, blev datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRT) som används för bekräftande bevis för återfall. De återfall av magcancer skulle bekräftas av cytologi biopsi eller kirurgi. Total överlevnad (OS) definierades som intervallet mellan kirurgi och död eller mellan kirurgi och den sista observationen för överlevande patienter. Uppgifterna censurerades vid den sista uppföljningen för levande patienter.

Vävnads Microarrays och immunohistokemi

Vävnads mikroarrayer konstruerades såsom beskrivits tidigare [22], [23]. Samtliga fall var histologiskt granskats av hematoxylin och eosin färgning, och representativa tumör områden med små runda lymfocyter infiltrat var preparerade i paraffinblock, bort från nekrotiska och blödnings material. Duplicera cylinder 1 mm diameter från tumörcentrum (betecknad som intratumör) valdes ut från varje fall med hjälp av en automatiserad vävnads arrayer (Shanghai Biochip Co, Ltd, Shanghai, Kina), tillsammans med paracancerous icke-maligna gastric vävnader som kontroller för att säkerställa reproducerbarhet och homogen färgning av objektglasen. Sektioner av 4-um tjocklek togs på 3-aminopropyltrietoxisilan-belagda objektglas.

musmonoklonala antikroppar som användes var anti-human CCR7 (eBioscience, San Diego, CA) och foxp3 (Biolegend, San Diego, CA) . Immunohistokemi av paraffinsnitt utfördes med användning av ett två-stegs protokoll (Novolink Polymer Detection System, Novocastra, Newcastle, UK) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet, sektioner avparaffinerades i xylen och rehydratiserades i etanol. Efter endogen peroxidasaktivitet blockerades med inkubering av objektglasen i 0,3% H _{2O 2, antigenåtervinning gjordes genom att placera sektionerna i en elektrisk köks kruka fylld med kokande citratbuffert i 20 min, och icke-specifika bindningsställen blockerades med Protein Block (RE7102). Efter serie inkubering med primära antikroppar, Post Primär Block (RE7111), och sekundära antikroppar (RE7112), var sektionerna utvecklats i 3,3'-diamiobenzidine lösningen under ett mikroskop och motfärgades med hematoxyline. Negativa kontrollobjektglas utelämna de primära antikropparna inkluderades i samtliga analyser.}

Utvärdering av Immunohistokemiska variabler

CCR7 positiv värdering av tumörceller analyserades genom användning av mjukvara för bildanalys (Leica QWin bildbehandling och analys programvara, Wetzlar, Tyskland). För varje bild, alla intakta hög effekt fält (HPF) (× 400) digitala bilder togs av ovannämnda utrustning och sedan analyseras av bildanalysmjukvara att förvärva positiva poäng CCR7 för varje fält. Slutligen, genomsnittligt antal för en HPF (× 400) beräknades för att säkerställa representativitet och homogenitet.

Antalet foxp3 ^{+ tregs i mikroarrayer räknades som tidigare beskrivits [14], med hjälp av datoriserad bildanalys system bestående av en Hitachi HV-C20A CCD-kamera (Hitachi, Tokyo, Japan), installerad på en Leica DMLA ljusmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) och ansluten till en persondator. Under × 400 förstoring, det fanns minst 12 oberoende och intakta datoriserade mikroskopiska fält för kopior av varje patientprov. 8 oberoende mikroskopiska fält (x 400), som representerar de tätaste lymfocytiska infiltrat, valdes ut för varje patientprov för att säkerställa representativitet och homogenitet. Antalet 12 fält slogs samman och sedan genomsnitt för att beräkna det slutliga antalet för ett datoriserat × 400 mikroskopisk fält (0.0768 mm 2 /fält). Utvärderingen av foxp3 + tregs utfördes genom två oberoende observatörer på ett blint sätt. Avvikelser i uppräkning, inom ett intervall av 5%, har omprövas och konsensus beslut fattades.}

Statistisk analys

Aktuariella OS hastigheter beräknades av Kaplan-Meier-metoden och analyserades med log-rank test. Univariata och multivariata analyser baserades på Cox proportional hazards regressionsmodell. En sekundär analys utfördes för att bedöma förhållandet mellan variabler och clinicopathologic egenskaper. För jämförelse av enskilda variabler, var chi-square test och Fishers exakta test utförts enligt bestämmelserna. Tvåsidiga P Hotel < 0,05 bedömdes vara signifikant. Alla analyser utfördes med hjälp av SPSS 16,0 programvara (SPSS, Chicago, IL).

