Абстрактный
Фон
<р> Наши предыдущие результаты исследования показали, что тип II цГМФ зависимой протеинкиназы (PKG II) может блокировать активацию рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и, следовательно, ингибируют пролиферацию и связанную с ним МАРК /ERK-опосредованную передачу сигнала желудочного линии клеток рака КУП-823, предполагая, что PKG II, возможно ингибировать другие EGFR-триггерным пути передачи сигналов, и связанной с ними Биологическая активность клеток рака желудка. Этот документ был разработан, чтобы исследовать потенциальное ингибирование PKG II на EGF /EGFR-индуцированной миграционной активности и связанных с ним пути передачи сигнала.
Финансирование:. Это исследование Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая, No.81272755, No.31040002, No.81001100 и No.31100974; Инновационный грант Цзянсу университета. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение PKG II Подавляет ЭФР-индуцированной миграции клеток, которая связана с сигнальную трансдукцию PLCγ1 и МАРК /ERK-опосредованное Pathways PKG II Блоки EGF-индуцированной Tyr и Tyr 992 1068 фосфорилирование EGFR (1) PLCγ1 активации. (2) образование DAG. (3) Ca 2+ отпуская. (4) Активация PKCα. (5) Активация CaMKIIα. PKG II Тормозит EGF-индуцированную активацию Компоненты ключ МАРК /ERK -опосредованной Signal трансдукции (1) Активация MAPK /ERK. (2) Активация РАН. Данные исследования показали, что некоторые протеинкиназы может привести к фосфорилирования EGFR и влияет на его активацию и /или назначения. Например, протеинкиназа С (ПКС) может привести к фосфорилирование треонин 654 EGFR и регулирует связывание с рецептором и интернализации [31]. Серин 1046/1047 (/1047 Ser1046) сайт фосфорилирования необходима для EGFR десенсибилизации в EGF-обработанных клетках [32] .В наших экспериментах мы обнаружили фосфорилирования Thr654 и Ser1046 /1047 EGFR и обнаружили, что PKG II не вызывало фосфорилирование этих сайтов фосфорилирования. Тем не менее, наши результаты показали, что существует прямое взаимодействие между PKG II и EGFR и PKG II вызвал треонин фосфорилирования EGFR. Это указывает на то, что PKG II блокировал активацию EGFR через связывание с и фосфорилирование рецептора. Точный сайт фосфорилирования будет наша следующая цель исследования. клеточной линии и реактивы Образцы белка подвергали в SDS-PAGE (8-12%) геле в соответствии с размером молекул белка-мишени, а также электрофорез и мембранным передача была выполнена в соответствии с протоколом производителя (Bio-Rad, Hercules, CA). Первичные антитела инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° С в TBS-T (2% твина-20), и соответствующие вторичные антитела инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в TBS-T (2% твина-20), с тремя промывками после каждой инкубации. ЭСЛ реагенты использовали, чтобы показать положительные полосы на мембране. Для выполнения анализа денситометрии, цифровые изображения положительных полос были получены с Chemidoc РРС и анализировали с помощью программы анализа изображений Количество One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Результаты показали, как отношение белка-мишени /управления загрузкой. Активность Ras была обнаружена с спускающее способ, как описано ранее [9]. Вкратце, клетки, растущие на культуральном планшете 100-мм промывали три раза холодным PBS и лизировали добавлением 400 мкл буфера для лизиса (25 мМ HEPES, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% NP40, 10% глицерина, 25 мМ NaF , 10 мМ MgCl <суб> 2, 0,25% дезоксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Na <суб> 3VO <суб> 4, 10 мкг /мл апротинина и 10 мкг /мл лейпептина). Образец собирали и центрифугировали (14000 г, 4 ° С, 10 мин), чтобы избавиться от мусора. Супернатант инкубировали с глутатион-сефарозы и глутатиона S
