PLoS ONE: микроРНК-206: эффективное ингибирование рака желудка Прогрессирование через с-Met Pathway

Абстрактный

микроРНК являются эндогенными нуклеотидные РНК с короткой цепью, которые регулируют функцию гена путем прямого связывания мРНК мишеней. В данном исследовании мы исследовали влияние микроРНК-206 (MIR-206) на развитие рака желудка. микроРНК-206 был впервые подтверждено, что подавляются в желудочном образцов рака. С другой стороны, усиление активности с-Met была подтверждена в образцах ткани рака желудка человека, с его уровнем обратно коррелирует с экспрессией микроРНК-206. Введение микроРНК-206 заторможенной клеточной пролиферации путем индукции G1 клеточного цикла, а также миграцию и инвазию. Кроме того, важными пролиферацией и /или миграции, связанных с молекулами, такими как с-Met, CDK4, п-Rb, п-Akt и п-ERK были подтверждены быть подавлена ​​с помощью Вестерн-блот-анализа. Ориентация на с-Met также оказывают прямое влияние пролиферации AGS клеток, миграцию и инвазию. В естественных условиях
, микроРНК-206, экспрессирующие опухолевые клетки также отображается задержка роста по сравнению с незатронутых опухолевых клеток. Наши результаты показали, что микроРНК-206 подавлено экспрессию с-Met при раке желудка и может функционировать как мощный подавитель опухоли в с-Met избыточно экспрессирующих опухолей. Ингибирование микроРНК-206 функций может способствовать пролиферации аберрантных и миграции клеток, что приводит к развитию рака желудка
<р> Образец цитирования:. Чжэн Z, Ян D, Чэнь X, Хуан H, Chen K, Li G, и др. (2015) микроРНК-206: эффективное ингибирование рака желудка Прогрессирование через Pathway с-Met. PLoS ONE 10 (7): e0128751. DOI: 10.1371 /journal.pone.0128751
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, JAPAN
<р> Поступило: 4 февраля 2015 года; Принято: 1 мая 2015 года; Опубликовано: 17 июля 2015
<р> Copyright: © 2015 Чжэн и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:. Эта работа была поддержана, в частности, Национальным фондом естественных наук Китая Грант 81100671 (Dy), провинции Чжэцзян фонд естественных наук Китая Грант Y2110609 ( DY), и Вэньчжоу Наука &Amp; Технологическое бюро Грант Y20080096 (DY). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти в мире [1]. Ее заболеваемость и смертность особенно ярко проявляется в странах Азии, из-за различных влияний [1]. Так как его презентация часто ассоциируется с прогрессирующим заболеванием, существует настоятельная необходимость достижения в области его обнаружения и в конечном счете его руководством. В настоящее время понимание микроРНК (миРНК) на влияющей на формирование рака желудка происходит в быстром темпе.
<Р> Так как первое описание микроРНК в нематодой C
. Элеганс
еще в 1993 году, влияние этих малых некодирующих РНК трансцендировал несколько ветвей молекулярной биологии [2]. МикроРНК высоко ткани специфические биомаркеры с потенциалом для изменения и преобразования резидентов ткани. Потому что избыточная экспрессия и под-выражения оба были связаны с онкогенеза [3], их роли в качестве онкогенов и генов-супрессоров оба хорошо установлены [4, 5]. За последние несколько лет, их влияние на развитие и выявление солидных опухолей органов в том числе рака желудка медленно выяснены. Есть уже несколько микроРНК, идентифицированные в рак желудка антиапоптической механизма, такие как MIR-21 и микроРНК-148а [6, 7]. Другие пути под влиянием микроРНК включают прогрессию клеточного цикла, состоящий из MIR-222/221, микроРНК-106b /93/25 и микроРНК-24 [6, 7].
<Р> Один из других перспективных новых микроРНК для твердого органа опухоли включает в себя MIR-206 [8]. Эта конкретная микроРНК принадлежит к группе "myomiRs", который участвует в скелетных мышцах развития [9]. Будучи связан со многими другими заболеваниями, включая болезни сердца, хронической обструктивной болезни легких и болезни Альцгеймера, ее роль в онкогенеза получила критики в последнее время, включая рабдомиосаркома, рак легкого, колоректальный рак, шванномы и рака желудка [8, 9]. Несмотря на то, повышен в несколько типов рака, включая рак яичников и Waldenström макроглобулинемией, микроРНК-206 в основном подавлено в солидных опухолях органов [9]. микроРНК-206 ранее уже было показано, ингибирует желудочную пролиферацию раковых частично путем подавления циклин D2 [10]. В данном исследовании мы сосредоточились на роли микроРНК-206 в желудочном онкогенеза рака через пути с-Met, который традиционно влиятельную сигнальный путь для онкогенеза в различных опухолях [11]. с-Met было предсказано и показано, что ген-мишень нескольких микроРНК, включая микроРНК-206 [9, 12].

