PLoS ONE: Podocalyxin в качестве прогностического маркера рака желудка в

Абстрактный

Фон
<р> Podocalyxin типа 1 (PODXL) представляет собой клеточную адгезию гликопротеин, связанный с агрессивным фенотипом опухоли и неблагоприятным прогнозом в нескольких формах рака. Целью данного исследования было изучение экспрессии PODXL при раке желудка с использованием двух различных антител.

Методы
<р> По микрочипов опухолью ткани и иммуногистохимии мы оценивали экспрессию PODXL в опухолевых образцах, взятых у 337 ​​больных который перенес операцию по поводу аденокарциномы желудка в больнице университета Хельсинки. Мы использовали два различных антител:. HPA2110, что поликлональное антитело и моноклональное антитело в доме под названием HES9, чтобы исследовать ассоциацию экспрессии PODXL с клиникопатологическими переменных и выживаемости пациентов

Результаты
<р> PODXL окрашивание было положительным по поликлональных антител в 153 (57,5%) больных и моноклональным антителом в 212 (76%). Выражение поликлональное антитело было связано с кишечным типом рака (р &л; 0,001). Окрашивание моноклональное антитело было связано с возрастом более 66 (р = 0,001), с кишечным раком (р &ЛТ; 0,001), а также с небольшим размером опухоли (≤ 5 см; р = 0,024). Оба антитела были связаны с высоким отношением сигнал-фазовой доли (р = 0,022; р = 0,010), а индекс пролиферации высокого опухоли (Ki-67, p = 0,003; р = 0,001). PODXL положительность с помощью поликлональных антител снижается выживаемость указано желудочного рака конкретных 5 лет 24,0% (95% ДИ 16.9-31.1), по сравнению с 43,3% (95% ДИ 33.7-52.9) для пациентов с PODXL негатива (р = 0,001 ). Результат оставался значительным в многофакторном анализе. (HR = 3,17; 95% ДИ 1.37-7.34, р = 0,007)

Вывод
<р> При раке желудка, экспрессия PODXL с помощью поликлональных HPA2110 антитела является независимым маркером плохого прогноза
<р> Образец цитирования:. Лайтинен A, Böckelman C, Хэгстром J, Коккола A, ФЕРМЕР C, Нильссон O и др. (2015) Podocalyxin в качестве прогностического маркера рака желудка в. PLoS ONE 10 (12): e0145079. DOI: 10.1371 /journal.pone.0145079
<р> Редактор: Ив Сен-Пьер, INRS, КАНАДА
<р> Поступило: 15 сентября 2015 года; Принято: 29 ноября 2015 года; Опубликовано: 16 декабря 2015
<р> Copyright: © 2015 Лайтинен и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано грантами от Finska Läkaresällskapet, Курт Doris оч Palander Фонда, Juselius Фонда Сигрид и medicínská understödsföreningen Лив оч Halsa. Fujirebio Диагностика AB и Onson Consulting оказывает поддержку в виде заработной платы для авторов CF и ON, но не было никакой дополнительной роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

в последние десятилетия заболеваемость раком желудка сократилась, особенно в западных странах, по-видимому, из-за снижение заболеваемости хеликобактерной
, чтобы лучше гигиены и менее людно жизни. Поскольку рак желудка имеет плохой прогноз, он по-прежнему во всем мире второй наиболее распространенной причиной, связанной с раком смерти [1]. Уровень 5-летней выживаемости, несмотря на хирургическое лечение, составляет лишь около 10-30% [2]. Высокая смертность, в основном из-за поздней диагностики.
<Р> UICC Опухоль Узел Метастазы (TNM) классификации на сегодняшний день является наиболее последовательной прогностической системы классификации на сегодняшний день. Тем не менее, даже в пределах одних и тех же опухолей групповой стадии, ход болезни может варьироваться. Создание методов для более точной оценки неоплазии агрессивности будет иметь значение при оценке прогноза отдельных больных раком желудка.
<Р> Podocalyxin типа 1 (PODXL) является антиадгезивная трансмембранный гликопротеин, принадлежащий к семейству CD34 , Оно выражается обычно почками подоцитах [3], гемопоэтических клеток-предшественников [4], сосудистый эндотелий [5], и эпителиальные клетки молочной железы [6].
<Р> Клиническая значимость PODXL в прогрессии рака было исследовано в различные типы карциномы, сначала в качестве маркера стволовых клеток в рака яичка [7]. Более поздний вывод, что опухолевые клетки-специфической экспрессии PODXL ассоциируется с более агрессивным фенотипом и неблагоприятных исходов в нескольких типах рака, например, при раке молочной железы [6], предстательной железы [8], рак яичников [9], ободочной и прямой кишки [10- 12], уротелиальная мочевого пузыря [13], поджелудочной железы [14], и periampullary рак [15].
<р> цель данного исследования состояла в том, чтобы исследовать экспрессию PODXL при раке желудка, чтобы выявить его возможную роль в агрессивности и прогнозе. Мы решили использовать два PODXL антитела, распознающие различные эпитопы: моноклональное в доме HES9 антитела и коммерчески доступный поликлональные HPA2110 антител. Недавно стало известно, что эти два антитела являются независимыми маркерами плохим прогнозом при колоректальном раке [12]. Два антитела могут распознавать две группы больных колоректальным раком, оба из которых имеют плохой прогноз; Совместное использование этих антител выявлена ​​группа пациентов с еще худшим прогнозом [16].

