PLoS ONE: Ganhos número de cópias em 8q24 e 20q11-q13 no câncer gástrico são mais comuns em Intestinal-Type que Difuso-Type

Abstract

O presente estudo teve como objetivo descobrir alterações no número de cópias de DNA (CNAs) envolvido na carcinogênese do estômago e compreender os seus significados clínico-patológicas na população coreana. número de cópias de DNA foram analisados ​​usando Agilent 244K ou 400K matriz comparativa hibridização genômica (aCGH) em tumor fresco congelado e tecidos normais correspondentes em 40 pacientes com câncer gástrico. Algumas das regiões CNA detectados foram validados utilizando MLPA (MLPA) em seis dos 40 pacientes e personalizado Agilent 60K aCGH em um conjunto independente de 48 cânceres gástricos. Os níveis de ARNm de genes de regiões comuns CNA foram analisados ​​utilizando quantitativa PCR em tempo real. número de cópias ganhos eram mais comuns do que as perdas em todo o genoma em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais correspondentes. O número médio de alterações por caso foi de 64 para ganhos e 40 para perdas, eo comprimento aberração média foi de 44016 pb para ganhos e 4732 bp para perdas. número de cópias ganhos foram frequentemente detectada em 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), e 20q11-q13 (25% -30%), e as perdas em 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%), e 17p13.3 (20% -23%). CNAs em 7p22.1, 13q34 e 17p13.3 não foram relatados em outras populações. A maior parte das perdas no número de cópias foram associados com a sub-regulação de níveis de ARNm, mas a correlação entre os ganhos no número de cópias e os níveis de expressão de mRNA variou de uma maneira dependente do gene. Além disso, do número de cópia ganhos tendem a ocorrer mais frequentemente em cancros do tipo intestinal do que em cancros do tipo difuso. Em conclusão, o presente estudo sugere que os ganhos no número de cópias em 8q24 e 20q11-q13 e perdas em 3p14.2 podem ser eventos comuns no câncer gástrico, mas CNAs em 7p22.1, 13q34 e 17p13.3 pode ser específica coreano.

Citation: Jin DH, Parque SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Copy Number Ganhos em 8q24 e 20q11-q13 no câncer gástrico são mais comuns em Intestinal-Type que Difuso-Type. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10.1371 /journal.pone.0137657

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO

Recebido: 08 de março de 2015; Aceito: 19 de agosto de 2015; Publicação: 11 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Jin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Os dados aCGH-244K e aCGH-400K pode ser baixado do portal Gene Expression Omnibus do NCBI. (Www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, número de acesso: GSE69318 e GSE69266, respectivamente)

Financiamento: este trabalho foi financiado por doações do National R & D Programa de Controle do Câncer, Ministério da Saúde e do Bem-Estar (p0270) e do Instituto Coreia Indústria Saúde para o Desenvolvimento (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde & Bem-estar (HI14C1979), República da Coreia

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer gástrico é a terceira principal causa de câncer. mortes no mundo. Apesar dos avanços significativos no diagnóstico e tratamento do cancro gástrico, as taxas de sobrevivência de cinco anos de pacientes com câncer gástrico permanecer abaixo de 30% na maioria dos países [1]. Além disso, cerca de metade dos pacientes que se submetem a ressecção cirúrgica curativa ainda desenvolver metástases loco-regionais ou distantes, apesar de a abordagem terapêutica de várias modalidades e morrem da doença [2,3]. Embora a maioria dos cancros gástricos exibir características clínicas semelhantes, existe uma considerável heterogeneidade em sua histopatologia e alterações moleculares associados [4]. Assim, é importante identificar biomarcadores moleculares envolvidos na carcinogênese do câncer gástrico para a detecção precoce e terapia-alvo da doença.