Результаты

Подавление микроРНК-206 привело к увеличению с-Met выражение при раке желудка
<р> анализ в реальном времени RT-PCR проводили для определения экспрессии микроРНК-206 в 40 образцах желудочного рака и нормальных тканей. были обнаружены уровни микроРНК-206 в большинстве образцов тканей желудка опухоли (34/40) значительно ниже, чем нормальные ткани (рис 1А). выражение микроРНК-206 находилась в обратной зависимости от уровня с-Met, наблюдаемого в образцах опухолей (фиг.1В). Большинство образцов опухоли, с уменьшением экспрессии микроРНК-206, показали высокий процент (&GТ; 50%) с-Met окрашивания. С другой стороны, опухоли с нормальным выражением MIR-206 показал очень слабую или отрицательную экспрессию с-Met.

микроРНК-206 индуцированное G1 арест и пролиферацию клеток тормозится, миграцию и вторжение в AGS клеток рака желудка
<р> Как выражение микроРНК-206 была снижена в желудочном образцов рака, мы пытались определить, были ли введение микроРНК-206 любой биологический эффект на AGS клеток. AGS клетки, трансфицированные молекулы микроРНК-206 показали ингибирование роста клеток по сравнению с отрицательным контролем на основании анализа MTS (Фиг.2А). FACS анализ клеток показал G1 остановку клеточного цикла (S1) Рис. Число колоний также была снижена с трансфекцией MIR-206 (S2 рис).
<Р> микроРНК-206 может ингибировать миграцию и инвазию клеток AGS (рис 2B и S3 рис). Резкое сокращение миграции в сторону нижних камер наблюдалась в микроРНК-206 трансфецированных клеток AGS (86 ± 15 против 165 ± 16 в AGS клетках, P
&л; 0,01, п = 3). Кроме того, клетки, трансфицированные MIR-206 показали, что HGF-индуцированную инвазивность был также значительно затруднено следующее MIR-206 трансфекцию (57 ± 12 против 116 ± 14 в AGS клетках, P
≪ 0,01, N = 3).

микроРНК-206 подавлена ​​экспрессия с-Met и цикл связанных с белками других сотовых
<р> ранее мы определили с-Met как прямой мишенью MIR-206 [9]. Вестерн-блот-анализ подтвердил, что экспрессия с-Met был сокращен на микроРНК-206 трансфекции в AGS клетках (рис 3). Одновременно с этим, внематочной микроРНК-206 также вниз регулирует экспрессию CDK4, п-Rb, п-Akt и п-ERK.

Подавление с-Met ингибирует пролиферацию клеток рака желудка, миграция и инвазия
<р> Далее, с-Met конкретных миРНК был впервые использован для уменьшения экспрессии с-Met в клетках AGS (S4) рис. Анализы MTS были выполнены, чтобы определить пролиферацию клеток. AGS клетки, трансфицированные с-Met миРНК показали снижение роста клеток по сравнению с отрицательными контрольными клетками (рис 4A; 25.10 ± 3.81% снижения). Оба были снижены HGF-индуцированной миграции и инвазии при сравнении с-Met миРНК трансфицировали клетки отрицательного контроля трансфицировали клетки. Как показано на фиг.4В и S5 рис, снижение миграции (88 ± 10 против 155 ± 15, Р &л; 0,01, п = 3) и инвазия (72 ± 7 против 126 ± 12, Р &л; 0,01, N = 3) были статистически значимыми.

Введение MIR-206 подавляются рост опухоли в естественных условиях

<р> Далее мы исследовали, если избыточная экспрессия микроРНК-206 может подавлять рост опухоли в естественных условиях
. Через 8 недель, усредненные объемы опухоли были значительно ниже, из клеток, инфицированных лентивирусов, экспрессирующих микроРНК-206, по сравнению с контролем (рис.5).