<р> Type II цГМФ-зависимые протеинкиназы (PKG II) представляет собой серин /треонин киназа и накапливающиеся данные исследования показали, что эта киназа играет важную роль в регуляции клеточных биологических активностей, как пролиферации и апоптоза, особенно в опухолевых клетках , В 2004 году Кук <ЕМ> и др
обнаружили, что PKG II может индуцировать апоптоз культивируемых простатических стромальных клеток человека [1]. В 2009 году Свартлинг и др
сообщил, что ингибирует пролиферацию PKG II клеток нейроглиомы человека и ингибирование было связано с уменьшением экспрессии фактора транскрипции Sox9 и фосфорилирования Akt [2]. В 2011 году Fallahian и др
обнаружили, что цГМФ может индуцировать апоптоз клеток рака молочной железы, и этот эффект был связан с PKG II [3]. В ходе нашего исследования мы обнаружили, что выражение и активность PKG II в желудочном линиях раковых клеток человека были значительно ниже, чем у нормальных клеток слизистой оболочки желудка [4]. Дальнейшие исследования в нашей лаборатории, показали, что PKG II может ингибировать пролиферацию раковых клеток желудка линий и блок-EGF индуцированной сигнальной трансдукции МАРК /ERK-опосредованного пути посредством предотвращения активации EGFR ЭФР [5], [6]. Так как активация EGFR может инициировать несколько путей передачи сигналов, включая MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT и PLCγ1-опосредованных путей [7], [8], блокирующий эффект PKG II на активации EGFR позволяет предположить, что этот фермент может иметь ингибирующий эффект широкодиапазонного на сигнальной трансдукции и связанных с этим биологических активностей клеток рака желудка. Этот документ был разработан, чтобы подтвердить эту широкодиапазонного угнетающее действие PKG II посредством изучения ингибирования PKG II на EGF-индуцированной миграционной активности и связанное с ним трансдукции сигнала в клетках рака желудка.
Результаты
<р> миграция клеток играет важную роль в нормальной физиологии и при болезни. Приобретение миграционный способности раковыми клетками является характеристикой, которая способствует распространению метастатических опухолевых клеток в отдаленные органы. Последние данные показали, что ЭФР может стимулировать миграцию раковых клеток. Механизм, через который EGF стимулирует клеточную миграцию не ясно, но некоторые данные указывают на то, что EGF может сделать это путем инициирования передачи сигнала PLCγ1 и МАРК /ERK-опосредованный пути. В этом эксперименте мы обнаружили миграционную-стимулирующий эффект EGF в AGS клетках и использовали ингибитор ключевых компонентов в сигнальных путей, чтобы исследовать возможную трансдукции сигналов, связанный с эффектом. Результаты показали, что лечение ЭФР повысило миграционную активность клеток AGS и как MEK (ключевой компонент МАРК /ERK-опосредованного пути), ингибитора U0126 и PLCγ1 ингибитор U73122 подавлял EGF-индуцированной миграции, указывая, что ЭФР стимулировал миграционной активности клеток путем активации как MAPK /ERK и PLCγ1 опосредованной сигнальных путей передачи (рис. 1).
<р> Когда EGF соединяется с EGFR, он вызывает автомати- фосфорилирование рецептора. Есть несколько авто-сайтов фосфорилирования, которые подключены к различным пути трансдукции сигнала. Тирозин 992 и Тирозин 1068 относятся к числу авто- фосфорилирования участков EGFR и связаны с PLCγ1-опосредованной и МАРК /ERK-опосредованную передачу сигналов соответственно. В этом эксперименте мы исследовали ингибирующее действие PKG II на тирозин и тирозин 992 1068 фосфорилирования EGFR в по-разному обработанных AGS клеток с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты показали, что лечение ЭФР вызвало 14 складки увеличение тирозин 992 и 8 складки увеличение тирозин 1068 фосфорилирования EGFR. В клетках, инфицированных Ad-PKG II и стимулированных цГМФ, фосфорилирование было значительно снижено (рис. 2, 3). Это свидетельствует о том, что PKG II может предотвратить EGF-индуцированной тирозин и тирозин +992 1068 фосфорилирования EGFR и, следовательно, ингибируют PLCγ1-опосредованной и МАРК /ERK-опосредованный сигнализации.
