PLoS ONE: Affinity Созревание моноклонального антитела 1E11 целенаправленными рандомизации CDR3 регионов Оптимизирует Терапевтическое антитело, воздействующее на HER2-позитивного рака желудка

Абстрактный
<р> против HER2 мышиный 1E11 моноклональное антитело обладает сильным и синергетический противоопухолевую активность в HER2-гиперэкспрессией клеток рака желудка при использовании в сочетании с трастузумаб. В настоящее время мы оптимизировано это антитело для терапии человека. Во-первых, определяющие комплементарность области (CDR) мышиного антитела были привиты к зародышевой линии человека вариабельных генов. Не наблюдалось различий в аффинности и биологической активности между химерного 1E11 (ch1E11) и гуманизированного 1E11 (hz1E11). Далее, близость созревание hz1E11 проводили рандомизации CDR-L3 и H3 остатков с последующим строгим отбора биопэннинга. Милдер давление отбора благоприятствования выбор более разнообразных клонов, в то время как выше, выбор строгость привела к сходимости панорамирование выхода на меньшее число клонов с улучшенной аффинностью. Клон 1A12 имел четыре аминокислотные замены в CDR-L3, и показал 10-кратное увеличение сродства по сравнению с родительским клоном и повышение потенции в тег в пробирке
антипролиферативным анализ активности с HER2-overepxressing рака желудка клетки. Клон 1A12 ингибирует рост опухоли модели ксенотрансплантата NCI-N87 с одинаковой эффективностью в одиночку трастузумаб, и комбинированное лечение 1A12 и трастузумаба полностью устранило раковых опухолей. Эти результаты свидетельствуют о том, что гуманизированное и зрелой аффинностью моноклональное антитело 1A12 является оптимизированная молекула для будущего терапевтического развития против HER2-позитивных опухолей
<р> Образец цитирования:. Ко BK, Choi S, Цуй LG, Ли YH, Hwang И.С., Ким КТ и др. (2015) Affinity Созревание моноклонального антитела 1E11 целенаправленными рандомизации CDR3 регионов Оптимизирует Терапевтическое антитело, воздействующее на HER2-позитивного рака желудка. PLoS ONE 10 (7): e0134600. DOI: 10.1371 /journal.pone.0134600
<р> Редактор: Mitchell Ho, Национальный институт рака, NIH, США
<р> Поступило: 14 апреля 2015 года; Принято: 12 июля 2015 года; Опубликовано: 30 июля 2015
<р> Copyright: © 2015 Ko и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано AbClon Inc., и Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF) гранта для HS-исследовательского центра Medicinal Bioconvergence (СРН-2013M3A6A4044991) , Коммерческий финансирующей (AbClon Inc.) оказывал поддержку в виде заработной платы для авторов (БКК, SC, LGC, YHL, ISH, KTK и JSL), но не было никакой дополнительной роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «взносов автора»
<р> Конкурирующие интересы:. БКК, SC, LGC, YHL, ISH, KTK и JSL все нанятых AbClon Inc. и могут приобрести ее акции. ГС на платной консультации для AbClon Inc., а также владеет ее акций. Abclon проводит патенты и разработки продукта по соединениям, которые упомянуты в этой статье. БКК, SC, LGC, YHL, ISH, KTK и JSL все используемые в настоящее время коммерческой спонсору этого исследования AbClon Inc. и может владеть свой запас. HS в настоящее время на платном консультационные услуги AbClon Inc., а также владеет ее акций. AbClon имеет зарегистрированный патент в Корее (KR10-1453462, антитела, способные специфически связываться с HER2) и подал заявку РСТ (PCT /KR2014 /004317, антитела, специфически связывающиеся с HER2), в котором БКК, YHL, ISH, KTK и JSL перечислены в качестве изобретателей. AbClon также осуществляет разработку продукта на гуманизированных, аффинно зрелые антитела, которые упомянуты в этой статье. Они не изменяют приверженность авторов всех политик PLoS ONE данных и материалов общего доступа.

