Plos ONE: Roman Funkcionalna TagSNP Rs7560488 v DNMT3A1 Promotor je povezan z dovzetnostjo za Rak želodca s spreminjanjem Promotor Activity

Povzetek

DNK-metiltransferaza (DNMT) -3 a, ki vsebuje DNMT3A1
in DNMT3A2
izooblike so predlagali, da igrajo ključno vlogo pri rakotvornosti in pokazali zmotne izraz v večini rakavih obolenj. Nakopičene dokazi tudi navedla, da so polimorfizmi enega nukleotida (SNP) v DNMT genov, povezanih z občutljivostjo do različnih tumorjev. Domnevali smo, da genetske variante v DNMT3A1
promotor regiji so povezane s tveganjem za nastanek raka želodca. Izbrali smo tagSNPs iz baze HapMap za Kitajce in genotipizacijo v študiji primerov in kontrol za ocenjevanje povezave z rakom želodca (GC) v kitajskega prebivalstva. Ugotovili smo, da so funkcionalne tagSNP rs7560488 T > C povezana z znatno povečano tveganje GC. In vitro
funkcionalna analiza luciferaza novinar testom in EMSA navedla, da je tagSNP rs7560488 T > C bistveno spremenjeni transkripcijske aktivnosti DNMT3A1
gena preko vplivanja vezavo nekaterih transkripcijskih dejavnikov, čeprav je določen transkripcijski dejavnik je treba še določiti. V primerjavi s TT homozigoti, preiskovancev, ki so TC heterozigoti in CC homozigoti razstavljenih znižano izražanje DNMT3A1
. Poleg tega, slojevit analiza je pokazala, da so bili posamezniki, ki Harbor TC ali CC genotipov stare manj kot 60 let, bolj dovzetni za GC. Naši rezultati kažejo, da so genetske razlike v DNMT3A1
promotor prispevajo k dovzetnosti za GC in tudi vpogled, ki tagSNP rs7560488 T > C je lahko obetaven biomarkerjev za napovedovanje GC genetske dovzetnosti in dragocene informacije v GC patogeneze

Navedba. Wu H, Zhang K Gong P Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) Roman Funkcionalna TagSNP Rs7560488 v DNMT3A1 Promotor je povezana s Dovzetnost za Rak želodca s spreminjanjem Promotor aktivnosti. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10,1371 /journal.pone.0092911

Urednik: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kitajska

Prejeto: 22. december 2013; Sprejeto: 27. februar 2014; Objavljeno: 25. marec 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (Grant No. 81171915 in številka 91229107) in za znanstveno raziskovanje in načrt za inovacije za diplomirani province Jiangsu, Kitajska (Grant No. CXZZ13_0082). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je ena izmed najpogostejših malignih tumorjev na Kitajskem, zlasti v provinci Jiangsu z visoko stopnjo pojavnosti in umrljivosti [1], [2]. To se lahko širijo skozi želodec in druge organe, vključno z požiralnika, pljuč, limfnih žlez ali jeter. Zato, želodčni rak je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [3]. Ob upoštevanju terapevtske učinkovitosti, lahko kirurško resekcijo je primarna kurativno zdravljenje zgodnejši fazi bolnikov GC [4]. Na žalost, večina bolnikov z rakom želodca odkrili v fazi, v tem času pa so tumor neizrezljivega več. Poleg tega ponovitve po operaciji je še ena grozna dogodek za slabe 5-letno stopnjo preživetja. Glede na bolnikov z napredovalim ali ponavljajočih raka želodca, ni dvoma, da bi lahko odkritje biomarkerjev in njihove uporabe, skupaj s tradicionalnimi diagnozo dragocen pokazatelj in obsežno pomoč za oblikovanje strategije preprečevanja in zdravljenja. Vendar pa doslej pa je bilo ugotovljenih nekaj merljivih biomarkerjev za napovedovanje GC ponovitve.