Resultat

patientkarakteristika

Egenskaperna hos 133 patienter visades i tabell 1. Proverna ingår 89 (66,9%) män och 44 (33,1%) kvinnliga patienter med magcancer. 68 (51,1%) patienter var mindre än 60 år gamla och andra var mer än eller lika med 60 år gammal. Tumörstorleken av 79 (59,4%) av patienterna var mindre än 40 mm och andras var mer än eller lika med 40 mm. 75 (56,4%) patienter hade lymfatiska invasion och 84 (63,2%) patienter hade lymfkörtel metastas. 61 (45,9%) tumörer odifferentierade och andra differentierades. 50 (37,6%) tumörer kategoriseras som T1T2, och 83 (62,4%) som T3T4 enligt JGCA.

Uttryck av CCR7 och foxp3 i Gastric cancervävnader

uttrycksnivåer av CCR7 och foxp3 i vävnads mikroarrayer av magcancer undersöktes genom immunhistokemisk analys. Fikon. 1 och Fig. 2 visade representativa immunostainings av CCR7 och FOXP3. Positiv färgning av CCR7 identifierades i cytoplasman och cellmembranet av gastric cancerceller (Fig. 1 A-D). Hög CCR7 uttryck detekterades i 69,9% av magcancer prover (93 fall av 133 patienter). Celler betraktades som foxp3 ^{+ tregs baserad på distinkta intranukleär expression (Fig. 2 A-D). Hög foxp3 uttryck detekterades i 65,4% av magcancer prover (87 fall av 133 patienter). När det gäller resultatet av CCR7 positiva tumörceller och foxp3 + tregs nummer, de statistiska resultaten för immunhistokemiska variabler visas i tabell 2. Som kontrollerna fanns ingen CCR7 uttryck och mycket få FOXP3 + tregs i normala mag vävnader (Fig. S1).}

CCR7 och foxp3 Expression var förknippade med total överlevnad i Gastric Cancer

Äntligen uppföljning, studerade 39 patienter (29,3%) hade dött, som alla dog av en upprepning av magcancer. OS priserna var 93,5% för ett år, 81,2% i 2 år och 76,9% i 3 år, respektive, för hela studien.

Prognostiska effekter av lågt eller högt CCR7 och foxp3 uttryck utvärderades av Cox regression och Kaplan-Meier-analys. På univariat analys, ålder, kön, tumörstorlek och tumördifferentieringen visade ingen prognostisk betydelse för OS priser, men lymfatiska invasion, noder lymfa metastaser och tumörer (T) klassificering var associerade med OS priser ( P
= 0,019, P
= 0,013, P Hotel < 0,001 respektive tabell 3). CCR7 uttryck i gastric cancerceller var förknippad med OS priser (log-rank test, P
= 0,010 < 0,05), ett år, två år och tre år OS priser var 91,4%, 78,5 % och 72% för hög CCR7 uttrycksgrupper, jämfört med 100%, 97,5% och 92,4% för låg CCR7 uttrycksgrupper (Fig. 3A). Multivariat analys visade att hög CCR7 uttryck var en oberoende prognostisk faktor för sämre OS priser (hazard ratio [HR] 2,896, 95% konfidentiellt intervall [CI] 1,385-7,276, P
= 0,023 och 0,05, Tabell 4 ). Hög infiltration av intratumoral foxp3 ^{+ tregs var också förenad med negativa OS (log-rank test, P
= 0,021 < 0,05), ett år, två år och tre år OS priser var 88,9%, 79,1% och 69,5% för hög foxp3 uttrycksgrupper, jämfört med 97,8%, 89,6% och 87,2% för låg foxp3 uttrycksgrupper (Fig. 3B). På multivariat analys, + tregs också visade närvaro av hög intratumoral foxp3 att vara en oberoende prediktor för sämre OS priser (HR 1,906, 95% CI 1,205-4,238, P
= 0,035 < 0,05 Tabell 5).}

Samband mellan de uttrycksnivåer av CCR7 och foxp3 och kliniska egenskaper

Tabell 6 samman förhållandet mellan uttrycksnivåer av CCR7 och foxp3 och kliniska egenskaperna hos de 133 patienter med magcancer. Både CCR7 och foxp3 uttryck var signifikant korrelerade med lymfkörtelmetastaser ( P
= 0,009 och 0,024 respektive). Det fanns också ett signifikant samband mellan CCR7 uttryck och lymfatiska invasion ( P
= 0,012). Visade dock statistiskt analys att det inte fanns någon signifikant samband mellan CCR7 och foxp3 uttryck och andra kliniska egenskaper, såsom kön, ålder, tumörstorlek, differentiering och T klassificering.