Введение

Моноклональные антитела представляют собой основные методы лечения в онкологии и аутоиммунных заболеваний, и, как ожидается, играют важную роль в будущем лечения заболевания [1, 2]. Более 30 рекомбинантные антитела в настоящее время одобрены продуктами и лекарствами США, из которых примерно половина из них противораковые антитела. Рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака и является третьей ведущей причиной смерти от рака во всем мире [3]. При раке желудка, повышенная экспрессия рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), эпидермального роста человеческого рецептора фактора 2 (HER2), и HER3 коррелирует с плохим прогнозом [4, 5]. В последнее время HER2 нацеливание моноклональное антитело трастузумаб был одобрен для лечения HER2-положительным метастатическим раком желудка и желудочно-пищеводного соединения на основе результатов трастузумаб с химиотерапией в HER2-положительным раком желудка (ТОГА) клинических испытаний [6].
<р> Конкретные комбинации взаимно неконкурентных антител с таргетингом на противоопухолевую активность рецептора такое же увеличение в пробирке
и в естественных условиях
. Сочетание HER2 ориентации антител, трастузумаб и Пертузумаб, показывает повышенную эффективность в HER2-гиперэкспрессией случаев рака молочной железы [7]. Преимущества комбинации Пертузумаб и трастузумаба были дополнительно продемонстрирована в доклинических и клинических исследованиях [8, 9]. Другие HER2-нацеливание антитела, демонстрирующие более высокую эффективность, чем в комбинации в качестве отдельных агентов, и показали, последовательное понижающей регуляции уровней HER2 и полезных комбинации эффектов в моделях мышей [10]. Повышенная эффективность комбинаций антител также была продемонстрирована с EGFR-нацеливание антител [11, 12] и фактора роста эндотелия сосудов рецептора 3 (VEGFR3) -targeting антител [13].
<Р> Терапевтические антитела, как правило, широко инженерии обладают желательными биологическими и физико-химическими свойствами, такими как низкой иммуногенностью, высокой аффинностью и специфичностью, оптимальные эффекторные функции, а также хорошей растворимостью и стабильностью [14]. В частности, гуманизацию антитела и аффинное созревание являются два из наиболее часто применяемых технологических процессов при разработке терапевтических антител кандидатов. Иммуногенность терапевтического антитела ограничивает клиническую полезность и эффективность при производстве антинаркотических антител [15], и гуманизация антител от мыши или других видов в настоящее время является стандартной процедурой для разработки терапевтических антител. Несколько методов гуманизации были разработаны, которые используют либо рациональные или эмпирические подходы [16]. Определяющего комплементарность области (CDR) прививка подход как метод преодоления реакции человеческого анти-химерные антитела (HACA) [17] является хорошо признанным методом гуманизация. Тем не менее, прямая прививка мышиных CDR, на человека каркасной последовательности акцептора часто приводит к потере сродства, так что обратно-мутации каркасных областей остатков (Верньерные зон остатков), поддерживающих структуру CDR петли часто необходимо [18]. Для в пробирке
аффинное созревание, как правило, используются три подхода диверсификации: случайного мутагенеза с помощью, например, подверженной ошибкам ПЦР, рандомизации целевых остатков с использованием вырожденных олигонуклеотидов и перетасовки цепей. В целевом рандомизации подходе, CDR, являются логическим мишенью для рандомизации в большинстве случаев, потому что соматические гипермутация эволюционировала в пользу мутации в CDR-антител [19], и CDR-H3 и CDR-L3, как правило, доминируют взаимодействия антитело-антиген [ ,,,0],20]. Одной из основных проблем, связанных с целевым рандомизации выбора позиции, которые не являются необходимыми для связывания антигена, но которое может усилить сродство, когда оптимальная замена аминокислоты сделать. Сканирование Аланин может помочь определить остатки рандомизировать, особенно когда CDRs длинные. Иногда сама аланин увеличивает сродство антител [21].
<Р> Ранее мы разработали мышиное антитело, воздействующее на HER2 (клон 1E11), который показывает синергетический противоопухолевую активность в сочетании с трастузумаб в HER2 гиперэкспрессией желудка клеточных линий рака [22 ]. В этом докладе мы опишем, как мы оптимизировали 1E11 для терапевтического антитела с помощью CDR прививкой к человеческой зародышевой вариабельных генов и созревание аффинности посредством целенаправленного рандомизации CDR-H3 и CDR-L3. Оптимизированная 1E11 антитела (клон 1A12) показывает синергетический противоопухолевую активность в HER2-положительным желудочных моделей ксенотрансплантатов рака в сочетании с трастузумаб. Было отмечено, что для клона 1E11, зародышевые вариабельные гены человека являются подходящими акцепторами для гуманизации без сродства сокращения, и замена CDR-L3 остатков, которые не являются необходимыми для связывания антигена было достаточно, чтобы повысить аффинность более чем в 10 раз.