tumorigeneze je znano, da je večstopenjsko proces, ki je posledica ne samo genskih sprememb, ampak tudi epigenetske spremembe [5]. DNA metilacija je glavna oblika epigenetske spremembe in igra pomembno vlogo pri razvoju, diferenciaciji, genomske stabilnosti, X-inaktivacije in odtis s specifično regulacije genske ekspresije. Najpogosteje študiral epigenetsko pojav DNA metilacija, bistven regulator transkripcije in kromatina strukturo. Neobičajne DNK vzorci metilacije v genetsko dovzetnega ozadju je lahko povezana s povečanim tveganjem niza človeških motenj [6] [7], vključno z GC [8]. DNMT3A
ki vsebuje DNMT3A1
in DNMT3A2
sta de novo
DNK metiltransferaz igra ključno vlogo v embrionalni razvoj in odklonskega DNA metilacije v rakotvornost. Nekateri polimorfizmi v DNMT3A
gena lahko uravnavajo izražanje genov, vplivati ​​na njegovo encimsko aktivnost in lahko prispevajo k dovzetnosti za raka. Nakopičene dokazi v molekularne genetike kažejo, da SNP v DNMT
geni so povezane z dovzetnostjo za raka [9], [10]. Nedavni napredek v v povezavi študije genoma vsej (GWAS), ki so bile ugotovljene tudi nove občutljivosti SNP za GC, ki je koristna za razumevanje mehanizma, genetskih razlik v razvoju GC [11] - [14]. Naša predhodna študija je pokazala, funkcionalna SNP rs1550117 v DNMT3A
promotor, ki se lahko poveča svoj transkripcijski dejavnost in prispevati k genetsko predispozicijo za raka želodca v kitajskega prebivalstva [15], [16].

GWAS je prinesla številne SNP, povezane s številnimi vrstami raka. V nekaterih primerih, na ducate SNP, imenovane tagSNPs ki predstavljajo SNP v regiji genoma z visoko genetsko neravnostežje lahko identificira genetske variacije brez genotipizacija vsakih SNP v kromosomsko regijo, tako da so tagSNPs uporabni v celotnega genoma SNP asociacijskih študij, kot je prostate, dojk, jajčnikov, kolorektalni in možganski rak [17] - [19]. V tej študiji smo izbrali tagSNP rs7560488 iz baze HapMap za kitajske predmeti za ovrednotenje povezave med genetskih variant v DNMT3A1
promotor in tveganja želodčnega raka v kitajskega prebivalstva. Ugotovili smo tudi, povezana tveganja rs7560488 T >. C polimorfizem v DNMT3A1
promotor, in naše nadaljnje delo je predlagal, da bi ta varianta spremeni aktivnost promotor in uničiti zavezujoče sposobnost transkripcijskih faktorjev

materiali in metode

Študijski predmeti

skupno 405 bolnikov s histološko potrjeni raka želodca in 408 kontrol rakavih brez so bili zaposleni v tej študiji primerov in kontrol ter značilnosti primerov in kontrol so podrobno predstavljeni v tabeli 1. zadevah in kontrol so usklajenih po starosti, spolu in so bili izbrani iz prve odvisnimi bolnišnici Nanjing Medical University. Vsi vzorci so bili pridobljeni s pisno privolitev in analizirali anonimno. Ta študija je bila izvedena z odobritvijo Medical etični odbor Medical School jugovzhodne univerze.

TagSNP Izbor in TF vezavno mesto Napoved

Glavna hipoteza temelji ta poskus je bil, da obstaja ena ali več SNP in v DNMT3A1
promoter regije, ki so povezane s tveganjem za raka želodca. Glede na vezavno neravnotežje (LD) strukture na določenem lokusu, lahko tagSNPs biti nadomestek za več tisoč drugih SNP. Domnevamo, da so taki tagSNPs verjetno označiti doslej ugotovljenih SNP v DNMT3A1
promotor tudi. Tako smo izbrali SNP v DNMT3A1
promotorja regiji z manjšo alelov frekvenco (MAF) o > 5% od obeh podatkovnih baz HapMap in dbSNPs. Za izvajanje potencialno funkcionalno izbor tagSNP, smo uporabili podatke iz Mednarodnega HapMap in prosto spletnih izbor orodij tagSNP izbrati tagSNPs in uporabo TF-iskalni algoritem (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH~~HEAD=dobj na .html) napovedati rs7560488 transkripcijski faktor (TF) vezavno mesto.