PKG II предотвращающая EGF-триггерным Главные события PLCγ1-опосредованной Signal трансдукции
<р> PLCγ является нижестоящий компонент рецептора тирозинкиназ (RTK). Он имеет две изоформы: PLCγ1 повсеместно распространены и PLCγ2 выражается главным образом в кроветворных клеток. Активация PLCγ1 требует своего набора к мембране и ассоциации, через его домен SH2, с активированным RTKs, такие как EGFR. Это объединение приведет к фосфорилированию PLCγ1 по остаткам тирозина, в частности на тирозин, а также 783 с увеличением его ферментативной активности. Мы применили метод IP изолировать PLCγ1, а затем использовали метод Western блот для определения фосфорилирования PLCγ1. Результаты показали, что лечение EGF вызвало явное увеличение Tyr783 фосфорилирования PLCγ1 и повышение активности PKG II путем инфицирования клеток с Ad-PKG II и стимулируя клетки с цГМФ эффективно предотвратили EGF-индуцированного фосфорилирования PLCγ1 (рис. 4 ).
<р> После того, как он активируется, PLCγ1 может катализировать гидролиз фосфатидилинозитол 4,5-bisphos-фосфатного (PI-4,5P <суб> 2) в инозитол-1,4,5-трифосфата (IP-<суб> 3) и диацилглицерина (DAG), две молекулы, которые регулируют мобилизацию внутриклеточного Ca 2 + и протеинкиназа с активность соответственно. Для того, чтобы наблюдать эффекты ЭФР и PKG II на формирование DAG, метод ELISA использовали для определения концентрации DAG в клетках AGS. Результаты показали, что в EGF, стимулированных клеток AGS, уровень DAG увеличилось, очевидно, и предварительно инфицирование Ad-PKG II и лечение с 8p-CPT-цГМФ ингибирует образование DAG, вызванного стимуляцией с EGF (рис. 5).
<р> IP3 и DAG вторые мессенджеры в PLCγ1-опосредованного пути передачи сигнала. IP3, как известно, стимулирует высвобождение кальция из внутренних запасов. Мы использовали кальция индикатор Fluo-3 /AM, чтобы обнаружить кальций в цитоплазме. Результаты показали, что лечение ЭФР увеличило выпуск Ca 2+ из эндоплазматического ретикулума (ER) в цитоплазму и высокий уровень экспрессии и активности PKG II значительно ингибирует высвобождение, реверсивный эффект лечения EGF (рис. 6).
<р> PKCα, изоформы протеинкиназы с, является ключевым компонентом PLCγ1-опосредованного сигнального пути и могут быть активированы с помощью Са 2+ и DAG , При активизации, PKCα транслоцирует из цитоплазмы в мембрану клеток. Таким образом, количество PKCα на мембране представляет собой активацию PKCα. В этом эксперименте мы исследовали ингибирующее действие PKG II на активацию PKCα в по-разному обработанных AGS клеток с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты показали, что в течение пяти минут после добавления EGF в культуральной среде, транслокации PKCα из цитоплазмы к мембранным резко увеличивается, и транслокации ингибируется предварительно инфицировать клетки с Ad-PKG II и лечение с 8-PCPT-цГМФ ( рис. 7).
<р> Исследования в области регуляции Са 2 + /кальмодулин (КУЛАК) -зависимая киназа II альфа (CaMKIIα), который является первичным изоформы CaMKII, предположили, что при Са 2 + /ДАМ связывается с CaMKIIα, внутримолекулярное автофосфорилирование происходит и фосфорилирование поддерживает постоянную активацию фермента. Антитела против фосфо-CaMKIIα (Thr286) был применен в Вестерн-блоттинга для обнаружения фосфорилирования CaMKIIα. Результаты показали, что в AGS клетки обработанной EGF, Thr286 фосфорилирование CaMKIIα увеличилось почти в 2,5 раза и инфицирования Ad-PKG II и лечение с 8-PCPT-цГМФ ингибирует увеличение фосфорилирования, индуцированного ЭФР (рис. 8).