Материалы и методы

Пациенты
<р> Исследование включало 337 последовательных пациентов, перенесших операции по поводу гистологически проверено аденокарциномы желудка в отделении хирургии, Хельсинского университета больницы, с 1983 по 1999 г. Диагноз и постановка в соответствии с классификацией UICC при условии 100 (29,7%) стадии IA-IB, 41 (12,2%) II стадии, 96 (28,5%) этап IIIA-IIIB, и 100 (29,7%) пациентов IV стадии. Лимфатического узла метастазы имели место в 184 (55%) и отдаленные метастазы в 93 (28%) случаях. Средний возраст составил 66 лет (диапазон 30-87), и 163 (48%) составляли женщины и 174 (52%) мужчин. Полное или частичное гастрэктомии с расширенной (D2-D2 +) лимфаденэктомии была выполнена в 34 (10%) больных, тотальной гастрэктомии с D1-лимфаденэктомии в 161 (48%), и субтотальной гастрэктомии с D1-лимфаденэктомии в 142 (42%). В общей сложности 143 (43%) пациентов были прооперированы с лечебной целью, в то время как 176 (52%) подверглись паллиативные операции. Никто не получил неоадъювантной лечение, но 32 (9%) пациентов получали послеоперационное лечение адъювантной (28 химиотерапии, лучевой терапии 2; 2 получили оба). данные по выживаемости и причины смерти до ноября 2013 года пришли из историй болезни пациентов, регистр населения центра Финляндии и Статистическое управление Финляндии.
<р> Исследование было одобрено комитетом по этике хирургической больницы Хельсинского университета в силу (Dnro HUS 226 /E6 /06, расширение TMK02 §66 17.4.2013) и Национальный контролирующий орган социального обеспечения и здравоохранения дал разрешение на использование образцов ткани без индивидуального согласия в этом ретроспективном исследовании (Валвира Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

образцы тканей
<р> фиксированные формалином и залитые парафином образцы ткани хирургические пришли из архивов Департамента патологии. Ткани пациента были обезличенной и проанализированы анонимно. Гистопатологически репрезентативные участки опухолевых образцов были определены и нанесены на haematoxylin- и эозином окрашенных слайдах. Три ядра из каждого блока опухоли были отобраны с 0,6-мм перфораторы и заливали в новый парафиновый блок с помощью полуавтоматической microarrayer ткани (ткань Arrayer 1, Бичер Instruments Inc., Silver Spring, MD, США). Из шести блоков ткани массива подготовленных, каждый содержал 24-192 образцов опухоли. Разделы 4 мкм каждый были вырезаны и обработаны для иммуногистохимии.

Антитела
<р> Мы сравнили два PODXL антитела против различных эпитопов. Поликлональные антитела (HPA2110, Atlas антитела, Стокгольм, Швеция) был поднят против пептида с аминокислотными остатками 278-415 из PODXL, и моноклональное в доме антитела HES9 [12] распознает аминокислотные остатки 189-192 из PODXL , Оба эпитопы происходят во внеклеточной части молекулы PODXL. Последовательность эпитоп HPA2110 соответствует три кодирующих белок PODXL вариантов сплайсинга с 100% (PODXL 001, 005 и 201, белка человека Атлас). Четвертый вариант сплайсинга совпадает с 87% (PODXL 202). Эпитоп Последовательности HES9 соответствует 100% со всеми вариантами сплайсинга. Антитела подробно описаны [12,17,18].