DNA número de cópias alteração (CNA) definidos como segmentos de DNA 1 KB ou maior em tamanho, é um importante tipo de alteração genética observada em células cancerosas [5]. CNA pode influenciar a expressão genética, a variação fenotípica e adaptação por perturbar as regiões reguladoras de ADN proximais ou distantes ou pela alteração dos níveis de dosagem de gene [6,7]. Além disso, a distribuição do número de cópias é significativamente diferente em populações ancestrais distintos, que podem resultar em diferentes susceptibilidade a doenças em todos os grupos ancestrais [8]. alterações Recentemente, vários grupos têm analisado de DNA número de cópias no câncer gástrico utilizando matriz de hibridização genômica comparativa (aCGH) e identificaram novos genes importantes na patogénese do cancro gástrico [9-14]. Por exemplo, Tsukamoto et ai. [10] investigou CNAs em 30 casos de câncer gástrico usando BAC ou clones do PAC, e identificadas as regiões mais frequentes de DNA número de cópias ganhos como 20q13, 20q11, 8q24 e 20p12, e os de perdas como 4q34-qter, 5q12, 18q21, e 3p14. Fan et al. [11] detectaram CNAs em 64 tecidos de câncer gástrico e 8 linhas celulares de cancro gástrico, utilizando clones BAC, e observou que 20q12-20q13 e 9p21 foram as regiões mais frequentemente amplificados e excluídos, respectivamente. Além disso, Cheng et al. [12] estudaram CNAs em 27 cancros gástricos por aCGH-244K e identificou 8p11-q24, 20q11-q13, e 7q21-q22 como as regiões mais adquiridas e 4q34, 6p25, 18q12 e 18q22 como as regiões mais perderam. Nestes estudos anteriores, vários microarrays (BAC ou PAC clone, oligo) foram aplicados para investigar CNAs no câncer gástrico, e as regiões CNA relatados foram diferentes para as diversas populações de estudo.

Para identificar CNAs importante na patogênese de câncer gástrico na população coreana, nós primeira realizada uma análise de todo o genoma do número de cópias de DNA usando aCGH-244K ou aCGH-400K em 40 cancros gástricos e depois validado as CNAs detectada usando um personalizado aCGH-60K em um outro conjunto de 48 gástrica cancros. Foram analisados ​​os efeitos de CNAs na expressão genética em alguns dos genes com CNAs.

Resultados

Descoberta de CNAs envolvidos na carcinogênese do estômago

Para descobrir CNAs envolvido em a carcinogénese do estômago, tumores e tecidos normais combinado a partir de 40 doentes com cancro gástrico foram analisados ​​por meio de matriz de hibridação genómica comparativa (aCGH); 30 casos por aCGH-400K e 10 casos por aCGH-244K. CNAs foram detectados em todo o genoma, e no número de cópias ganhos eram mais comuns do que as perdas no número de cópias (Fig 1A). O número de CNAs foi muito diferente entre os indivíduos. O número médio de CNAs por caso foi de 64 para ganhos e 40 para perdas (Fig 1B), ea duração média da região CNA era 44016 pb para ganhos e 4732 bp para perdas (Fig 1C). Os ANC comuns foram detectados utilizando um algoritmo corrigido ao contexto com um limiar de valor p de 0,05 e limite de sobreposição de 0,9 (Figura 1D). ganhos no número de cópias eram comumente detectada em regiões cromossômicas 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 e 20q11-q13, e cópia perdas numéricas foram frequentemente observados em 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 e 18q23 . As perdas foram amplamente detectadas nas extremidades dos cromossomas, eo tamanho era relativamente pequeno. O CNAs eram menos comuns nos cromossomas 2 e 15. Os comprimentos aberração comuns com um p-valor baixo, principalmente, caiu dentro de 1 kb-10 kb (Fig 1E). aberrações comuns em torno de MYC
gene em 8q24.21 são mostrados na figura 1F. Os dados aCGH-244K e aCGH-400K pode ser baixado do portal do NCBI Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Número de acesso: GSE69318 e GSE69266, respectivamente)