<р> МАРК /ERK является ключевым компонентом МАРК /ERK-опосредованного пути. Фосфорилирование на обоих треонин 202 и тирозин 204 остатков ERK1 и треонин 185 и тирозина 187 остатков ERK2 требуется для полной ферментативной активации. Антитело против п-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) был применен в Вестерн-блоттинга, чтобы обнаружить двойное фосфорилирование ERK. Результаты показали, что в течение пяти минут после добавления EGF в клеточной культуральной среде, фосфорилирование ERK1 /2 в AGS клетках резко (10 складок) увеличилось и фосфорилирование ингибируется предварительно инфицировать клетки с Ad-PKG II и активации фермента с 8-PCPT-цГМФ (рис. 9).
<р> Малый G протеин Ras является еще одним ключевым компонентом в МАРК /ERK-опосредованного сигнального пути. Он имеет две формы в клетках: GTP переплете активную форму и ВВП переплете неактивную форму. После того, как Рас в ГТФ-связанной форме, он может связываться и активировать Raf-1 и начать последующие активации серин /треонин киназ в пути сигнала. Мы применили метод "тянуть вниз", чтобы обнаружить активированный Ras. Результат показал, что после добавления EGF в культуральной среде, активный Ras в клетках AGS, очевидно, увеличилось в течение пяти минут. Заражение клеток с Ad-PKG II и стимулируя их с 8-PCPT-цГМФ перед добавлением EGF в значительной степени предотвращал EGF-индуцированную активацию Ras (рис. 10).
PKG II Тормозит EGF-индуцированную активацию RAC1
<р> Малый G протеин RAC1 является главным членом семьи Rho, которые играют важную роль в регулировании миграции раковых клеток. Оба PLCγ1 и МАРК /ERK опосредованной трансдукции сигнала может активировать RAC1, а затем стимулировать клеточную миграцию. Для дальнейшего подтверждения угнетающее действие PKG II на EGF /EGFR-индуцированной сигнализации, который связан с миграцией, метод "Pull-вниз" был применен для обнаружения ингибирования PKG II при активации RAC1. Результат показал, что лечение ЭФР вызвало явное увеличение активного RAC1 и высокой активности PKG II эффективно ингибирует активацию RAC1 (рис. 11). Это дало еще одно доказательство ингибирования PKG II на EGF-индуцированной миграции клеток рака желудка.
PKGII Взаимодействует с EGFR и причины THR-phoshporylation рецепторных
<р> механизм, через который блоки PKGII ЭФР-индуцированной активации EGFR предварительно была исследована в этом эксперименте. Со-иммунопреципитации был применен для обнаружения взаимодействия между PKGII и EGFR. Вестерн-блоттинга с панорамированием анти фосфорилирования треонина антитела использовали для обнаружения Треониновый фосфорилирования EGFR, вызванного PKGII. Результаты Co-иммунопреципитации показали, что в AGS клетках, инфицированных Ad-PKG II и стимулированных с 8-СРТ-цГМФ, прямое связывание между PKG II и EGFR был обнаружен (рис. 12, панель А). Результаты Вестерн-блоттинга показал, что активация PKG II вызвал треонина РЭФР (рис. 12, панель B). Это свидетельствует о том, что PKG II блокировали EGFR активации посредством связывания с рецептором и вызывает фосфорилирование него.