материалы и методы

клеточные линии и материалы

NCI-N87 клетки были приобретены у американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA, США) и OE-19 клетки были получены из Европейской коллекции клеточных культур (ECACC, Портон, Великобритания). Среда для культивирования клеток была RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и антибиотики, и клетки культивировали при 37 ° С в атмосфере 5% CO <югу> 2. Трастузумаб и Palivizumab был произведен Genentech (South San Francisco, CA, США) и MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, США), соответственно. ChromPure человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США) использовали в качестве человеческого контрольного антитела IgG в течение в пробирке
анализов. IgG-антитела, полученные с использованием системы Фристайл 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и очищали с помощью протеин-А аффинной хроматографии (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Эндотоксин удаляли с помощью комплекта эндотоксина удаления (GenScript, Piscataway, Нью-Джерси, США), и уровни эндотоксина определяли с использованием набора для обнаружения относительно эндотоксина (GenScript). Рекомбинантные белки были получены в виде секретируемых белков с использованием Freestyle 293 системы и очищают с помощью протеин-А или Ni-NTA хроматографии (Qiagen, Valencia, CA, USA) для Fc-меченый или His-меченых белков, соответственно.

аланин-сканирующий мутагенез и Fab-очистка
<р> Сайт-направленный мутагенез для сканирования аланина проводили с помощью ПЦР-мутагенеза с использованием QuickChange сайт-направленного мутагенеза Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). выражались и очищены, чтобы оценить важность каждого остатка для связывания антигена активности мутантных белков Fab. Короче говоря, кишечной палочки
клетки DH5 &alpha трансформируют вектором pComb3X укрывает мутантные гены Fab выращивали при 28 ° С в СО бульоне. Экспрессию индуцировали 1 мМ изопропил- β -D-1-тиогалактопиранозид, когда оптическая плотность (600 нм) культуры достигала 0,8. Клеточный осадок ресуспендировали в охлажденном буфере для экстракции (120 мМ Трис, рН 8,0, 0,3 мМ ЭДТА, и 300 мМ сахарозы), и инкубировали на льду в течение 30 минут для периплазмической экстракции. Хлорид магния (2,5 мМ) добавляли к осветленного экстракта после центрифугирования дл выведени свободного ЭДТА перед иммобилизованным ионом металла для аффинной хроматографии (IMAC) очистки. Очищенные Fab белки использовали для анализа связывания ELISA и к
<югу> от анализа с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Affinity Созревание
<р> Гуманизированные 1E11 клонировали в векторе pComb3X в формате Fab был использован в качестве шаблона для расширения перекрытия полимеразной цепной реакции (ПЦР) мутагенеза, как описано ранее [23]. Вырожденные олигонуклеотиды (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(обратный) и 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Вперед), были использованы для библиотеки L-NNK и Н-XXS, соответственно. N обозначает A, C, G или T; М представляет собой С или А; и S является G или C. Номерные базовые позиции указывают на ручной смешанных нуклеотиды, состоящей из 70% от одного основания и 10% каждого из остальных трех оснований: 70% базовой частоты G, А, Т, и С в течение 1, 2, 3, и 4, соответственно. Для библиотеки Н-2AA, использовались эквимолярной смеси следующих вперед мутагенных олигонуклеотидов: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ', и 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K обозначает G или T. После двух раундов расширения перекрытия ПЦР, Fab библиотеки ДНК с рандомизированном CDR разрезали SFII, лигировали в SfiI-переваренной фагмидного вектора pComb3X и электропорации в E
. палочка
штамм ER2537 (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс, США).
<Р> Высокие вяжущие сродства были выбраны с использованием растворимого биотинилированного белка HER2-ECD. Bead связующие предварительно истощены путем инкубирования антитела фаговой библиотеки со 100 мкл предварительно блокированного Dynabeads М-280 стрептавидина (Invitrogen) в течение 1 ч при медленном вращении, при комнатной температуре. Биотинилированные HER2-ECD белок (100 NM- 12:01 вечера) добавляли к предварительно обедненного библиотеки антител и инкубировали в течение 1 часа с вращением при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл блокированных стрептавидином магнитные гранулы, и инкубировали на ротатор в течение 15 минут. Шарики промывают 10 раз 1 мл Трис-забуференного физиологического раствора Tween 20 (TBST), и дважды 1 мл PBS. Св занные фаги элюируют путем инкубирования бусин с 1 мл 100 мМ триэтиламина в течение 8 минут, затем нейтрализовали 0,5 мл 1 М Трис, рН 7,4.