Validação dos aCGHs por análise MLPA

Alguns desequilíbrios genômicos detectado pelo aCGH foram validados usando a amplificação baseada em PCR multiplex dependente da ligação da sonda (MLPA). Seis das amostras de tecido de 40 analisados ​​utilizando aCGH estavam disponíveis para MLPA. alterações no número de cópias de MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATc1
(18q23), e NCOA3
(20q12) foram analisados ​​em seis tumor combinados e pares de tecido normal (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 e 685-2). MYC
foi amplificado em 271-1T e 301-1T (Fig 2A), NCOA3
foi adquirida na 301-1T e 685-2T (Fig 2B), e FHIT
foi eliminado na 271-1T, 301-1T e 685-1T (Fig 2A). Estes resultados eram altamente consistentes com os detectados pela aCGH. No entanto, as perdas no número de cópias de genes tais como WDR60
(Fig 2C), NFATc1
(Fig 2D), e COL4A2
(Fig 2E), que foram encontrados para ser perdido em aCGH, não foram detectadas na MLPA. O comprimento da região de deleção no gene WDR60
detectado por aCGH 2907 bp, e COL4A2
e NFATc1
foram 1.903 pb e 2596 pb, respectivamente. Com base nestas observações, é provável que as aberrações que abrangem pequenas regiões observadas pela aCGH pode ser falsa.

validação adicional das regiões CNA por aCGH-60K

Para validar e estreitar as regiões CNA da recorrente (> 20%) ganhos ou perdas observadas por aCGH nas 40 amostras de número de cópias, analisamos ainda mais as suas aberrações no tumor e tecidos normais correspondentes em mais 48 pacientes com câncer gástrico usando um personalizado aCGH-60K. As regiões CNA em 8q24, 20q11-q13, 3p14.2, e 18q23 mostrou alterações coincidentes de número de cópias no aCGH-60K, mas CNAs em outras regiões, como 20p13-20p12 e 20q21.2, não mostraram os mesmos padrões como no 244K e 400K, sugerindo, assim, resultados heterogêneos entre plataformas aCGH. Para encontrar regiões comuns mínimas (MCRs) de alterações no número de cópias entre as três plataformas, que se sobrepunham as regiões CNA em um total de 88 amostras. O MCRs de episódios recorrentes (> 20%) no número de cópias ganhos foram detectados em várias regiões cromossómicas incluindo 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%), e 20q11 ~ q13 (25% ~ 30%) (Tabela 1 e Tabela a em ficheiro S1). O MCRs da recorrente (> 20%) copiar as perdas de número também foram encontrados em sete regiões cromossômicas, incluindo 3p14.2 (43%) abrigando FHIT
(Tabelas 1 e B no Arquivo S1)

associação dependente gene-entre os níveis de mRNA CNAs e

Para investigar o efeito de CNAs na expressão do gene, medimos níveis de mRNA de genes múltiplos ( MYC
, Scrib
, PUF60
, BdP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
, NCOA3
, FHIT
, CRK
, e Smad2
) nas regiões de aberração comuns em 48 tumor e combinados tecidos normais e analisaram a associação com o CNA. O efeito da expressão do gene em ANC foi analisada por comparação da mudança de ARNm de dobragem (FC) em cancros com e sem CNA. A correlação entre as alterações no número de cópias e a expressão do gene correspondente foi diferente de acordo com a copiar os ganhos ou perdas numéricas. A maioria dos genes com perdas no número de cópias mostrou regulação negativa do mRNA: o nível de mRNA foi regulada negativamente no FHIT
(Tabela 2 e Figura 3A), CRK
, e Smad2
genes (Tabela 2). No entanto, encontramos a correlação entre ganhos no número de cópias e regulação positiva dos níveis de mRNA foi específico do gene: os níveis de mRNA em genes tais como MYC
, PUF60
, BdP1
(Fig 3B), e E2F1
foram positivamente associados com ganhos no número de cópias. No entanto, não foi encontrada associação entre os níveis de mRNA e copiar ganhos número de genes tais como Scrib
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, EYA2
e NCOA3
(Tabela 2), sugerindo que a relação entre ganhos no número de cópias e a expressão pode ser específico do gene.