Обсуждение
<р> В настоящее время, два цГМФ-зависимых протеинкиназ (пакета по), PKG I и II PKG , были идентифицированы в клетках млекопитающих [10], [11]. PKG я широко распространен в организме, и в силу его ингибирующее действие на рост опухоли и инвазивности и эффект индуцировани апоптоза опухолевых клеток, он был идентифицирован как опухолевый супрессор [12]. Выражение PKG II больше ткани ограничено [13]. В течение долгого времени, в отличие от хорошо доказанного эффекта противоопухолевой PKG I, никакие данные исследований четко не указано противоопухолевую роль PKG II и эта киназа был замешан лишь в нескольких физиологических функций, включая кишечной секреции, роста костей, а также обучения и память [14]. Тем не менее, интерес исследования о PKG II растет, и некоторые новые функции PKG II были обнаружены в последнее время, в том числе роль PKG II в регуляции эпителиального натриевого канала и механо-трансдукции сигнала [15] - [17]. Что еще более важно, накапливать данные исследования показали, что PKG II была связана с пролиферации и апоптоза в некоторых клетках, особенно в клетках опухоли, сильно предполагая потенциальную роль этого фермента в регуляции биологической активности опухолевых клеток [1] - [6].
<р> EGFR существует на поверхности всех клеток. С молекулярной массой 170KD, EGFR, имеет внеклеточный домен, домен кросс-мембранный и внутриклеточный домен. Внутриклеточный домен EGFR имеет 542 аминокислотных остатков и могут быть разделены на приближенное мембранным поддомена, тирозинкиназы подобласти, и С-концевой подобласти [18]. Процесс активирующий РЭФР включает фосфорилирование тирозина его внутриклеточного домена и различных сайтов фосфорилирования на домене связаны с различными путями сигнала. При активации EGFR, он может набирать эффекторные белки его фосфорилированного С-концевого субдомена и инициирует эффекторные белок-опосредованного пути [19], [20]. Среди сайтов фосфорилирования, тирозин 1068 и 1086 связаны с МАРК /ERK-опосредованного пути и тирозина и +992 1173 связаны с PLCγ-опосредованного сигнального пути [7], [8]. Наши предыдущие результаты показали, что PKG II может ингибировать EGF-индуцированной тирозин 1068 фосфорилирования EGFR в желудочном линии клеток рака КУП-823 [6], поднимая вопрос ли PKG II может ингибировать фосфорилирование других сайтов тирозина на EGF /EGFR и после этого иметь широкодиапазонное ингибирования на EGF EGFR-индуцированного сигнала /каскадов, и связанных с ними биологических активностей клеток рака желудка.
<р> В данной работе мы исследовали действие PKG II на EGF-индуцированной миграционной активности желудка линии клеток рака AGS. Результат показал, что PKG II имели существенное ингибирование миграции клеток, вызванной EGF. Это является еще одним доказательством для выявления опухоли угнетающее действие PKG II. Данные исследования показали, что среди /EGFR инициировал пути передачи сигналов EGF, PLCγ1 и МАРК /ERK пути передачи опосредованного сигнала связаны с миграционной активности [21], [22]. Чтобы подтвердить это в клеток рака желудка, мы использовали ингибитор трансдукции сигнала компонента, чтобы идентифицировать участие МАРК /ERK и PLCγ1-опосредованных путей в процессе. Результаты показали, что ингибитор МЕК U0126 и PLCγ1 ингибитор U73122 частично блокирована EGF /EGFR-индуцированной миграционной активности AGS клеток, что свидетельствует о том, что оба сигнальных путей передачи принимали участие в процессе регулирования. Для выявления потенциального ингибирующее действие PKG II на этих путей сигнальной трансдукции, мы впервые исследовали ингибирующее действие PKG II на ЭФР инициировал PLCγ1-опосредованной сигнальной трансдукции. Результаты показали, что PKG II предотвращены все основные события в этом пути передачи сигнала, включая Тир +992 фосфорилирования /активации EGFR, фосфорилирования /активации PLCγ1, формирование второго мессенджера DAG, освобождение кальция в цитоплазме, и активация PKC и CAMK IIα. Для ингибирования PKG II на EGF /EGFR индуцируется МАРК /ERK-опосредованного пути передачи сигнала, наша предыдущая работа показали, что PKG II ингибирует активацию всех ключевых компонентов в пути, индуцированного EGF в клетку рака желудка линии BGC-823 [ ,,,0],6]. В данной работе мы исследовали ингибирующее действие PKG II на EGF /EGFR-индуцированной активации ключевых компонентов этого пути. Результаты подтвердили, что PKG II ингибирует EGF-индуцированную активацию белка Ras и МАРК /ERK в клетках AGS, предполагая, что PKG II также ингибирует EGF /EGFR-индуцированной передачи сигнала MAPK /ERK-опосредованного пути в этой линии клеток рака. Эти результаты показали, что систематическое PKG II ингибирует EGF-индуцированную миграцию клеток рака желудка через блокирующие EGF /EGFR инициировал передачи сигнала PLCγ1 и MAP /ERK-опосредованных путей.