DNK Pridobivanje in HRM genotipizacijo

za študij DNMT3A1
promoter tagSNP rs7560488, genomsko DNA smo izolirali iz 1 ml periferne krvi bolnikov in zdravih posameznikov in je bila vzeta iz belih krvnih celic v enem tednu po odvzemu vzorca s proteinaze K prebavi kot je opisano prej [20]. TagSNP rs7560488 smo genotipizacijo z dsDNA barvila LC zelena v kombinaciji z visoko ločljivost taljenja analizo (HRM). Natančneje so bili PCR zasnoval LightScanner primer načrtovanje programske opreme (Idaho Technology) (naprej temeljni premaz: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 "Povratne premaz: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3), ki je produkt sam 208 bp fragment. Vsaka PCR reakcija je bila sprva izvedena v končnem reakcijskem volumnu 10 ul, z uporabo 25 ng genomske DNK, 0,2 pmol vsakega temeljnega premaza, 0,8 ul 2,5 mm dNTP, 1 xl 25 mM MgCl _{2, 1 xl 10 x Taq varovalni z (NH4) 2SO 4, 0.4 U Taq DNA polimerazo (Fermentas), 1 ul 1X LC Green PLUS (Idaho Technology) in 0.4 xl dimetilsulfoksid (DMSO). Reakcijsko zmes inkubiramo pri 95 ° C za 5 minut in nato izpostavimo 40 ciklov 95 ° C za 30 sekund, 57 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 30 sekund, nato pa 72 ° C 7 minut uporabo toplotno ciklerja PTC-200 (Bio-Rad). Reakcije PCR smo prenesli na plošče s 96 vdolbinami za (Bio-Rad) in analizirali na Light Scanner (Idaho Technology). Podatki fluorescence zberemo v temperaturnem območju 70-97 ° C, in analiza taljenje krivulja je bila izvedena v skladu s programsko opremo proizvajalca. HRM lahko neposredno diskriminacijo na heterozigotnosti (TC) in homozigoti (CC ali TT) genotipov tagSNP rs7560488 T > C preko taline skeniranje. Po mešanju homozigoti DNA z enako količino znanih PCR produktov (npr CC), nadalje razlikujemo med CC in TT genotipov. Za dodatno potrditev, je bilo 5% vzorcev iz vsake s HRM odkritih skupina naključno izbranih in podvržen zaporedja DNK za zagotavljanje zanesljivosti in ponovljivosti.}

Gradnja luciferaze Reporter plazmida

za gradnjo DNMT3A1 tagSNP rs7560488 reporter plazmid smo pomnožili 948 bp fragment od 25422345 do 25422345 z DNMT3A1
promotor regija, ki vsebuje alel T in C za SNP s PCR iz genomske DNA. Se primerji, ki se uporabljajo za ojačanji PCR so bili: (Forward: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', Hrbtna stran: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). PCR produkt smo subklonirali v restrikcijskima mestoma Nhel in HindIII v pGL3-Basic vektor (Promega, Madison, WI). Preverili smo vse rekombinantnih klonov sekvenciranje DNK.

prehodna Transfekcija in Dual luciferazni reporterskega testa

Human želodčni rak AGS in BGC-823 celice (ATCC) gojimo v RPMI-1640 medij dopolnjena z 10 % seruma volovskega zarodka (FBS) in 1% raztopina penicilina /streptomicina (10 000 U /ml in 10 mg /ml, v tem zaporedju). AGS in BGC-823 celice (1 x 10 ^{5) smo posejali v gojitvenih ploščah 24-ter. Po 24 urah kulture, so AGS, BGC-823 celice transficirane s Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) z 0,8 mg vsake zgrajene vektorja, bodisi z alel T ali alel C. Hkrati je bilo 10 ng PRL-TK plazmidov (Promega) na vrtino transfektirali tudi kot notranji nadzor za odpravo učinkovitosti transfekcije. Pred njim, smo celice zasejali v 24-vdolbinami čez noč, da se zagotovi 90% -95% strnjene ob transfekciji. Štiriindvajset ur po transfekciji smo luciferazno aktivnost merjena z dvojno luciferazni reporterskega testa sistema (Promega, Madison, WI, ZDA) in izražen kot razmerje Firefly luciferaze do Renilla luciferaze aktivnosti. Vse celice so bile izvedene v treh izvodih z istimi pogoji. Tri neodvisne transfekcijske poskuse smo izvedli, in vsak luciferazo test smo izvedli v treh izvodih.}