ELISA, связывающая активность тест
<р> были добавлены антитела к Costar 96-луночных планшетах половине листа (Corning, Corning, NY, США № продукта 3690), покрытых 1 мкг /мл антигена. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа, планшеты промывали три раза TBST и инкубировали с кроличьим антителом против человеческого-пероксидазой хрена (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) для IgG-антител и крыс анти-HA-HRP (Clone F10, Roche Life Science, Базель, Швейцария) для Fab антител, соответственно. Планшеты отмывали три раза, (, SurModics Eden Prairie, Миннесота, США) добавили тетраметилбензидином (ТМВ) пероксидаза субстрата и реакции останавливают добавлением 1 N серной кислоты (DukSan, Ансан, Корея). Поглощение при 450 нм измеряли с помощью Victor X3 инструмент (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

поверхностного плазмонного резонанса анализ
<р> Для K
<> к югу от анализа ФАБ белков, HER2-ECD-His белок иммобилизовали на поверхности датчика CM5 чипа (GE Healthcare) с использованием способа сочетания амина при температуре приблизительно 2000 единиц отклика (RU). Очищенные белки Fab вводили в 2 мкг концентрации /мл и скорости потока 50 мкл /мин. Для к
<югу> от анализа IgG антител, козьего антитела против человеческого IgG (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) иммобилизовали на сенсорный чип CM5 с использованием аминного сочетания, и антитела были захвачены в 1 мкг /мл в течение 4-х минут и стабилизировали в течение 5 мин при скорости потока 50 мкл /мин. HER2-ECD-His белок вводили в концентрации 160 нМ. Для аффинных измерений, антитела были захвачены при скорости около 50 RU с козьими антителами против IgG человека (у), иммобилизованным на чипе CM5. HER2-ECD-His белок вводили при концентрациях в диапазоне от 0 до 640 нм. Сенсограмм были получены при каждой концентрации и оценивали с помощью программного обеспечения BIAevaluation. Для эпитоп биннинга, IgG форма hz1E11 иммобилизовали на отдельные CM5 датчик чипа поверхности со скоростью приблизительно 1000 единиц ответа. HER2-ECD-His (320 нМ) и антитела (1 мкг /мл) последовательно добавляли в течение 4-х минут и стабилизировали в течение 5 мин при скорости потока 50 мкл /мин.

Жизнеспособность клеток для анализа
<р> Клетки высевали в 96-луночные планшеты (Corning) в 10% FBS, содержащей среду и предварительно культивировали в течение 24 часов. Клетки обрабатывали антителами в указанных концентрациях и культуре в течение 4-х дней. WST-1 реагент (Догэн EZ-Cytox; служба Daeil Lab, Сеул, Корея) был использован для измерения жизнеспособности клеток. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали путем деления оптической плотности каждой лунки с помощью среднего значения абсорбции PBS-обработанных скважин в каждой пластине.