<Р> Сигнал трансдукция как PLCγ1 и MAP /ERK опосредованной пути могут активировать небольшой белок G Rac1, который является ключевым компонентом в регуляции клеточной миграции [23], [24]. Для того, чтобы подтвердить ингибирование PKG II на этом важном событии в EGF-индуцированной миграции газовых клеток, мы применили метод "ниспадающем", чтобы проверить активность Rac1 в по-разному обработанных клетках AGS. Результаты показали, что во время EGF-индуцированной миграции, Rac1 была активирована, и активация связана как PLCγ1 и MAP /ERK-обеспечиваемой передачи сигналов. Кроме того, PKG II ингибирует EGF-индуцированную активацию Rac 1. Это дополнительно подтверждается ингибирующее действие PKG II на EGF /EGFR инициировал миграцию клеток.
<Р> EGFR тесно связана с tumorigenensis. За экспрессии и мутации EGFR часто случаются в большинстве видов рака. Данные исследования показали, что более 50% -70% от рака легких, рака толстой кишки и рака молочной железы имеют высокий уровень экспрессии EGFR [25]. Кроме того, больные раком с сверхэкспрессией EGFR, как правило, имеют плохой прогноз. Например, EGFR избыточная экспрессия была обнаружена в 60% немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) больных и прогноз пациентов были бедными, с выживанием всего 4-5 месяцев [26]. В пробирке
эксперименты подтвердили, что избыточная экспрессия EGFR вызвала трансформацию NIH-3T3, Rat-1 и клетках NRK и блокирование активации EGFR угнетается пролиферацию некоторых опухолевых клеток [27]. Следовательно, EGFR, является первым фактором роста рецептора взятый в качестве целевой терапии рака. Существует несколько способов ингибирования активности EGFR и связанной с ними трансдукции сигнала, в том числе специфических антител против EGFR и ингибиторы EGFR, полученные интенсивные исследования [28] - [30]. Новые и более эффективные методы в блокировании EGFR-опосредованной трансдукции сигнала будет полезным в терапии рака. Таким образом, обнаружение того, что PKG II может ингибировать активацию EGFR и последующее трансдукции сигнала, имеет важное значение. Это наводит на мысль, что PKG II является потенциальным эндогенным ингибитором EGFR и обеспечит новый намек на стратегию терапии рака.
Материалы и методы
<р> желудка человека раковых клеток линии AGS была предоставлена Институтом клеточной биологии (Шанхай, Китай). Аденовирусные векторы, кодирующие бета-галактозидазу (ПАД-LacZ) и PKG II (ПАД-PKG II) были добрые подарки от доктора Герри Boss и д-р Ренате Пильца в Университете Калифорнии, Сан-Диего, США Дульбекко Modified СМИ Орла (DMEM) и фетальной бычьей сыворотки (FBS), были от GIBCO (Grand Island, NY). Антитела против PKG II был из ABGENT биотехнологии (Сан-Диего, Калифорния). Козье анти-β-актина, мышиное анти-пан-Ras, и мышиное анти-PLCγ1 антитела от Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Кролик анти-п-EGFR (Tyr1068), кролик анти-п-EGFR (Tyr992), кролик анти-EGFR, мышиное анти-п-ЭРК (Thr 202 /Тир 204), кролик анти-ЭРК и кролик анти-п-PLCγ1 (Tyr783) антитела были от Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Кролик против PKCα и кролик анти-п-CaMK IIα (Thr286) были из BioWorld Technology (Сент-Луис Парк, Миннесота). Кролик анти-п-Thr антитело из Abcam (MA, USA) .Horseradish пероксидазой (HRP) вторичные антитела были из Джексон Иммуно Research Laboratories (West Grove, PA). Сотовый аналоговый проницаемой цГМФ 8-PCPT-цГМФ из Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 и U0126 были от Sigma (St. Louis, MO). Электрохемилюминесценцию (ЭСЛ) реагенты от Millipore (Billerica, MA). Ca 2 + индикатор Fluo-3 /AM и мембранная и Цитозоль белка Extraction Kit были из Beyotime (Цзянсу, Китай). Человек диацилглицерин (DAG /DG) ELISA Kit был от Cusabio Biotech Co., Ltd. (Ньюарк, DE). Все другие реагенты были использованы аналитической чистоты.