Shift Elektroforetskimi mobilnost Vsebnost (EMSA)

5'-Biotinilirane oligi 25 bp dolžine so bili pridobljeni iz Beijing Genomics Institute (BGI). Oligo sekvence so rs7560488 [T] Forward: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] Povratne: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3 ". rs7560488 [C] Forward: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] Povratne: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3 ". Za žarjenje, koncentriramo komplementarni oligonukleotidi pomešamo v razmerju 01:01 molskem in inkubirali pri 95 ° C za 5 minut in nato postopoma zmanjša več ur, dokler oligonukleotidi sobno temperaturo. Strjeni oligi smo razredčili do končne koncentracije 10 fmol. Jedrske proteini so bili pridobljeni iz BGC-823 celic, ki uporabljajo NE-PERTM jedrski in citoplazme Pridobivanje reagentov (Pierce, Rock-ford, IL, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. LightShift kemiluminescenčni EMSA kit (Pierce /Thermo Fisher Scientific) je bila uporabljena v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko smo vezavo reakcije izvedemo takole: jedrske ekstraktov (8 mikrogramov proteina) in 1 x vezave pufer z 2,5% glicerola, 5 mM MgCl2, 50 ng /ul poli (di-DC), 0,05% NP-40, in 60 fmol-biotin označeni rs7560488 T /C rs7560488 sonde smo inkubirali na ledu 30 minut v volumnu 20 ul. Za študij konkurence so jedrskih ekstrakte inkubiramo z neoznačenega oligonukleotidom za 30 minut pred dodatkom označenega oligonukleotida. Za superpremikom, je AP-1 protitelesa na dodano vrednost (BOSTER, Kitajska). Kompleksi ločimo z elektroforezo na rodni 6% STRANI v 0,5 × TBE pufru pri 110 V. geli so bile prenesene na biodyne B pre-cut spremenjenih najlon membran (pierce /Thermo Fisher Scientific), ki uporabljajo Trans-Blot SD polsuhega prenosa celico ( Bio-Rad Laboratories). Membrane so navzkrižno povezani (UVC-508 UV Cross-povezovalnik, Ultra LUM) in signal je bil zaznan s sistemom kemiluminescenčni zaznavanje (Pierce /Thermo Fisher Scientific), v skladu z navodili proizvajalca.

Odkrivanje DNMT3A1 Indeks s kvantitativnim RT-PCR (Q-PCR)

za nadaljnje odkrivanje korelacije med DNMT3A1 mRNA ravni in rs7560488 polimorfizma so 44 želodčni rak tkiva z različnimi genotipi so bili podvrženi pridobivanju celotne RNA z uporabo TRIzola Reagent ( Invitrogen, Inc.). Stopnja DNMT3A1 mRNA je bila merjena s kvantitativno PCR v realnem času po reverzno transkripcijo na Prism 7900 Real-Time PCR stroj (Applied Biosystems, Foster mesta, CA). β-aktin uporabimo kot interni kvantitativne kontrole za vsak vzorec. Se primerji, ki se uporabljajo za DNMT3A1 pomnoževanje bili F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'in R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; primerji za P-aktina bili F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'in R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Relativna kvantifikacija DNMT3A1 mRNA je bila izračunana po metodi 2-ΔΔCT, in vsak test smo naredili v treh izvodih.