Associação de CNAs com características clinicopatológicas

A associação entre as alterações no número de cópias e variáveis ​​clinicopatológicas foi analisado em 88 pacientes com câncer gástrico. Quinze genes com recorrentes (> 20%) copiar alterações numéricas foram selecionados para a análise. perdas no número de cópias de CRK
( P
= 0,07), Smad2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68), e NFATc1
( P
= 0,11) genes não variou significativamente entre os cânceres do tipo difuso e cânceres do tipo intestinal (Fig 3C). No entanto, no número de cópias ganhos tendem a ocorrer em uma alta prevalência em cancros do tipo intestinal do que em cancros do tipo difuso (Fig 3D e 3E, Tabela C no arquivo S1). Para Scrib
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22), e EYA2
( P
= 0,06), número de cópias ganhos ocorreram em uma alta prevalência em cancros do tipo intestinal do que em cancros do tipo difuso, mas a diferença não foi estatisticamente significativa. ganhos número de cópias de MYC
( P
= 0,03), BdP1
( P
= 0,03), e CD40
( P
= 0,01) foram encontrados em uma prevalência significativamente elevada em cancros do tipo intestinal em comparação com difusa do tipo de câncer. Para detectar CNAs Age-Related, analisamos correlação entre a idade do paciente e copiar mudança número utilizando coeficientes de correlação de Pearson, mas não encontrou nenhuma correlação foi encontrada entre a mudança do número de cópias de 15 genes e idade do paciente (Fig 4A). análise de agrupamento hierárquico foi realizada, a fim de os pacientes do grupo com CNAs similar. A maioria dos pacientes com ganhos no número de cópias em 8q24 também teve ganhos no número de cópias em 20q11.21 ou 20q13.12 (Fig 4B). Os dados foram divididos em 4 grupos de acordo com a presença de número ganhos de cópia no 8q24 e 20q11.21 (ou 20q13.12). número de cópias ganhos em 8q24 foi significativamente associada com número de ganhos de cópia no 20q11.21 ou 20q13.12 ( P
= 0,005, teste exato de Fisher; Tabela D no arquivo S1). Estas observações sugerem que as duas regiões, 8q24 e 20q11.21 (ou 20q13.12), pode ser igualmente suscetíveis a copiar ganhos número no câncer gástrico.

Discussão

A mudança da dosagem do gene pela CNA está sendo cada vez mais reconhecido como um componente importante de desenvolvimento de neoplasias. Para descobrir romance CNAs envolvido na patogênese do câncer gástrico, foi realizada uma análise de todo o genoma de CNAs no tumor e combinados tecidos normais de 88 pacientes com câncer gástrico e identificou recorrente (> 20%) copiar ganhos número em várias regiões cromossômicas incluindo 7p22 .1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 e um perdas correntes em 3p14.2, 4q35.2, 6q26, e 17p13.3. O CNAs em 7p22.1, 13q34 e 17p13.3 não foram relatados em outras populações. As regiões 7p22.1 identificados no presente estudo contêm os genes FBXL18, ACTB, ACTG1 e RNF216. Embora no SNAC em 7p22.1 não foram relatados no cancro gástrico, vários estudos relataram o seu impacto sobre o desenvolvimento de adenocarcinoma do ovário clara de células [15] e a endometriose [16]. Neste estudo, copiar alterações numéricas do MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), e NCOA3
(20q12) foram validados utilizando MLPA, mas copiar perdas numéricas ( WDR60
, COL4A2
,
NFATc1) de cerca de 2000BP não foram validados por MLPA. Nós não conseguiram realizar extensa estimativa computacional das taxas de falsos positivos de chamada baseada em array. Em vez disso, nós compararam a prevalência de perdas no número de cópias entre aCGH-244k & -400K Eo aCGH-60K com sondas de alta densidade de acordo com os tamanhos de perdas no número de cópias: 1kb-5 KB, 5kb-10kb, 10kb-50kb, 50kb-100kb, e 100k-. Diferenças estatisticamente significativas foram encontradas apenas nas perdas no número de cópias de tamanho pequeno (1kb-5kb) (Tabela E no Arquivo S1). Além disso, as diferenças significativas foram encontradas em forma específica do locus cromossômico: não foram encontradas diferenças nos cromossomos 3, 6, 16, 17 e 20 (dados não mostrados). Portanto, é possível que copiar as perdas numéricas do pequeno tamanho detectado em aCGH-244K e aCGH-400K pode ser falsa em algum loci.