Обсуждение
<р> Рак желудка остается значительное здоровье уход бремя во всем мире, несмотря на годы исследований [1]. По данным ВОЗ, рак желудка остается одним из лучших этиологией рака с высоким уровнем смертности [1]. Как и в случае других солидных опухолей органов, становится все более очевидным, что более глубокое понимание опухоли канцерогенеза необходимо улучшить прогноз этих пациентов. Будучи широко распространены в азиатских странах, данные появляются на роли микроРНК в развитии или подавления рака желудка [6].
<Р> микроРНК имеют двойные функции с точки зрения развития рака желудка [6, 13]. Некоторые микроРНК опухолевые супрессоры и другие oncomiRs [6]. Уэда и др. найдено 22 микроРНК активируемых и 13 подавлена ​​в плазме больных раком желудка [13]. Цели, которые находятся под следствием в случае рака желудка включают в себя регуляторы p16, с помощью микроРНК-24 и р21 через MIR-222/221 и микроРНК-106b /93/25 [6]. Другие, такие как MIR-21, может быть в повышающей регуляции до 92% желудочных образцов ткани рака [14]. Кандидаты, определенные в рак желудка, выступающей в качестве супрессоров опухолей включают MIR-181B, MIR-101 и MIR-486 [6]. Например, микроРНК-101, как полагают целевой Ezh2, ЦОГ-2, MCL-1 и Fos [15]. микроРНК-486, как полагают, влияют на OLFM4, возможно, влияет на апоптоз ниже по течению [16].
<р> Установив, что большинство микроРНК служат в качестве супрессоров опухолей, мы исследовали пути с-Met при раке желудка. При изучении пути с-Met для rhadbomyosarcoma, мы обнаружили, важность этого пути в саркому [9]. с-Met, как известно, дизрегуляции при раке желудка [11, 17-19]. Встреченному протоонкогена кодирует белок, известный как фактор роста гепатоцитов рецептора (HGF), который обладает активностью тирозинкиназы [18]. Как правило, мы находим, что выражается только в стволовых клетках, но также видели его дисрегуляцию в онкогенеза [18]. В данном исследовании мы смогли подтвердить, что с-Met значительно вовлечен в рак желудка и его роль в качестве мишени микроРНК-206 играет важнейшую роль в онкогенеза.
<Р> прогрессию клеточного цикла дизрегуляции при раке желудка. Основываясь на предыдущих докладах, циклин D2 повышается при раке желудка, когда микроРНК-206 влияет [10]. микроРНК-206 было показано, является сильным прогностическим маркером [10]. Ее деактивация связано с более короткой общей выживаемости. Восстановление MIR-206 приводит к остановке клеточного цикла G0 /G1, подтверждая свою роль в качестве супрессора опухоли. Наша работа также показала, клеточный цикл дисрегуляция с CDK4 и фосфорилированного-Rb под воздействием. CDK4 является членом циклин зависимой киназы семейства с сер /THR активности протеинкиназы. Это приводит к прогрессированию фазе G1. Кроме того, киназы приводит к фосфорилирования Rb, который является супрессоров опухоли участвует в прогрессии клеточного цикла.
<Р> Хотя подобные результаты были подтверждены в желудка, яичников и молочной железы, роль микроРНК-206 кажется иметь противоположный эффект при раке толстой кишки [6, 20]. Обратная корреляция была отмечена между микроРНК-206 и KLF4 в панели рака толстой кишки человека [20]. KLF4, которая обладает онкогенными свойствами и в других видов рака, таких как рак молочной железы, кожи и легких, функционирует как опухолевый супрессор при раке толстой кишки [20]. Его промотор является гипер-метилированных с повышенными уровнями MIR-206 ведущих к понижающей регуляции KLF4 [20]. Эти данные показывают, что микроРНК-206 не может функционировать аналогично во всех эпителиальных клетках, что сводит на нет один размер подходит всем подход в химиопрепаратов.
<Р> В настоящем исследовании мы определили механизм регуляции экспрессии генов с-Met через микроРНК-206 при раке желудка. с-Met суперэкспрессия следующие микроРНК-206 понижающей кажется общим Этиология патогенез рака желудка в большинстве исследованных образцов в данном исследовании. Таким образом, мы показали, что микроРНК-206 отрицательно модулирует путь передачи сигнала с-Met участвует в клеточной пролиферации и миграции. Наши исследования, мы надеемся иметь важные клинические последствия в лечении рака желудка. микроРНК-206 является кандидатом для обоих иммуногистохимического обнаружения небольших опухолей и возможной мишени для биологических терапевтических средств.