Statistične analize

Vsi podatki so bili analizirani s SPSS
različica 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Bolniki in kontrole smo primerjali s pomočjo študentov je t
-test za zveznih spremenljivk in (χ2) testa hi-kvadrat za kategorične spremenljivke. Alelov in genotipov med kontrolnimi in GC predmetov so bili pridobljeni s pomočjo hi-kvadrat test, in standard dobrota-of-fit testu smo uporabili za testiranje Hardy-Weinberg ravnovesje. A P
vrednost manj kot 0,05 smo upoštevali kot statistično značilne.

Rezultati

Lastnosti študijskih predmetov

frekvenčne porazdelitve primerov in kontrol so predstavljeni v tabeli 1, ni bilo bistvenih razlik v razdelitvi frekvenc med primerih in kontrolah (p = 0,243 za starost in P = 0,355 za seks). Povprečna bolnikov in kontrol je bila 59.8 let (razpon 20~93 let) in 60,6 let (razpon 25~90 let) oz. Ni pomembna razlika je bila najdena v povprečni starosti in spola, kar nakazuje, da je ujemanje na podlagi teh dveh spremenljivk je bilo ustrezno.

Zadeva tagSNP Izbor in genotipizacijo

Med SNP kandidatke DNMT3A1
smo se osredotočili na tagSNPs v promotor DNMT3A1
in napovedal svojo morebitno funkcijo na zavezujoče transkripcijskih faktorjev, ki vplivajo na kakovostno in količinsko izražanje DNMT3A1
. Uporabili smo, ki temelji na LD izbiro tagSNP algoritem (r ^{2≥0.80, MAF≥5%), ki sta dve tagSNPs predstavlja skupno genetske variacije v CHB prebivalstva, vključno kandidata tagSNPsrs7560488 in rs1550117, ki je funkcionalno polimorfizem, ki spreminja občutljivost na raka želodca smo potrdili prej [15], [16]. TFSEARCH algoritem napovedal, da rs7560488 T ustvarja vezavno mesto za AP-1 (slika 1). Vzorci za genotipizacijo s človeškimi viri in zaporedja z ABI 3730 avtomatizirano sekvencer zaporedju (slika 2)}

TagSNP rs7560488 Variant T >. C v DNMT3A1 Promotor bistveno poveča tveganja za GC

distribucij genotipom in alelov frekvence rs7560488 so prikazani v tabeli 2. genotipov pri kontrolah so bili v dogovoru z vzorcem Hardy-Weinberg (P = 0,274). Kot je prikazano v tabeli 2, so genotip frekvence rs7560488 68,9%, 27,4% in 3,7% za TT, TC in CC genotipov med primerih, in 79,9%, 18,4% in 1,7% med kontrolami, oziroma, razlika med primeri in kontrolah bila statistično signifikantna (P < 0,05). Poleg tega je alel frekvenca T bistveno nižji izmed primerov kot kontrole (82,6% v primerjavi z 89,2%, P = 0,000). Poleg tega je bil skupni genotip frekvenca TC /CC višja pri primerih, ki niso nadzora (31,1% proti 20,1%, P = 0,002). Pri sprejemanju TT genotip in alel T kot referenca, smo ugotovili, da so bile variantne genotipi (TC in CC) povezana s povečanim tveganjem za GC (OR = 1.653, 95% CI = 1.194-2.287; P = 0,002). Prav tako smo tudi ugotovili, da bi bil alelov frekvence C statistično značilno večji kot kontrole (OR = 1.744, 95% CI = 1.310-2.321; P = 0,000). Če povzamemo, ti podatki kažejo, da so bile TC in CC genotipe, povezane z genetsko predispozicijo za GC; DNMT3A
1 rs7560488 alel T lahko domnevni zaščitni alel. Ni bilo pomembnih različne frekvence rs7560488 v GC v starostni skupini > 60 let v primerjavi z ≤60 let (P = 0,756), in moški v primerjavi z žensko (P = 0,459) (tabela 3)

Posamezniki Manj kot. 60 let so bolj dovzetne za rak želodca z tagSNP rs7560488 Variant T > C