Nós ainda analisados ​​regiões comuns mínimas de recorrente (≥10%) amplificação ou supressão em 88 cancros gástricos (Tabela F no arquivo S1) e comparou-os com o grande câncer gástrico TCGA (The cancer Genome Atlas) estudo (14) e três estudos anteriores (Tabela G no arquivo S1). O estudo TCGA era composta de 295 adenocarcinomas gástricos primários e identificou 30 amplificações focais e 45 eliminações focais. A amplificação (≥ 5 cópias) em 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ERBB2
etc.), 20q11.1-q13.33 (EYA2
, NCOA3
etc.) e exclusão (0 cópias) em 3p14.2 ( FHIT
) foram observados em nossos dados, bem como os dados do TCGA e estudos dos outros (Tabela G em ficheiro S1). No entanto, no SNAC em 7p22.1, 13q34, 17p13.3 e não foram relatados no estudo TCGA e outras populações. O número de regiões do CNAs identificados no estudo TCGA foi maior do que o presente estudo, o que pode resultar dos diferentes subgrupos de membros da amostra. O estudo consiste em TCGA maior do tipo intestinal (66,4%) em comparação com difusa do tipo cancros (23,4%).

Entre os genes localizados no 8q24.21, MYC é conhecido por promover o crescimento e a proliferação do normal as células gástricas, e knockdown de MYC
restringe o crescimento e proliferação de células de cancro gástrico [17]. MYC
codifica um factor de transcrição que regula uma série de genes relacionados com a proliferação, a diferenciação e a apoptose [18]. MYC
é amplificado e sobre-expresso em cancro gástrico [19], e sua expressão aumenta progressivamente à medida que o câncer se desenvolve [20]. MYC
amplificação está associada com o comportamento agressivo de células gástricas cancerosas [21,22]. Neste estudo, copiar ganhos número de MYC
foram encontrados em uma alta prevalência nos cancros do tipo intestinal, em comparação com os cancros do tipo difuso, apoiando a observação de que a expressão da proteína MYC é mais freqüentemente observada em intestinal- digite tumores do que em tipo difuso tumores [23]. Analisamos o efeito de MYC
CNAs na sobrevida global dentro de cada tipo. Pacientes com cópia ganhos número de MYC
tiveram sobrevida global pobre em comparação com aqueles sem, mas a diferença não foi estatisticamente significativa no tipo difuso e câncer tipo intestinal (S1 FIG). Os ganhos número de cópias do POU5F1B
(classe de domínio POU 5 fator de transcrição 1B) pseudogene em 8q24.21 foram encontrados em 27% das amostras analisadas. POU5F1B
é conhecida por estar associada com a abundância de mRNA e um fenótipo agressivo em câncer gástrico [24].

As regiões 8q24.3 e 20q11-q13 conter centenas de genes (Tabela A em S1 arquivo), mas muitos não são susceptíveis envolvida na oncogênese. Entre os genes localizados nessas regiões, foram analisados ​​os níveis de mRNA de Scrib
, PUF60
, e BdP1 Restaurant at 8q24.3 e SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
, e NCOA3 Restaurant at 20q11-q13 (Tabela 2). No presente estudo, copiar ganhos número de Scrib
, SNTA1
, CD40
, EYA2
, e NCOA3
foram não associada com uma alteração vezes nos níveis de ARNm. No entanto, o PUF60
, BdP1
, e E2F1
genes foram encontrados para ser significativamente sobre-expresso em tecidos tumorais com ganhos no número de cópias. PUF60
foi sobre-expresso em cancros com CNAs ( P
= 0,038), mas sua expressão não foi significativamente diferente entre os tecidos tumorais e combinados tecidos normais em amostras sem CNAs ( P
= 0,111). PUF60 (poli-L ligação ao factor de splicing 60kDa), um repressor-interagindo proteína de ligação fusíveis (FIR), desempenha um papel nos processos nucleares, tais como pré-mRNA splicing e a regulação da transcrição. Além disso, suprime PUF60 MYC
transcrição no promotor P2 através do factor de transcrição basal núcleo-TFIIH [25]. Recentemente, Gumireddy et ai. [26] relataram que PUF60 é necessário para a função do regulador de IncRNA reguladora de translação (treRNA), que está envolvida na invasão tumoral e metástases. número de cópias ganhos de PUF60
mostram uma forte correlação positiva com a expressão no câncer gástrico [27] e no cancro do ovário [28]. Estas observações sugerem que os ganhos no número de cópias de PUF60
pode ser um importante mecanismo subjacente à sobre-expressão do gene no câncer gástrico.