ксенотрансплантата исследование
<р> бестимусных голых самок мышей (Daehan Биолинк, Чунгбук, Корея ) вводили подкожно в область левой боковой поверхности 5 × 10 6 клеток NCI-N87 в Матригель (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Опухоли позволяли расти до приблизительно 200 мм 3 по размеру, а затем мыши были рандомизированы в группы. Животные получали внутрибрюшинного введения антител в указанных дозах два раза в неделю. Объемы опухолей рассчитывали по формуле (L × Ш × Ш) /2, где L представляет собой наибольший диаметр опухоли и W представляет собой наименьший диаметр опухоли. Двухсторонняя повторные измерения ANOVA с последующим тестом Бонферрони пост был проведен для статистического анализа опухолевых исследований growth.All животных были проведены в соответствии с руководящими принципами "Руководство по уходу и использованию животных" НИЗ и утвержденного протокола, полученного учреждение по уходу и использованию животных комитет компании.

Результаты

Гуманизация 1E11, проведенного CDR-прививкой генов зародышевых человека
<р> развивать гуманизированного антитела, в VH и VL последовательности мышиного 1E11 сравнивали с зародышевой линии человека V и J генных репертуаров с помощью IMGT /V-QUEST инструменты [24] анализа. Для получения тяжелой цепи, IGHV3-48 * 03 и IGHJ4 * 01 выставлены самую высокую степень гомологии к 1E11 аналоги, разделив на 85% и 87% идентичность, соответственно. Для легкой цепи человека IGKV1-39 * 01 и IGKJ1 * 01 генов отображается идентичность 80% и 81%, соответственно. Эти гены человека были выбраны в качестве акцептора последовательностей для прививка мышиных CDR. Среди зоны Верньера, которая состоит из остатков в каркасной области, которые участвуют в презентации CDR структур, поддерживая CDR петли [18, 25], только один остаток в положении 49 <югу> Н тяжелой цепи отличались между мышиным и человеческие последовательности. Следовательно, гуманизированным 1E11, hz1E11, имеет только один мышиный остаток в каркасных областях (рис.1).
<Р> связывающая активность hz1E11 к внеклеточной области (ECD) HER2, была эквивалентна ch1E11 (рис 2А), и сродство трастузумаба, ch1E11 и hz1E11 было 3 нМ, 23 нМ, и 23 нМ, соответственно. Мы также подтвердили, что hz1E11 связан с поддомена IV как родительский ch1E11. Трастузумаб также связывается с поддомена IV [26]. В в пробирке
антипролиферативные активности hz1E11 в качестве монотерапии, так и в сочетании с трастузумаб также были эквивалентны ch1E11 (рис 2С). В предыдущем исследовании [22] сообщалось, что ch1E11 имели <ЕМ> В естественных условиях
противоопухолевая активность сравнима с таковой трастузумаба в качестве единственного агента, а также комбинации ch1E11 и трастузумаба привело к индексу регрессии опухоли (TGI), из 95,1%. Точно так же, hz1E11 в качестве единственного агента был похож В естественных условиях
противоопухолевая активность на трастузумаб (S1) и рис комбинации hz1E11 с трастузумаб также показали дозозависимое противоопухолевую активность в модели NCI-N87 ксенотрансплантата мыши ( рис 2D). Антитело комбинированное лечение в дозе 1 мг /не кг каждого из hz1E11 и трастузумаба привело к подобной активности противоопухолевого трастузумаб однократной обработки в дозе 10 мг /кг, а при 2,5 мг /кг комбинации и выше установленная опухоль стабилизировалась или начала регрессировать (Нет статистически значительная разница [<ЕМ> P
≪ 0,05] наблюдалось среди 2,5, 5 и 10 мг /кг комбинации). Эти результаты показывают, что hz1E11 имеет сродство и биологическую активность, эквивалентную ch1E11, и что hz1E11 повышает противоопухолевую активность опухоли трастузумаба при использовании в комбинации.