Иммуногистохимия
<р> срезы фиксировали на предметном стекле и сушат в течение от 12 до 24 часов при температуре 37 ° С, а затем были депарафинировали в ксилоле и регидратации путем постепенного уменьшения концентрации этанола в дистиллированной воде. Для поиска антигена срезы обрабатывают в модуле предварительной обработки (Lab Vision, Corp., Fremont, CA, США) в буфере Трис-HCl (рН 8,5) в течение 20 минут при температуре 98 ° C. Срезы окрашивали в Autostainer 480 (Lab Vision) с помощью системы Dako РЕАЛЬНАЯ Envision Detection, пероксидазы /DAB +, Кролик /мышь (Dako, Glostrup, Дания). Срезы обрабатывают в течение 5 минут с 0,3% Дако РЕАЛЬНОГО пероксидаза-блокирующем растворе для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем предметные стекла инкубировали в течение 1 ч с поликлональными (разбавление 1: 250 = 2,5 мкг /мл) или моноклональное антитело (разведение 1: 500 = 5 мкг /мл) при комнатной температуре. В качестве положительного контроля для каждой серии окрашивания мы использовали образцы из почечной ткани.

озвучивание иммунореактивности
<р> HPA2110 и HES9 иммунопозитивность оценивали во всех доступных ядрах опухолевых. Цитоплазма PODXL и HES9 иммунопозитивность был забит как 0 до 3 на основе интенсивности раковых клеток иммунореактивности, а самый высокий балл из трех ядер служили для дальнейшего анализа. Отрицательный иммунореактивности был забит как 0, диффузный слабый цитоплазматический положительность как 1, умеренно позитивный или очаговым сильно положительной интенсивности, как 2, и равномерно сильной интенсивности, как 3. Все образцы были забиты независимо двумя исследователями (AL и JH) ослепленных для клинического состояния и исхода данные. Образцы с разноголосых оценки были пересмотрены, и счет консенсус служил для дальнейшего анализа. Мы были в состоянии обработать и счет HPA2110 окрашивания в 266 и HES9 окрашивания в 279 образцах.

Статистический анализ
<р> ассоциаций между HPA2110 и HES9 позитивности и клиникопатологическими переменных оценивали с помощью критерия хи-квадрат или точный критерий Фишера. Корреляция между этими двумя podocalyxin антител оценивали с помощью теста корреляции Спирмена. выживаемость без признаков заболевания удельная рассчитывалась с момента операции до смерти от рака желудка.
<р> Кривые выживаемости были построены по методу Каплана-Мейера и сравнивали с тестом logrank. Для univariable и многовариантного анализа выживаемости, модель Кокса пропорционального риска были следующие ковариаты вошли: возраст, пол, этап, оценка, классификация Лауренс, размер опухоли, локализация опухоли, экспрессия PODXL определяется HPA2110 окрашивания и HES9 окрашивания, ДНК плоидности, S- фазовая фракция, экспрессия Ki-67, и экспрессии p53. Стадия, класс, Лауренс классификация, размер опухоли, плоидности ДНК, S-фазовой доли, и экспрессия PODXL, HES9, Ki-67 и р53 были введены в качестве категориальных ковариатов. ДНК плоидности и S-фазы фракция была оценена ранее с помощью проточной цитометрии и р53, и экспрессия ткани Ki-67 с помощью иммуногистохимии [19,20]. Р-значение < 0,05 считалось статистически значимым. Все статистические анализы были сделаны с IBM SPSS Statistics версии 20.0 для Mac (IBM Corporation, Армонк, штат Нью-Йорк, США).

Результаты

Immunohistochemistry
<р> цитоплазмы HPA2110 реактивность, оценивали 266 случаев, был отрицательным в 113 (42,5%), слабо положительной в 120 (45,1%), умеренно позитивный в 29 (10,9%), а также сильно положительным в 4 (1,5%) случаях. Из 279 случаев успешно окрашивали для цитоплазматической экспрессии по HES9, 67 (24,0%) были отрицательными, 137 (49,1%) слабоположительны, 54 (19,4%) умеренно позитивный, и 21 (7,5%) сильно положителен. В конечном счете, слабый сильно положительным HPA2110 и HES9 иммунореактивности (баллы 1-3) считался положительным выражением. Типичные изображения immunostainings находятся на рис 1. Оба HPA2110 и HES9 окрашивают равномерно по всей цитоплазме, ядерной, ни клеток перепончатого иммунопозитивность заметной. Цитоплазмическая выражение podocalyxin с помощью двух различных антител HPA2110 и HES9 коррелировало (г <к югу> s = 0,455, р &л; +0001, Спирмена тест ранговой корреляции).