Em contraste com PUF60, o BdP1 e E2F1 foram encontrados para ser sobre-expresso em tecidos tumorais com o número de ganhos de cópia, bem como em aqueles sem. número de cópias ganhos de BdP1
e E2F1
neste estudo ocorreu em 23% e 25% das amostras estudadas, respectivamente. mRNA aumento dobrar mudança de BdP1
foi significativa em tecidos tumorais com ganhos no número de cópias ( P
= 0,024), bem como naqueles sem ( P Art < 0,001) . BdP1 (bloco de proliferação 1) é um componente do complexo PeBoW (PES1, BdP1, e WDR12), que é necessária para a maturação de 28S e 5.8S RNAs ribossomais e formação dos ribossomas 60S [29]. BdP1 desempenha um papel oncogénica no carcinoma hepatocelular, induzindo transição epitelial-mesenquimal (EMT) e promover a remodelação do citoesqueleto de actina [30]. O gene BdP1
é conhecido por ser sobre-expressos em câncer de reto com ganho de 8q [31], e aumento da dosagem do gene BdP1
está associada com um aumento de BdP1
mRNA no cancro colorectal [32]. A E2F1 também foi sobre-expresso em tecidos tumorais com ganhos no número de cópias ( P Art < 0,001) e naqueles sem ( P
= 0,03). E2F1 desempenha um papel crucial no controlo do ciclo celular e a sua actividade é regulada por meio de ligação a proteína do retinoblastoma de uma maneira-ciclo celular dependentes. A sobre-expressão de E2F1 está associada com o desenvolvimento de uma variedade de tumores, e o aumento do número de cópias de E2F1
é conhecida por estar associada com a sobre-expressão do gene em melanoma [33] e o cancro cervical [ ,,,0],34]. Com base nestas observações, é provável que o impacto global dos ganhos no número de cópias na expressão do gene no câncer gástrico varia de um modo dependente do gene.

Embora os ganhos no número de cópias em 13q34 não foram relatados no câncer gástrico, o ganhos foram encontrados em 20-30% das amostras estudadas. ganhos número de cópias em 13q34 são conhecidos por estarem associados com a progressão da neoplasia intra-epitelial cervical para o carcinoma de células escamosas [35] e com uma pequena adenocarcinoma intestinal [36]. número de cópias ganhos em 17q12 são frequentes no câncer gástrico. No presente estudo, vários genes, incluindo ERBB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
e C17orf37, foram amplificados em 15-20% dos 88 casos, de acordo com outros estudos [37,38]. Nós não avaliar a correlação do número de cópias e expressão níveis dos genes, mas vários grupos relataram que os genes são importantes para o desenvolvimento de câncer gástrico. Entre eles, ERBB2 (HER2)
é frequentemente amplificado e sobre-expresso em cancros gástricos [39-41], e amplificação de HER2
foi fortemente associada com a sobrevivência pobres, particularmente na intestinal tipo de câncer gástrico [42]. A imunorreactividade de ErbB2 também ocorre a uma taxa mais elevada prevalência em tipo intestinal do que nos subtipos difusas [43]. Além disso, o PPP1R1B-STARD3
transcrição de fusão no cancro gástrico humano aumenta a formação de colónias por meio da ativação de phosphatidylinosil-3-quinase e AKT sinalização [44]. amplificação frequente de GRB7 Comprar e mudanças positivas na expressão também foram relatados no câncer gástrico [41,43].