аланин сканирование CDR-H3 и CDR-L3
<р> Чтобы определить критические остатки для взаимодействия антиген-антитело, аланин-сканирующий мутагенез проводили в CDR3 областях тяжелой и легкой цепей (CDR-H3 и CDR-L3). Эффекты мутаций оценивали с помощью анализа активности связывания очищенных белков Fab путем непрямого ELISA. В CDR-H3, аланин в положении замещения Gly98 <подразделам> H упразднены связывание ФАБ HER2 и G97 <суб> HA и T99 <суб> HA мутанты показали снижение связывающей активности (рис 3А). В CDR-L3, аланин замены имели значительно меньшие эффекты (рис 3б). к
<югу> от значения аланин мутантов сканирования были проанализированы с использованием SPR против immbolized белка HER2-ECD. Мы подтвердили, что G98A мутант тяжелой цепи полностью утрачена связывания деятельности, а также соседний T99 <суб> HA и G97 <суб> HA мутантов привело к 32-кратной и 17-кратное увеличение к
<подразделам> от значений соответственно (фиг.3С). Эти результаты указывают на то, что тяжелая цепь Gly98 <югу> Н является функционально критическим и прилегающие к нему остатки являются также функционально важны для взаимодействия антиген-антитело.

аффинного созревания hz1E11
<р> было проведено созревание аффинности из hz1E11 по построению тяжелой или легкой цепи CDR3, вариантные библиотеки, а затем при выборе равновесной фаговых библиотек антител. Для легкой цепи, глютамин остатки в положениях 89 <суб> L и 90 <суб> L были не диверсифицирована, поскольку глютамин обычно находится в этих положениях из девяти аминокислот longCDR-L3 последовательностей на 59% и 73% частот, соответственно [ ,,,0],27]. Позиции 91 <суб> L-94 <суб> L были рандомизированы с использованием NNK вырожденный кодон (L-NNK). Для тяжелой цепи, позиции 95 <суб> H -100a <суб> H были рандомизированы с использованием XXS кодон (H-XXS), разработанный таким образом, чтобы в первой и второй нуклеотидных позиций диверсифицированная кодонов дикого типа базы произошло с 70 % вероятность того, каждый из трех других баз произошло на 10% частоты, а третья буквы кодоны были синтезированы с использованием эквимолярной смеси G и C (фиг.4А). Высокое сродство связующих были выбраны из высоких требований или пониженной жесткости панорамирование (таблица 1).
<Р> По сравнению с пониженной жесткости панорамирование L-ННК библиотеки, в которой 100% от второго, третьего, и выходные клоны четвертого круглых экранированных были ELISA положительными, для высокой жесткости панорамирование четвертом раунде выход не дало связующее на всех, и только одна треть из третьего круглых выходных клонов были положительными ELISA (таблица 1). Отобранные клоны из библиотеки CDR-L3 включал много последовательностей, которые имели все четыре рандомизированные позиции CDR-L3 мутировали, в отличие от библиотек CDR-H3, из которых большая часть отобранных клонов сохранили последовательность дикого типа в положениях 97 <суб> H -100 <к югу> H (см. ниже) Различные стратегии панорамирование дали различные модели обогащения последовательности. Например, вариант клона легкой цепи 1A12 (Q <суб> 89LQNAYAPWT <суб> 97L) был выделен из высокой жесткости панорамирование, но не от низкой жесткости панорамирование, а тяжелый вариант цепи клона 1B12 (N <суб> 95HYGGTASFDY <суб> 102H) также был выбран только из высокой жесткости панорамирование. Интересно, что 59% уникальных антител в 4 й выход с низкой строгостью панорамирование библиотеки L-ННК была аланин в положении 92 <югу> L, в соответствии с анализом сканирующей аланин (рис 4В).
<р> Почти все клоны, которые были выделены из библиотеки Н-XXS имели ту же последовательность, при 97 <суб> Н -100 <югу> Н в качестве родительского клона, и показал четкое обогащение последовательности Asn-Tyr на 95-96. Для дальнейшей оценки вклада CDR-H3 остатков для антиген-антитело связывания, дополнительные библиотеки CDR-H3 была построена с твин ННК случайных кодонов сканирования CDR-H3 (H-2AA, рис 4а). В условиях пониженной жесткости панорамирование, мутанты в положениях 95 <суб> Н, 96 <суб> Н, 99 <югу> Н, 100 <югу> Н, и 100а <югу> H были выбраны в первом раунде панорамированием, но только мутанты в положениях 95 <суб> H и 96 <суб> Н обогащались четвертом раунде выход (таблица 1). Мы не смогли обнаружить мутантов в положениях Gly97 <югу> Н и Gly98 <подразделам> H в любых стратегиях и выходов панорамирование.