Материалы и методы

Клеточная культура
<р> желудка человека линии клеток рака, АГС, приобретенные у АТСС (Manassas, VA), выращивали в Хэма F-12 Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки. (FBS; Hyclone, Logan, UT)

Этика утверждение
<р> Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями и утверждения Вэньчжоу медицинского университета Уход за животными и использование комитета (номер разрешения: WZMCOPT-043011). Сорок желудка образцов опухолевых и нормальных тканей желудка донорские были получены из второй филиал больницы Вэньчжоу медицинского университета (Вэньчжоу, Китай). Сбор образцов был одобрен Комитетом по этике Вэньчжоу медицинского университета путем на исследования с участием человека, и письменное информированное согласие было получено от каждого конкретного случая. Все эксперименты проводились в соответствии с Хельсинской декларацией и национальными законами.

Количественный RT-PCR
<р> Суммарную РНК экстрагировали из образцов опухолей человека желудка и нормальным контролем с Trizol реагентом (Invitrogen). 10 нг общей РНК использовали для синтеза кДНК путем Taqman микроРНК с обратной транскрипцией Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), и уровень экспрессии микроРНК-206 количественно оценивали с помощью Taqman микроРНК анализа (Applied Biosystems). В режиме реального времени RT-PCR проводили с использованием системы PCR Applied Biosystems VIIa 7 в режиме реального времени (Applied Biosystems).

Иммуногистохимическое окрашивание C-Met
<р> Разделы фиксированные формалином парафин желудочные образцы опухолей человека (5 мкм), были сделаны, а затем де-paraffinized с ксилолом и этанолом. Срезы обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° C с C-Met антитела в соотношении 1: 300 разбавление (ДКБ, Beverly, MA). Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием Энвисион HRP системы обнаружения /ДАБ (Dako, Glostrup, Дания).

Пролиферация клеток анализ
<р> AGS клетки высевали при 2000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты ( Costar, High Wycombe, Великобритания) для каждой трансфекции. Трансфекция были выполнены с реагентом (липофектамином RNAiMAX; Invitrogen), в трех экземплярах. Для каждой лунки использовали 50 нМ микроРНК-206 подражает молекула (Амбион, Остин, штат Техас), или отрицательный контроль (Амбион) трансфекцию. После 72 часов культивирования, пролиферации клеток оценивали с помощью MTS анализа (Celltiter 96 Водную; Promega, Madison, WI).

Transwell миграции анализы

24 часов после трансфекции, AGS клетки собирали трипсинизации и промывали один раз раствором D-Hanks (Invitrogen). Для измерения миграции клеток или инвазии, 8 мкм культуры пор по размерам или Матригель вставками (Transwell, Costar) были помещены в лунки 24-луночных культуральных планшетах. В нижней камере, 400 мкл F-12, содержащей 10% FBS и добавляли 20 нг /мл HGF. Затем клетки 5x10 ^{4 были добавлены в верхнюю камеру. После 20 часов инкубации клетки, которые мигрировали через поры окрашивали кристаллическим фиолетовым и исследовали под микроскопом (Цейс, Oberkochen, Германия) с использованием объектива 20X.}

Вестерн-блот-анализ
<р> AGS клетки (1x10 5) были высеяны в 6-луночные планшеты и выращивали в F-12, в течение 24 часов до трансфекции. Через 72 часа после трансфекции клетки промывали холодным PBS и подвергали буфере для лизиса (35 мМ Трис-Cl [рН 6,8], 20 г /л додецилсульфата натрия [SDS], 100 мМ дитиотреитола). Белковые лизаты (20 мкг каждого) были разделены с использованием 8% электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, а затем электрогидравлический переносили на нитроцеллюлозные мембраны фильтра. Мембраны были блокированы с буфером, содержащим 5% обезжиренного молока в PBS с 0,05% Tween-20 в течение 2-х часов и инкубировали в течение ночи с антителом при 4 ° С. После второй промывки ФБР, содержащим 0,05% Tween-20, мембраны инкубировали с пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами (Millipore, Дармштадт, Германия), и разработан с расширенным набором обнаружения хемилюминесценции (Pierce, Rockford, IL). GAPDH, был использован в качестве нагрузочного контроля. Антитела для CDK4, п-Rb, ERK, Akt, п-ЭРК, п-Akt, с-Met и GAPDH были из Cell Signaling Technology (Беверли, Массачусетс).