Starost in spol so pomembni dejavniki pri tumorja rakotvornost, vključno z rakom želodca. Ko so analize razdeljeni glede na starost in spol bolnikov, smo ugotovili, da so opazili značilno povezavo, posamezniki, ki opravljajo TC /CC genotipov so bile povezane z genetsko predispozicijo za GC tako v moški in ženski skupini. Zato je rs7560488 alel C bistveno povečala dejavnik tveganja v primerjavi s alel T (tabela 4). Dodatna razčlenjenost ocenili združenje rs7560488 T > C z rakom želodca v različnih starosti. TC /CC genotipi so bili povezani z genetsko predispozicijo za GC v starostni skupini ≤60 let (OR = 1,794; 95% CI = 1,118-2,877; P = 0,015), ki ni starejše od 60 let, prav tako smo ugotovili tudi, da je C alelov frekvence je bil statistično značilno večji od kontrol (OR = 1.720, 95% CI = 1.127-2.622; P = 0,011). Ti rezultati kažejo, da so bile TC in CC genotipe, povezane z genetsko predispozicijo za GC, zlasti pri posameznikih ne več kot 60 let (tabela 4)

rs7560488 T >. C Variant vpliva DNMT3A1 Transkripcijska Activity

Za oceno biološko funkcionalni učinek rs7560488 polimorfizma na DNMT3A1 transkripciji smo zgradili reporter vektorjev luciferaza (pGL3), ki zajema osnove 4.389.823 na 4.390.770 s DNMT3A1
promotor, bodisi z divjega tipa (alela T) ali mutant tip (alel C) in jih transfektiramo v BGC-823, AGS celice (slika 3A). Kot je prikazano na sliki. 3B, smo ugotovili, da je bil prepis dejavnost alel T višja od alel C s približno 2-krat v zgoraj dveh celičnih linijah, kar kaže, da alel rs7560488 T delal kot gol za rakom želodca s povečanjem transkripcijo DNMT3A1

rs7560488 T >. C Variant zaduši Transcription Factor Affinity

Glede na tagSNP rs7560488 se nahaja v DNMT3A1
promotorja regiji; smo predpostavili, da bi se spremenila vezave transkripcijskega faktorja (TF). Dejansko uporabo TF-iskalni algoritem (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html~~HEAD=dobj), potem smo napovedali, da rs7560488 T ustvarja TF vezavno mesto za AP-1. Za določitev, ali ima ta polimorfizem vpliva na vezavo sposobnost transkripcijskega faktorja, smo izvedli elektroforetsko shift mobilnost testa (EMSA) za analizo vezave oligo sond, ki vsebujejo bodisi T ali alel C za jedrske beljakovin, pridobljenih iz AGS celice. Kot je prikazano na sliki. 4A, posebno premaknilo DNA /proteinski kompleks skupina jedrskih je ustvarila obe C in T alelov sonde (proge 2 sl. 4 A, 5). Vendar alel T še niso bili v celoti konkurenčni zaviral (sl. 4A linija 4), čeprav je bil premaknilo skupina ukinjena s 50-kratno neoznačeni sonde C (sl. 4A voznega pasu 1), kar kaže, da zavezujoča dejavnost zaporedja vsebuje rs7560488 alel T je močnejši v primerjavi z alel C in transkripcijskega faktorja lahko prednostno veže alel T namesto alel C. Poleg tega, super-EMSA uporabo AP-1 protitelesa niso povzročile superpremikom o-biotina označeno sondo /jedrske proteina (sl. 4 B pasu 2, 5), kar kaže, da se AP-1 ne sme transkripcijski faktor, ki se veže na promotorsko regijo vsebuje alel T ali C. Ti rezultati so pokazali, da bi lahko alel rs7560488 C zmanjša aktivnost vezave jedrska protein, čeprav je vpliv, ki ga je transkripcijski faktor AP-1 ne vpliva.

zveza med DNMT3A1rs7560488 polimorfizem in izražanjem DNMT3A1
mRNA

Štirideset-štiri želodčni rak tkiva z različnimi genotipi DNMT3A1 rs7560488 so bili na voljo v naši tej študiji. Zaradi nizke frekvence CC genotipa, smo dodali v vzorcih z TC genotip za analizo. Kot je prikazano na sliki. 5, stopnje izraženosti v DNMT3A1 mRNA je bila nižja pri osebah s TC ali CC genotip kot pri tistih, ki imajo TT genotipa (P < 0,05)