Affinity и связывающая активность отобранных клонов

Для того, чтобы оценить эффект комбинированного сродства вызревшие вариантов тяжелой и легкой цепи, IgG антитела с комбинациями аффинно созрел тяжелых и легких цепей были произведены и их к
<суб> от значения были определить с помощью SPR анализа (таблица 2). Среди двух легких вариантов цепи и двух вариантов тяжелой цепи 1A12 полученный из L-NNK показала наибольшее улучшение (16-кратное). Сочетание легкой цепи 1A12 с оптимизированной тяжелой цепи клона 1B12 привело к 24-кратное улучшение K
<подразделам> Над родительской hz1E11, в то время как для других комбинаций K
<суб> от значения были аналогичны или больше, чем у 1A12. Поскольку 1,5-кратное дополнительное улучшение с помощью комбинации L-1A12 + Н-1B12 не был значительно большим, клоны 1A12 и 1F11 (варианты легкой цепи) были выбраны для дальнейшей характеристики, чтобы минимизировать разницу последовательность аффинно зрелые антитела из родительского клон. Константы диссоциации для сродства созрел клонов, также определяется SPR анализа, были более чем в 10 раз ниже, чем у родительского клона hz1E11 и сравнима с трастузумаб (таблица 3).
<Р> Для того, чтобы определить, является ли сродства -matured hz1E11 клоны связываются с тем же эпитопом, что и родительский hz1E11, связывание 1A12 и 1F11 к HER2-ECD, который был предварительно связан с hz1E11 анализировали с помощью SPR. Оба клона были неспособны связываться с мономерной HER2-ECD-His белка, захваченной иммобилизованным 1E11, тогда как трастузумаб может (фиг.4С). Кроме того, было подтверждено, что 1A12 эпитоп не частично совпадает с трастузумаб (рис 4D). Клоны 1A12 и 1F11 также связываются с поддомена IV, как и их родительского клона hz1E11 (рис 4Е). Эти данные указывают на то, что эпитопы 1A12 и 1F11 не были изменены в процессе созревания аффинности.

Эффективность сродством созрел hz1E11 клонов

Оба 1A12 и 1F11 антитела показали слегка увеличенные антипролиферативные деятельности в качестве один агент по сравнению с hz1E11 на NCI-N87 и OE-19 желудочные линий раковых клеток, которые гиперэкспрессией HER2 (рис 5А и 5В), тогда как в сочетании с трастузумаб, их антипролиферативные деятельность была выше, чем трастузумаб в одиночку и эквивалентно hz1E11 плюс трастузумаб , Анти-пролиферативная активность 1A12 и 1F11 была подтверждена В естественных условиях
в модели ксенотрансплантата NCI-N87. Улучшенный противоопухолевая активность была очевидна в комбинации с трастузумабом, что и в одиночку каждого агента в обеих моделях ксенотрансплантатов (фиг.5С).

Обсуждение
<р> Несмотря на обнадеживающие клинические результаты, полученные с HER2-антитело трастузумаб нацеливание в лечение рака желудка, все еще есть потребность в более мощных HER2 целевой терапии [6]. Сочетание не конкурирующих антител, направленных рецепторы, такие как HER2, EGFR и VEGFR3, может увеличить противоопухолевую активность в преклинических моделях [11-13, 28]. Пертузумаб, другой HER2-антитело ориентации, предназначено для использования в сочетании с трастузумабом в лечении метастатического рака молочной железы [29]. В предыдущем исследовании, мы разработали новый HER2 таргетирования антитело 1E11, которое было продемонстрировано, чтобы иметь значительную противоопухолевую активность в качестве единственного агента и синергетический эффект в сочетании с трастузумаб в пробирке
и в естественных условиях
[22]. Активность анти-опухоль 1E11 плюс комбинация трастузумаб превосходит не только трастузумаба однократной обработки, но и в комбинации пертузумаба и трастузумаб. В этом докладе, гуманизация и последующее созревание аффинности мышиного гибридом, полученных 1E11 моноклональных антител описано.