As perdas mais freqüentes neste estudo foram detectados em 3p14.2 (39% em difundem-tipos e 37% dos tipos intestinais), onde FHIT
está localizado. FHIT
é um gene supressor de tumor conhecido [45], e é muitas vezes envolvidos na perda de heterozigosidade (LOH) e deleções em tumores humanos [46]. carcinomas gástricos primários representam um rearranjo do gene FHIT Comprar e 20 de 30 (67%) amostras exibiram uma ausência de FHIT
expressão da proteína [47]. Perda de FHIT
expressão da proteína se correlaciona com a progressão da doença e pobres diferenciação no câncer gástrico [48]. No presente estudo, observou-se que FHIT
expressão foi reduzida em cânceres gástrico com ou sem a sua CNA, sugerindo que a dosagem do gene, bem como outros mecanismos de regulação expressão FHIT
no câncer gástrico. Uma mutação somática missense (exão 6, códon 61, ACG → ATG) da FHIT
também foi identificado em cancros gástricos [49]. Além disso, uma elevada frequência de hipermetilação do promotor de FHIT
(62%) é observada em cancros gástricos [50]. Portanto, a integração de dados no número de cópias com dados genômicos adicional é essencial para compreender de forma abrangente o controle genético da expressão genética [51].

Copiar perdas número de vários genes neste estudo não foram significativamente diferentes entre os cânceres do tipo difuso e cancros do tipo intestinal. No entanto, a prevalência do número de ganhos de cópia foi diferente entre os dois tipos em determinados genes, sugerindo que fatores ambientais podem ser mais influente na cópia ganhos número do que perdas. Além disso, os pacientes com ganhos no número de cópias no 8q24.21 8q24.3 e tendiam a ter ganhos em 20q11-q13, sugerindo as duas regiões podem ser igualmente susceptíveis de variação do número de cópias. Este estudo foi severamente limitada devido ao pequeno número de amostras e à falta de dados de sobrevivência. Um estudo mais aprofundado em uma grande coorte é necessário para compreender o significado funcional de CNAs descoberto neste estudo. Além disso, as medições de ARNm não foram realizadas a um nível do genoma. Foram analisados ​​relação entre os níveis de ARNm de genes que se sabe serem importantes na patogénese de cancro humano e o CNA. Uma correlação significativa foi encontrada entre os níveis de expressão MYC
, PUF60
, BdP1
, e E2F1
genes e sua CNAs (Tabela 2) . A correlação estatisticamente significativa entre CNAs de MYC
, PUF60
, e E2F1
genes e seus níveis de expressão foi também encontrado por Fan et al. (11). No entanto, estudos adicionais são necessários para compreender claramente o efeito de CNA na expressão do gene. Em conclusão, o presente estudo sugere que o número de cópias de ADN ganha em 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 e perdas em 3p14.2 podem ser eventos comuns no câncer gástrico. No entanto, no SNAC em 7p22.1, 13q34, 17p13.3 e pode ser Coreano-específica. Além disso, o número de cópias ganhos podem ser mais frequente em intestinal do tipo de câncer gástrico tipo difuso.

Materiais e Métodos

População do estudo e DNA extração

Um total de 88 pacientes, 35 mulheres e 53 homens, que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica curativa para câncer gástrico entre novembro de 2004 e outubro de 2010 no Departamento de Cirurgia do Centro Médico Samsung, Seoul, Coreia do Sul, participaram deste estudo. tecidos tumorais removidos cirurgicamente foram coletadas após a obtenção do consentimento informado por escrito de todos os pacientes. Este estudo foi aprovado pela Samsung Medical Center (SMC) Institutional Review Board (IRB). Os tumores foram congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até ser necessário. Antes da extracção de ADN a partir dos tecidos congelados frescos, as secções foram colocadas em lâminas e coradas com H & E para avaliar a mistura de tecidos tumorais e não tumorais. áreas tumorais e não tumorais foram microdissecadas cuidadosamente sob um microscópio. Os tecidos foram microdissecadas digerido com proteinase K, e o ADN genómico foi isolado de acordo com as instruções do fabricante (kit DNeasy Tissue, Qiagen, Valencia, CA). A amostra foi composta de 43 cancros do tipo difuso, 41 intestinal-tipo, e 4 de tipo misto cancros.