Pogovor

Genome vsej Hipometilacija in promotor hypermethylation so. značilnosti veliko različnih vrst raka, ki prispevajo k tumorigeneze in DNA metilacije igra ključno vlogo pri uravnavanju izražanja genov in ohranjanju genomske stabilnosti [21], [22]. DNA metilacija opravlja metiltransferaz DNK (DNMTs) DNMT1
, DNMT3B
in DNMT3A
[23], [24]. de novo
metiltransferaz DNMT3A
so zelo izražene v zgodnji fazi razvoja zarodka in dol-urejeno v večini diferenciranih somatskih celic [25]. Vloga DNMT3A
in rakom pri ljudeh je bila poudarjena zaradi poročil o DNMT3A
mutacij pri približno 20% bolnikov z akutno mieloično levkemijo [26], [27]. Pojav teh mutacij soodvisnih z zmanjšano encimsko aktivnostjo in genomskih regij z zmanjšano metilacije. DNMT3A
mutacije so bile ugotovljene tudi pri 8% bolnikov z mielodisplastičnega sindroma [28]. DNMT3A
prav tako igra ključno vlogo pri epigenetske utišanje hemopoetičnih matičnih celic (HSC) regulatornih genov in omogoča učinkovito diferenciacijo [29].

DNMT3A
genomske locus proizvaja dve kopiji, ki povzročajo dveh proteinov, dlje DNMT3A1
in krajše DNMT3A2
, ki se razlikujejo po tem, da je 219-amino kisline amino (N) terminalu rep prisotna le še v DNMT3A1
[30], [31]. N-terminalna domena DNMT3A1
se imenuje "nadzorne" domene, ker nima encimsko DNA metiltransferaze dejavnost. Ta domena ne delijo znatno homologijo s katero koli drugo znano proteina. DNMT3A1
je skoncentrirana v heterokromatin, ki se šteje za transkripcijsko tiho in deluje predvsem kot transkripcijski represije [30]. Toda druga raziskava je pokazala, da je DNMT3A1
je uspešno zaposlila na utišati UPB3 /4 in aktivnega vitronektin (VTN) promotorjev genov preko svojega edinstvenega N-terminal področju [32].

To je bila prijavljena da so genetske razlike v DNMT3A
gena prispevajo k rakotvornost še posebej povezano z GC [15], [33] - [36]. Nato se predlaga nadaljnje raziskovanje razmerja med SNP in translacijskih uredbe na ciljnih genov. Ampak, ugotavljanje biološke funkcije za vsak SNP pogosto zahteva zamudno, molekularne poskuse biologija. Tako analizo velikega števila SNP, povezanih z vsako posamezno rastišče v praksi zahteva sistematično vrednotenje bioinformatiko in prednostnih nalog, da omejite niz, ki bi funkcionalnih variant kandidatk. Ker je večina SNP v LD, so združenje študije temelji na oceni haplotiski šteje močnejša od posamezne analize SNP ugotoviti vzročno genetskih variant, na katerih temelji etiologijo kompleksnih bolezni, kot so rak [37], poleg tega je uporaba tagSNPs, ki zajemajo večina haplotypic raznolikosti v asociacijskih študijah je bilo predlagano, [38]. Čeprav je GWAS prinesla številne SNP ali tagSNPs bistveno povezanih z rakom, večina tagSNPs najdemo v ne-beljakovinskih kodiranja regijah (medgenskega in intronskih regije), ki opredeljujejo njihove funkcionalne in /ali vzročnih variant ima kljub za pomembno omejitev interpretacijo podatkov GWAS dodeljevanje domnevno funkcionalnost mnoge druge GWAS tagSNPs je bila uspešna le, če je v redu preslikava po znanem območju tveganja izvaja [39] - [41].