миРНК анализы
<р> с-Met-специфических миРНК (Амбене) и отрицательный контроль миРНК (Амбене) были использованы для экспрессии с подавляют-Met в AGS клетках. 50 нМ с-Met-специфической миРНК или отрицательный контроль миРНК трансфицировали в AGS клетки с липофектамином RNAiMAX. Анализ МТС проводилось через 72 часа после трансфекции, в то время как Transwell и Матригель анализы проводили через 24 часа после трансфекции, как описано выше.

В естественных условиях
роста опухоли анализ
<р> предварительно микроРНК выражение конструирует Ленти-микроРНК-206 и вектор управления PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP были приобретены у системы Biosciences (Mountain View, CA). AGS клетки инфицировали лентивирусов, экспрессирующих микроРНК-206 или отрицательный контроль. Женский голых мышей, в возрасте 6 недель, были привиты с AGS клеток (8x10 ^{6), выражающая MIR-206 или отрицательного контроля в своих флангах, а затем умерщвляли через 8 недель. Размер опухоли измеряли и объем рассчитывали по следующей формуле: ( L
х W
2) х 0,5, ( L
, длина; W
, ширина), в соответствии с методом, ранее сообщалось [21]. Все исследования и процедуры были одобрены уходу и использованию животных комитета Вэньчжоу медицинский университет им.}

Статистический анализ
<р> Все данные были показаны как среднее ± SEM. Результаты, показанные выражены как среднее значение ± SEM из результатов, полученных в трех повторах в одном эксперименте. Результаты представляют собой те средства, полученные в трех отдельных экспериментах. Различия между экспериментальными группами и контрольными группами анализировали с использованием Стьюдента т
-test. Статистическая значимость была принята в P
&л; 0.05.

Поддержка Информация
S1 Рис. FACS-анализ клеток AGS, трансфицированных микроРНК-206.
AGS клетки собирали через 48 часов после трансфекции с MIR-206 или NC, окрашивали пропидийиодидом, и анализировали с помощью проточной цитометрии. Десять тысяч клеток оценивали в каждом образце. Наиболее представительные результаты в трех независимых экспериментах изображены
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s001
(TIF)
S2 Рис. Образование колоний анализа.
клетки AGS, трансфицированные микроРНК-206 или NC были посеяны при низкой плотности. Через 7 дней, образование колоний определяли путем окрашивания кристаллическим фиолетовым. Типичные результаты в трех независимых экспериментов показаны
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s002
(TIF)
S3 Рис. Эффекты MIR-206 на AGS клеток оценивали с Transwell и Матригель анализов.
Количество клеток, которые мигрировали через поры культуры вставки (вверх) или вторгшихся через поры вставки Матригель (вниз) была сфотографирована с использованием 20X объектив микроскопа
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s003
(TIF)
S4 рис. . Отрицательная регуляция с-Met по миРНК
Вестерн-блот-анализ проводили, чтобы подтвердить подавление экспрессии с-Met после Липофектамин трансфекции клеток AGS либо с с-Met миРНК или отрицательного контроля (NC)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004
(TIF)
S5 рис. Эффекты с-Met миРНК на AGS клеток оценивали с Transwell и Матригель анализов.
Количество клеток, которые мигрировали через поры культуры вставки (вверх) или вторгшихся через поры вставки Матригель (вниз) была сфотографирована с использованием 20-кратным объектив микроскопа
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s005
(TIF)

• PLoS ONE: Exosomal микроРНК из брюшины промывной жидкости в качестве прогностического биомаркеров перитонеальные ме…
• PLoS ONE: Повышение радиационного воздействия урзоловой кислоты в КУП-823 Человеческий Аденокарцинома рак желудк…