Korrelation mellan CCR7 Positiv Score och Intratumoral foxp3 + cellantal

korrelationen mellan CCR7 positiv värdering och intratumoral fOXP3 ^{+ Treg cellantalet utvärderades i en längsgående bedömning. CCR7 positiv värdering av gastric cancerceller och intratumoral FOXP3 + Treg cellantalet skulle vara representerade i samma spridningsdiagram, från spridningsdiagram, två variabler verkade ha en linjär trend som skulle kunna genomföras linjär regressionsanalys. Och sedan montera två variabler i tillämpad statistik linjär korrelationsanalys utfördes för att ytterligare analysera deras korrelation. Resultatet visade att det fanns en signifikant positiv korrelation mellan CCR7 positiv värdering av gastric cancerceller och intratumoral FOXP3 + Treg cellantalet (r = 0,949, P Hotel < 0,001, Figur 4).}

Diskussion

i processen för tumör förekomst och utveckling, CCR7 på tumörcellytan som binder till sin ligand SLC kan främja tumörcellproliferation, angiogenes i tumörvävnad, och riktnings migration [24]. SLC /CCR7 komplexet kan orsaka celler att inducera aktin polymerisation, som är nära korrelerad med pseudopod bildandet av tumörcellen och nödvändig för dess invasion och metastas [25]. Tidigare studier har funnit att höga expressionsnivån av CCR7 i lungcancer, esofagus karcinom, hepatocellulär cancer, bröstcancer och melanom nära besläktad med tumörinvasion och lymfkörtel metastas [5] - [7], [26] - [28]. Således, oavsett CCR7 uttryck eller inte och nivån på dess uttryck kan direkt påverka cancermetastaser och prognos. CCR7 expression i vissa tumörceller även kan användas som molekylära markörer för att avgöra om tumörerna är metastatisk
[29]. Men dessa resultat och andra frågor som prognostiska faktorer behöver ytterligare forskning in vivo och klinisk bekräftelse.

Den nukleära transkriptionsfaktorn foxp3 har varit allmänt accepterat som den bästa markören för tregs identifiering hos människor hittills. Uttrycket av foxp3 i T-celler överensstämmer med immun reglerande funktion i tumören mikromiljö [30]. Tumör-infiltrerande foxp3 ^{+ tregs rapporterades ökas i en mängd olika tumörer [31] - [36]. Ett fåtal studier har också undersökt clinicopathologic betydelsen av tregs infiltration [32] - [34]. Marked infiltration av tregs i cancer stroma visade sig vara en ogynnsam prognostisk faktor i levern [14], [20], äggstocks [17], bröst [19], tonsill [32], bukspottskörteln [33] och kolon [34] cancer . Så vitt vi vet, om foxp3 + tregs är en ogynnsam prediktor för magcancer är fortfarande kontroversiell [37] - [39]}