v tej raziskavi smo izbrali domnevni funkcionalne tagSNP rs7560488, ki lahko predstavljajo SNP za DNMT3A1
promotor z visoko genetsko neravnostežje, je mogoče identificirati genetske variacije brez genotipizacije vsak SNP v DNMT3A1
promotorja regiji ter izboljšanje učinkovitosti združevanja. Opazili smo, da subjekti, ki tagSNP rs7560488 TT genotipov razstavljene bistveno zmanjša tveganje za nastanek raka želodca v primerjavi z osebami z TC ali CC genotip, kar kaže, da je alel T zaščitni učinek bi lahko razstavili v tej tagSNP. Poleg tega analize smo izvedli pod dodatne dokaze, da je TC in CC genotip povezana z manjšo stopnjo izražanja DNMT3A1
mRNA v želodčnih tkiva raka, rezultati kažejo, da je DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T >C polimorfizem lahko uravnavajo izražanje DNMT3A1
in s tem prispevati k GC občutljivosti. Ti podatki prav tako pokazala, da lahko DNMT3A1 igrajo vlogo pri napredovanju raka želodca, vendar je treba to ugotovitev je treba potrditi z večjo populacijski študiji. Kolikor nam je znano, je to prvo poročilo in dokazuje, da je DNMT3A1
prepis neposredno vpliva funkcionalnih tagSNP rs7560488 v DNMT3A1
promotor regija in tagSNP rs7560488T > C je bilo povezano z znatno povečal tveganje GC. Dalje, smo izvedli EMSA poskus analizirati biološke posledice tagSNP rs7560488 polimorfizma v BGC-823 celic. Tako alel T in alelov sonde C pokazala dva gel-shift pasove, vendar konkurenco poskusi so pokazali, da afiniteto do jedrskih beljakovine, ki jih T alel sonde varianta je večja od tiste, kot pri kolegu C alel sonde. Torej lahko okrepila sposobnosti vezave alela T DNA-protein odgovoren za povečano DNMT3A1
promotorja dejavnosti, ki smo opazili v naših promotorja testih. Super-EMSA Eksperiment AP-1 protitelesa ni dobil super-gel premik je pokazala, da transkripcijske faktorje AP-1 ne smejo vključiti v oblikovanju transkripcijskih kompleksov na rs7560488 mestu tagSNP. Še en roman rezultat izhaja iz povezave med starostjo in rs7560488 T > C polimorfizem v razslojeni analizi je pomenilo, da so bili stari manj kot 60 let, bolj dovzetni za raka želodca z tagSNP rs7560488 T > C. Verjetno je, da DNMT3A1
vpliva na transkripcijo specifičnih genov posebej in spremembe v določenih genov poveča tveganje za GC. Ti rezultati kažejo, da je močnejši dejavnik tveganja za GC tagSNP rs7560488 T > C, še posebej v mladosti

Če povzamemo, ta študija je prva sistematično vpogled v to, kako je ta nova funkcionalna tagSNP rs7560488 T >. C varianto je bistveno povezan s tveganjem za raka želodca v kitajskega prebivalstva. Ugotovili smo, da je T na spremembo C bistveno spremenjeni transkripcijske aktivnosti ostaja DNMT3A1
gen preko vplivanja vezavo nekaterih transkripcijskih faktorjev in tako spremeniti DNMT3A1 raven izražanja, čeprav dokončno transkripcijskih dejavnikov, ki jih je treba določiti. Naše ugotovitve omogočiti vpogled, ki DNMT3A1
promotor rs7560488 T >. Sprememba C je obetaven biomarker za oceno populacije občutljiva na GC in dragocene informacije za prihodnje raziskave v želodcu patogenezi raka

Zahvala

zahvaljujemo se prof Yaping Wang, dr Zhenming Cai, Lili Cao (Nanjing University, Nanjing, Kitajska) in zhenghao Zhang (jugovzhodne University, Nanjing, Kitajska) za HRM genotipizacijo.

• Plos ONE: Co-Dostava doksorubicinom in SATB1 shRNA s toplotno magnetno kationskih liposomov za želodca raka terapije
• Plos ONE: Klinična in prognostičnih Pomen HIF-1 a, PTEN, CD44v6 in survivin za želodca raku: metaanalizi