Начальные подходы для снижения потенциального иммуногенность нечеловеческих вариабельных областей путем CDR-прививкой в ​​человеческий каркас значительно уменьшить иммуногенность терапевтических антител [15, 17]. Superhumanization с использованием рамок зародышевых человека в качестве шаблона был предложен в качестве превосходной методологии гуманизации, чтобы избежать предполагаемую эффекторные Т-клеточные эпитопы, полученные соматическими hypermuations человеческой структуры [30-32]. Было высказано предположение, что антитела, кодируемые сегментами гена зародышевой линии являются структурно гибкими и способными вмещать связывание с различными антигенами [33-35]. CDR, мышиного 1E11 антитела, а также один остаток в зоне Верньера из V <суб> Н (Ala49 <суб> Н) были привиты на переменную зародышевой человека и присоединяющиеся гены с наивысшей гомологией с родительским антителом (рис 1). Полученное гуманизированное антитело, hz1E11, показали почти одинаковую сродство и биологической активностью по отношению к родительским антителом (рис 2).
<Р> Выбор остатков для рандомизации является важным шагом в целенаправленной рандомизации подхода аффинного созревания из-за практических ограничений антитела размера библиотеки и технологии отбора. Аланин-сканирующий и в силикомарганца
анализ последовательности антител, особенно в ЗОР, полезны для выбора целевых остатков рандомизации и облегчить процесс созревания аффинности. В аланин анализе сканирования CDR-H3 из hz1E11, то G98A мутант полностью утратил активность связывания и G97A мутанта показали снижение связывающей активности (рис 3А). Прямое изменение существенного остатка паратоп обычно приводит к полной потере способности антитела [26, 33, 36] связывания. Таким образом, был использован более консервативный подход к CDR-H3 рандомизации, используя либо ручной смешанный олигонуклеотид, который смещается в сторону родительской последовательности, или двойник NNS случайного кодонов сканирование CDR-H3. Как и следовало ожидать из анализа сканирования аланина, почти все клоны, которые были выделены из библиотеки CDR-H3 имел последовательность 97 <суб> H-100A <суб> H такой же, как родительский клон (G <суб> 97HGTAS <суб> 100ah) .
<р> аланин результаты сканирования свидетельствуют о том, что все остатки CDR-L3 являются необязательными, хотя некоторые мутации, кажется, понижают сродство (фиг.3В). Таким образом, четыре позиции CDR-L3 (91 <суб> L-94 <суб> L) были полностью рандомизированы с использованием NNK вырожденный кодон. Анализ последовательности отобранных клонов подтвердили аланин растровый анализ; большинство отобранных клонов из библиотеки CDR-L3 были все четыре рандомизированные позиции CDR-L3 изменено из родительского остатка, вопреки результатам оптимизации CDR-H3, в которой большинство из отобранных клонов из библиотек имели ту же последовательность, что и родительское hz1E11 в средней части CDR (таблица 1). Клоны с большей улучшения сродства пришли из библиотеки CDR-L3. Вполне вероятно, что CDR-H3 из hz1E11 уже близка к оптимальной и большинство мутаций, особенно в области 97 <югу> H-100 <югу> Н, являются вредными для сродства связывания, в то время как последовательность CDR-L3 не в качестве оптимальной и мутации в этой области может привести к значительному улучшению сродства. L-ННК библиотека панорамирование выходы обогащались клонов с гидрофобной аминокислоты в положении 91 <суб> L, небольшая аминокислота в 92 <югу> L, и ароматической аминокислоты при 93 <суб> L. Эта модель несколько отличается от родительской последовательности CDR-L3-Q <суб> 89LQLYSTPWT <суб> 97L и еще раз говорит о том, что последовательность CDR-L3 родительского антитела 1E11 была неоптимальной и, таким образом, имел место для сродства улучшения.