I denna studie har vi undersökt huruvida CCR7 uttryck i gastric cancerceller. och intratumoral foxp3 ^{+ tregs var associerade med kliniskt patologiska faktorer och skulle kunna användas som en prognostisk indikator. I vävnads mikroarrayer av magcancer som samlats in från 133 patienter, som har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att utvärdera tumörprover [40] använde vi en immunhistokemisk metod för att undersöka uttrycksnivåer av CCR7 och foxp3 i magcancer vävnader. Hög CCR7 uttryck detekterades i 69,9% av 133 magcancer prover. Resultatet överensstämde med den tidigare studien av Mashino et al., Som har använt RT-PCR för att detektera 64 fall av magsäckscancer vävnadsprover, varav 68,8% av magcancer vävnader är CCR7 mRNA positivt uttryck [25]. Viktigt indikerade våra resultat att CCR7 uttryck i gastric cancerceller associerades med OS av Kaplan-Meier analys, patienter med högt CCR7 uttryck tumörer hade en signifikant kortare överlevnad än de med låg CCR7 uttrycks tumörer. Dessutom visade multivariat analys att CCR7 uttryck var en oberoende prognostisk indikator i magcancer. I vår serie, på samma sätt, med hjälp av Kaplan-Meier-analys visade resultaten att förekomsten av höga intratumoral foxp3 + tregs var signifikant relaterade till dåliga överlevnaden hos patienter med magcancer. Multivariat analys visade att intratumoral foxp3 + tregs kan också vara en oberoende prognostisk faktor för patienter med magcancer. Därför visade vår studie att både hög CCR7 uttryck och ökad intratumoral FOXP3 + tregs skulle kunna betraktas som en indikator på dålig prognos i magcancer.}

Ökande bevis visar att CCR7 kan spela en viktig roll när det gäller att styra tumörceller till de dränerande lymfkörtlarna och bidra till den frekventa närvaron av lymfkörtel metastas i cancerpatienter [7] - [9]. Den kemotaktiska SLC /CCR7 interaktion kan vara en möjlig mekanism för induktion av cancerceller av lymfkörtelmetastaser och vävnadsinvasion. Denna hypotes stöddes av våra resultat att den höga uttrycket av CCR7 signifikant korrelerade med närvaron av lymfkörteln metastasering och lymfatiska invasion. Associationen mellan expressionsnivån av foxp3 och kliniska egenskaperna hos de 133 patienter med magcancer ingick också i denna studie. Det var värt att notera att både CCR7 och foxp3 uttryck signifikant korrelerade med lymfkörtelmetastaser. Därefter erhålls utförde vi linjär korrelationsanalys för att hitta en signifikant positiv korrelation mellan CCR7 positiv värdering och intratumoral FOXP3 ^{+ Treg cellantalet. Dessa fynd visade att högt uttryck av CCR7 i gastric cancerceller och stor mängd intratumoral foxp3 + tregs infiltration kan spela en avgörande roll i lymfkörteln metastasering, och därför påverka behandlingsresultaten av magcancer.}

Vår studie bekräftar vikten av CCR7 uttryck i gastric cancerceller och intratumoral fOXP3 ^{+ tregs som prognostiska faktorer, som korrelerade med total överlevnad och lymfkörtel metastas i magcancer, i linje med de tidigare resultaten [25], [ ,,,0],38]. I den aktuella studien, var det intressant att antingen CCR7 uttryck eller intratumoral FOXP3 + tregs befanns vara en oberoende prognostisk faktor i magcancer. Detta är, såvitt vi vet, den första rapporten som visar att hög CCR7 uttryck i gastric cancerceller var parallellt med markant infiltration av intratumoral foxp3 + tregs i tumören mikromiljö. Ytterligare studier kommer att behövas för att förstå om blockad av SLC /CCR7 interaktion i kombination med foxp3 + tregs utarmning kan hämma metastas av gastric cancerceller till lymfkörtlarna, och leda till bättre behandlingsresultat eller inte.}

Sammanfattningsvis visade våra resultat att både hög CCR7 uttryck i tumörceller och ökad intratumoral fOXP3 ^{+ tregs associerades med sämre OS i magcancer, ett positivt samband med varandra, och kan betraktas som en co-indikator för klinisk prognos av magcancer. Baserat på detta, kan utveckla molekylära målet terapi mot CCR7 och foxp3 vara en lovande strategi för cancerbehandling.}

Bakgrundsinformation
figur S1.
Expression av CCR7 och foxp3 i normala gastriska vävnader. Representativa immunostainings för CCR7 och foxp3. Som kontrollerna fanns ingen CCR7 expression och mycket få foxp3 + tregs i normala gastriska vävnader. Skala bar, 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074430.s001
(TIFF) Review

• PLOS ONE: Helicobacter pylori-infektion synergistiskt med tre inflammationsrelaterade genvarianter i GWASs att öka risken för magcancer i en kinesiska befolkningen
• PLOS ONE: rött och bearbetat kött intag är förknippad med högre Gastric Cancer Risk: en meta-analys av epidemiologiska observationsstudier