Получение аденовирусных векторов
<р> 293А клетки трансфицировали аденовируса LacZ вектор кодирования и PKG II соответственно и культивировали в течение периода до десяти дней, пока CPE не был замечен. Клетки и культуральную среду собирали и прошли три цикла замораживания-оттаивания. Супернатант, содержащий аденовирусы (Ad-LacZ и Ad-PKG II) использовали для инфицирования новых клеток 293A для усиления аденовирусы. Усиленные аденовирусные препараты титруют и БОЕ /мл был определен, и выдерживают в температуре -80 ° С до использования.
Культура клеток и Инфицирование аденовирусные векторы
<р> AGS клетки культивировали в среде DMEM поставляется с добавлением 10% FBS и выдерживали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 95% воздуха и 5% CO <суб> 2. Среду меняли каждые два дня, и клетки были субкультивироваться при слиянии. За день до инфицирования клетки свеже высаживают на 70-80% слияния, и инфекция с Ad-LacZ и Ad-PKG II была выполнена.
Вестерн-блоттинга
"ниспадающем" Анализ активного белка Малый G Ras и Rac1
-transferase-Рас-РДО (ГСТ-РДО) при температуре 4 ° С в течение 1 ч. Гранулы промывали 3 раза буфером для лизиса и нагревают в кипяченой воде для высвобождения белков. Образцы белка (содержащего активный РАС), анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами против пан-Ras. Активный Rac1 был обнаружен с аналогичным методом, но с GST-PAK1 белка связывающего домена (GST-PBD) и антитела против Rac1.
иммунопреципитация
<р> Клетки, растущие на питательной пластины 100 мм отмывали два раза холодным PBS и лизировали добавлением 1 мл RIPa буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1% Тритон Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ лейпептин, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мМ NaF, 1 мМ Na <к югу> 3VO <суб> 4) на чашку. Антитела против PLCγ1 и п-PLCγ1 были использованы для иммунопреципитации. Осадок зондировали антителами против белков-мишеней.
Анализ кальция в цитоплазме
<р> Чтобы контролировать эффект EGF и PKG II на EGF-индуцированного высвобождения кальция, AGS клетки были загружены с 5 мкМ мембранного проницаемой индикатора кальция Fluo-3-ацетоксиметил (AM) эфира в течение 30 мин при 37 ° С в среде DMEM. После загрузки, клетки промывали PBS и суспендировали в DMEM. Измерения флуоресценции проводили с использованием системы конфокальной Olympus Fluoview-500. Fluo-3 возбуждалась аргонового лазера при длине волны 488 нм и флуоресценцию измеряли при длине волны 515 нм.
ELISA Анализ ДАГ
<р> концентрации DAG были измерены с помощью ELISA, в соответствии с инструкцией изготовителя , Этот анализ использует количественный сэндвич-метод иммуноанализа фермента. Антитело, специфичное к DAG был предварительно нанесен на микроплиты. Стандарты и образцы пипеткой в лунки и любой ДАГ присутствует связан с иммобилизованным антителом. После удаления несвязанного вещества, биотин-конъюгированные специфическое антитело для DAG добавляют в лунки. После промывки авидин конъюгированные пероксидазой хрена (HRP), добавляют в лунки. После промывания для удаления несвязанного реагента авидин-фермент, раствор субстрата добавляют в лунки и цвет развивается пропорционально количеству DAG, связанного в начальной стадии. Развитие цвета останавливается и интенсивность цвета измеряется.