Ассоциация HPA2110 и ГЭК-9 с клинико-патологическими переменных и биомаркеры
<р> объединения HPA2110 и HES9 с клинико-патологическими переменных и молекулярных биомаркеров были следующим образом: положительный (баллы 1-3) HPA2110 окрашивание было связано с кишечным типом рака (р &л; 0,001), положительное HES9 окрашивание было связано с возраст старше 66 (р = 0,001), с кишечным раком (р &ЛТ; 0,001), а также с малым (≤ 5 см) размер опухоли (р = 0,024). Оба HPA2110 и HES9 были связаны с высоким отношением сигнал-фазовой доли (РСП, р = 0,022; р = 0,010) и высокий индекс пролиферации опухоли (Ki-67, р = 0,003; р = 0,001) (таблицы 1 и 2).

выживание анализ
<р> выражение Положительная HPA2110 указывают на 5-летней выживаемости при раке желудка специфичный 24% (95% ДИ 16.9-31.1), по сравнению с пациентами с отрицательным HPA2110 окрашивания с 5-летней выживание 43% (95% ДИ 33.7-52.9) (р = 0,001 лог-ранговый критерий) (рис 2 и таблица 3). Рак желудка специфических 5-летняя выживаемость больных с HES9-положительное окрашивание опухоли составила 30% (95% ДИ 23.1-36.1), а также для тех, кто с отрицательным окрашиванием, 40% (95% ДИ 27.7-52.1; р = 0,130 журнал -ранга тест) (рис 2).
<р> в анализе подгрупп HPA2110 было значительным маркером плохого прогноза в группах более молодых пациентов (в возрасте до 66 лет) (р = 0,006), так и для мужского пола (р = 0,002), рак диффузного типа (р = 0,001), а I стадия пациентов (р = 0,048) (рис 3 и таблица 3). В другие подгруппы изученных HPA2110 не служил в качестве прогностического маркера
<р> Выражение HPA2110 остается значительным в многофакторном анализе. (HR = 3,17; 95% ДИ 1.37-7.34, р = 0,007; таблица 4). Другие независимые прогностические факторы в многофакторном анализе были стадии, класс, и плоидности ДНК.