análise CNA usando aCGH

O aCGH foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante. Após a hibridização DNA e lavagem, as lâminas foram digitalizadas imediatamente, usando um scanner de microarray da Agilent, e os dados brutos foram extraídos utilizando Software Feature Extraction nas definições de parâmetros CGH padrão (Agilent Technologies). intervalos putativo CNA em cada amostra foram identificados utilizando software v7.0.4.0 Agilent Genomic Workbench. rácios Cy5 /Cy3 foram convertidos em log _{valores 2-transformado. Centralização e difusos de zero correções foram aplicadas ao microarray. O (ADM-2) algoritmo Aberration Método de Detecção 2 em limiar de 6,0 foi utilizado para identificar o ANC em amostras individuais e para determinar as frequências de aberração em amostras de cancro gástrico (Fig 5). Foram utilizados os seguintes filtros: número mínimo de sondas na região > = 3, proporção média mínima absoluta log da região > = 0,25. aberrações comuns foram detectados usando o algoritmo corrigido ao contexto em p-valor < 0,05 e um limite de sobreposição de 0,9. O CNAR (Copie Número Alteração Região) foi definida como a união de mais de 90 por cento segmentos aberrantes que se sobrepõem em várias amostras. A montagem do genoma hg19 UCSC foi usado como referência a sequência do genoma humano. Para cada plataforma (244K, 400K e 60K), o método de normalização Lowess global dentro matriz foi aplicado para corrigir o viés espacial local e gradientes espaciais contínuas. Após o prazo matriz de normalização, um quantil entre normalização matriz foi aplicado para comparar os resultados de aberração em toda matrizes. Estes normalizations foram realizadas utilizando o pacote de limma em R. O MCR (região comum mínima) foi definida como 100 por cento de sobreposição entre amostras região comum na CNAR. Existem vários MCRs na CNAR de acordo com a possível frequência de sobreposição. O MCR de amplificação e deleção foi analisada. Amplificação e deleção foi definida quando a razão log2 normalizada foi ≥0.8 e ≤-0.8, respectivamente. Todos os métodos estatísticos e visualização de regiões aberrantes individuais foram conduzidos utilizando v.3.0.2 R linguagem estatística (www.r-project.org).}

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) Análise

MLPA foi realizada utilizando o kit de P200 SALSA MLPA (MRC-Holland, Amsterdam, Países Baixos) de acordo com as instruções do fabricante [52]. O kit contém P200 14 sondas de controlo interno a fim de avaliar a desnaturação do ADN e a quantidade de ADN, e também para o cromossoma X e Y. As amostras de ADN foram diluídos com TE para 5 mL e foram aquecidas a 98 ° C durante 5 min em tubos de PCR num termociclador com uma tampa aquecida. Após a adição de 1,5 ul de tampão MLPA e 1,5 ul de mistura de sonda, as amostras foram ainda aquecida durante 1 minuto a 95 ° C e, em seguida, incubadas durante 16 h a 60 ° C. As sequências de sondas para genes detectados estão listados na Tabela H em Ficheiro S1. A ligação de oligonucleótidos emparelhados foi realizada por diluição das amostras até 40 ul com um tampão de diluição contendo 1 U de enzima ligase-65, e incubar durante 15 min a 54 ° C. A enzima ligase foi inactivada por aquecimento a 98 ° C durante 5 min e a ligação produtos foram amplificados por PCR. Enquanto a 60 ° C, foram adicionados 10 ul de uma solução tamponada contendo a iniciadores de PCR, dNTP e salsa polimerase (MRC-Holland, Amsterdam, Holanda). A PCR foi realizada durante 35 ciclos (30 s a 95 ° C, 30 s a 60 ° C e 1 min a 72 ° C). As reacções de PCR foram separados MPLA, usando o sistema de electroforese capilar, ABI-Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), e os dados foram analisados ​​utilizando um GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA). Dados foi população normalizada, e os rácios de sonda inferior a 0,75 foram considerados como uma indicação de supressão, enquanto que proporções acima de sonda de 1,25 foram considerados como uma indicação de amplificação.

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)