внутриклеточного фракционирования
<р> внутриклеточного фракционирования в цитозольных и мембранных фракций проводили с использованием мембранной и Цитозоль Protein Extraction Kit, в соответствии с производителя инструкция. Однослойные культуры трижды промывали охлажденным льдом раствором PBS и соскабливают в холодном буфере дл гомогенизации (НВ), содержащем 20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 4 мМ ЭДТА, 2 мМ EGTA, 10% глицерина, 10 г /мл лейпептина, и 1 мМ ФМСФ. Клетки подвергали лизису с помощью обработки ультразвуком с 4-15-секундные интервалы и полный лизис контролировали микроскопически. Гомогенат ультрацентрифуге при 86000 г в течение 45 мин при 4 ° С, и супернатант был обозначен как цитозольной фракции. Осадок ресуспендировали в НВ, содержащем 1% Triton X-100 и инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем образцы центрифугировали при 14000 г в течение 20 мин при 4 ° С, и супернатант был определен в качестве мембранной фракции. Все образцы были вареные и осветляют центрифугированием.
Миграция клеток Анализ
<р> Миграционная активность клеток AGS были обнаружены Transwell системы (BD BioCoatTM Control 8.0 мм ПЭТ Мембрана 24-луночный культуральный вставки, BD Biosciences). После того, как трипсином, 5 * 10 4cells были посеяны в верхнюю камеру, содержащую питательную среду без FBS. Миграция клеток к нижней стороне мембраны индуцировали среде, содержащей 10% FBS, в нижней камере в течение 12 ч при 37 ° С в инкубаторе тканевых культур. Мигрировавших клеток на нижней стороне мембраны, фиксировали в 40% растворе параформальдегида в течение 30 минут, окрашивали в растворе Гимза в течение 10 мин, а затем промывают в воде. Окрашенные клетки были подвергнуты микроскопическому исследованию под световым микроскопом. Перенесенные клетки подсчитывали в 5 произвольно выбранных полях на вставке, а значения были усреднены. Все эксперименты проводились с тремя повторами при каждом условии миграции.
Статистический анализ
<р> были выражены данные, как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводился с использованием двух хвостами ANOVA с SPSS статистического программного обеспечения. A P
-value менее 0,05 считалось значимым.
Выражение признательности
<р> Мы благодарим доктора Герри Boss и д-р Ренате Pilz, Университет Калифорнии, Сан-Диего, США за теплые подарки аденовирусных конструкций.
Исследование:микробы, вызывающие сердечные приступы
Как массовые обследования помогли выявить больше случаев глютеновой болезни у детей
Микробиом кишечника также присутствует в жизни плода.
Микробиомы кишечника и полости рта предсказывают тяжесть COVID-19
Пробиотики как адъювантная терапия для пациентов с COVID-19
Повышение рисков биозащиты, создаваемых синтетической биологией
Микробиом полового члена является резервуаром для бактерий, связанных с бактериальным вагинозом.
Среди инфекций, передающихся половым путем (ИППП), бактериальный вагиноз поражает более 20 процентов женщин во всем мире. Заболевание возникает из-за размножения определенных бактерий во влагалище.
Панкреатит
Поджелудочная железа длинная, плоская железа, которая находится за животом в верхней части живота. Его основная задача - производить ферменты, которые помогают пищеварению человека, и гормоны, которые
Определение кислотонейтрализующей способности безрецептурных антацидов
USP описывает обратное титрование для определения кислотонейтрализующей способности (ANC). Метод очень быстрый, легкий, и надежный. Примечание по применению Metrohm AN T-192 включает эффективное опре