Обсуждение
<р> Здесь мы покажем, что выживание канцер-специфическая 5-летний был значительно лучше для больных раком желудка, имеющих PODXL -отрицательное опухоли. На самом деле, среди стадии 1 пациентов с PODXL-отрицательными опухолями, только один пациент умер от рака. В многофакторном анализе, положительное выражение PODXL служил в качестве независимого маркера плохого прогноза. Позитивное выражение PODXL как с помощью поликлональных антител HPA2110 и моноклональное антитело HES9 ассоциировалось с высоким SPF с помощью проточной цитометрии и Ki-67 окрашивания, причем оба они маркеров высокой пролиферации раковых клеток и, таким образом плохим прогнозом.
<Р> Положительный экспрессия PODXL обоими антителами был связан с кишечным типом рака, но PODXL-отрицательных опухолей оказалось не прогностическим маркером при раке кишечника. С другой стороны, канцер-специфическая 5-летняя выживаемость в подгруппе рака диффузного типа был значительно хуже для пациентов с PODXL-позитивных опухолей. Как правило, диффузный рак типа ассоциируется с плохим прогнозом, чем имеет тип кишечника [21].
<Р> Насколько нам известно, мы первыми сообщить о прогностическое значение для PODXL при раке желудка. Это было очевидно для некоторых других видов рака, как рак молочной [6], простаты [8], яичников [9], ободочной и прямой кишки [10-12], уротелиальная мочевого пузыря [13], поджелудочной железы [14], и periampullary рак [15] , Исследование, проведенное на колоректального рака показывают соответствия между первичными опухолями и соответствующими метастазами лимфатических у отдельных пациентов, и выражение PODXL также остается незатронутым неоадъювантной лучевой терапии. Эти данные подтверждают клиническую полезность PODXL как маркер неблагоприятного прогноза [22]. Здесь мы не изучали экспрессию PODXL в лимфатических узлах метастазов при раке желудка, и ни один из пациентов в этой группе получил предоперационной химиотерапии, хотя в настоящее время довольно обычным явлением. Эти эффекты предоперационной химиотерапии на экспрессию PODXL при раке желудка нуждается в дальнейшем изучении.
<Р> Мы использовали два антитела, распознающие PODXL, коммерчески доступного поликлонального HPA2110 антител и в доме моноклональное антитело HES9 [16]. Иммуноэкспрессии с помощью HES9 моноклональных антител была сильнее, чем с помощью поликлональных антител. Оба антитела окрашивают равномерно по всей цитоплазме, и ни окрашенных ядер, ни клеточной мембраны. Разнообразие в интенсивности окрашивания и распределение было более легким при использовании поликлональных антител, что делает скоринг более трудным. В основном PODXL является трансмембранной молекулы, и, следовательно, это было удивительно не найти его на клеточных мембранах в желудочном раковых клеток либо антитела. Смысл цитоплазматических, не-перепончатая, выражение PODXL, его роль и функции, нуждаются в дальнейшей оценке.
<Р> Эти различные антитела, которые мы использовали признать неравные части молекулы PODXL, вероятно, объясняет, почему их выражение в некоторых из образцы отличались и результаты не были идентичны. Каприо и др. [16], использовали эти же антитела в колоректального рака, и обнаружили интересное различие между узорами окрашивания. Поликлональные позитивности антител был мембранозной [9,10], но, моноклональное позитивности антител было очевидно, главным образом в цитоплазме. В колоректального рака, сильная положительность с обеих моноклональных и поликлональных антител выявили подгруппу пациентов с еще хуже выживания. Мы не нашли такого рода корреляции в образцах рака желудка. В целом, позитивности среди больных раком желудка была ниже, чем у больных раком толстой кишки. В колоректального рака около 94% случаев были положительными для PODXL с этими двумя антителами, в то время как в желудочном позитивности рака появился в 76% случаев с моноклональными антителами и в 58% с поликлональным антителом. Частота PODXL позитивности при раке желудка была близка к тому, что видели в рака груди и яичников (40% и 67%) [6,9].
<Р> PODXL представляет собой трансмембранный гликопротеин. Было показано, что муцинов, которые также являются гликопротеины, играют определенную роль в эпителиально мезенхимального перехода (EMT) [23,24]. Роль PODXL рака неизвестна, но можно предположить, что также PODXL может играть определенную роль в EMT. ЕМТ может объяснить, почему пациенты с высоким уровнем экспрессии PODXL имеют более низкий уровень выживания.
<Р> Сила этого исследования является большой больной когорты с раком желудка и длительного наблюдения с надежной клинической последующих времени и данных по выживаемости. По методике ТМА, только небольшие участки опухоли оценивают по сравнению с секциями цельной ткани. В колоректального рака, Ларссон и др. [22] обнаружили, что использование целых секций позволило идентифицировать большее количество опухолей, как PODXL-положительных, чем делали анализ TMA. Поскольку выражение PODXL неоднородна, использование техники ТМА может привести к недооценке положительных случаев. Скоринг как моноклональное антитело-и экспрессии поликлональные-антитела для некоторых образцов сложных; случаи с только несколько раковых клеток, и те, в которых значение раковых клеток, таким образом, не могут быть идентифицированы, были исключены из анализа. Это, отчасти, объясняет большое количество исключенных случаев. С другой стороны, метод ТМА позволяет анализ больших групп пациентов с однородным методом окрашивания.
<Р> В заключение PODXL иммунное служит независимым маркером плохим прогнозом при раке желудка. Это, по нашим данным, в первом докладе о прогностическое значение экспрессии PODXL при раке желудка. Дальнейшие исследования должны подтвердить эту ассоциацию и разрешить механизмы, с помощью которых PODXL влияет на развитие и поведение рака желудка.

Выражение признательности
<р> Мы благодарим Päivi Peltokangas и Элина Aspiala за отличную техническую помощь.

• Виды рака желудка
• PLoS ONE: DBGC: База данных человеческого рака желудка