PLOS ONE: IGFBP3, uma transcrição alvo de homeobox D10, está correlacionada com o prognóstico do câncer gástrico

Abstract

homeobox D10 (HoxD10) desempenha um papel importante na diferenciação de células embrionárias e progressão do câncer de mama. O nosso relatório anterior revelou que o fator de crescimento semelhante à insulina de ligação proteína-3 (IGFBP3) foi regulamentada pelo HoxD10 em células cancerosas gástricas; No entanto, os papéis funcionais e mecanismos subjacentes de IGFBP3 em cancro gástrico permanecem obscuros. Aqui, descobrimos que a expressão de IGFBP3 foram upregulated após a expressão ectópica de HoxD10 em células cancerosas gástricas. ensaio de imunoprecipitação mostraram que a cromatina HoxD10 ligado a três potenciais regiões de promotor IGFBP3. HoxD10 exógena aumentou significativamente a actividade do repórter de luciferase contendo estas regiões de ligação em células de cancro gástrico. Outros dados mostraram que todos estes sítios de ligação tinha ligação Hox elemento "TTAT". Resultados da coloração imuno-histoquímica revelou que a expressão foi significativamente regulada negativamente IGFBP3 em 86 tecidos adenocarcinomas gástricos em relação aos seus tecidos não cancerosos adjacentes (p < 0,001). Além disso, a expressão IGFBP3 foi significativamente inferior em tumor gástrico com linfonodo metástases comparada com a linfa sem metástases (p = 0,045). Os pacientes com nível de IGFBP3 alta expressão mostrou sobrevida global cinco anos favorável (p = 0,011). Knockdown de IGFBP3 acelerou a migração de células de cancro gástrico e invasão e induzida a expressão de factores incluindo invasivos MMP14, uPA e uPAR. Assim, nossos dados sugerem que IGFBP3 gene HoxD10-alvo pode suprimir a invasão de células de câncer gástrico e favorece a sobrevivência de pacientes com câncer gástrico

Citation:. Xue M, Fang Y, Sun G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et ai. (2013) IGFBP3, uma transcrição alvo de homeobox D10, está correlacionada com o prognóstico do câncer gástrico. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10.1371 /journal.pone.0081423

editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de junho de 2013; Aceito: 13 de outubro de 2013; Publicação: 27 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xue et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) e Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais frequente e atualmente é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Quase metade dos pacientes Caner gástricas já avançou para a fase tardia com linfático ou metástases à distância no momento do diagnóstico e perder a oportunidade para a cirurgia [2]. Estes pacientes têm um mau resultado ea taxa de sobrevivência de cinco anos para aqueles com metástases à distância é inferior a 5% [3]. A progressão do cancro gástrico é considerado para ser um processo de múltiplos passos que envolve a activação de oncogenes e inactivação de genes supressores de tumores. Temos anteriormente apresentado que homeobox D10 (HoxD10) serviu como um supressor de tumor por supressão do crescimento do tumor e invasiva, o que foi epigeneticamente silenciados no cancro gástrico [4].

gene HoxD10 pertence à superfamília homeobox, que fatores de transcrição de codificação e exercer funções principalmente através da activação ou repressão de genes alvo a jusante [5]. braço amino-terminal da homeodomain Hox tem várias ligação de consenso elementos centrais, incluindo TTAT, TAAT e TTAC [6,7]. Por exemplo, HoxC8 liga-se a estes elementos em regiões do promotor e modula a actividade de transcrição de PEDF, NCAM, Zac1, OPN e Cdh11, tal como determinado por ensaios de alta ao longo da cromatina imunoprecipitação e análise global site HoxC8 ADN de ligação [7]. Estudos têm demonstrado que HoxD10 inibe a motilidade angiogênese e celular no câncer de endométrio (CE) [8] e prejudica a capacidade de invasão das células de câncer gástrico e da mama [4,9]. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos de como HoxD10 exerce suas funções na carcinogênese e progressão tumoral. Temos rastreados sistematicamente os alvos potenciais de HoxD10 por microarrays de ADNc e identificar genes múltiplos, incluindo a ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina de proteína-3 (IGFBP3) que pode ser responsável pelo efeito supressor de tumor de cancro gástrico HoxD10 em [4].

IGFBP3 é uma espécie principal IGFBP na circulação, mais de 75% de ligação de insulina circulante crescimento factor-I (IGF-I) [10]. Pode inibir a proliferação celular e induzem a apoptose de células de vários tipos de cancro, incluindo cancros da próstata e gástricas [11,12]. Vários estudos têm confirmado que IGFBP3 suprime a invasão de cancro do endométrio (CE) células [13], metástase no câncer de próstata [14], e angiogênese no carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) [15]. Foi geralmente considerado que IGFBP3 poderia bloquear a região de ligação de IGF-I no seu receptor de IGF-IR, assim abolir o efeito de IGF /IGF-IR eixo. Para além da dependência do eixo de IGF /IGF-IR, existe de IGF /formas alternativas de IGF-IR e independentes de translocação nuclear [10]. Muitos factores têm sido clarificado para regular a expressão de IGFBP3, incluindo o ácido retinóico, factor de necrose tumoral-α, tricostatina A, caudal tipo homeobox 2 (CDX2) e o estado de metilação de si [10,16]. Os nossos estudos anteriores mostraram que IGFBP3 foi regulada positivamente em células AGS e MKN28 sobreexpressando HoxD10 [4]. Considerando a região promotora de IGFBP3 tem vários locais de ligação potenciais para HoxD10, previstos por PROMO, um programa para a previsão de sítios de ligação fator de transcrição [17], HoxD10 pode interagem diretamente com IGFBP3 na regulação da invasão de células de câncer gástrico. A elucidação desta rede seria fornecer mais insights sobre o papel da IGFBP3 no câncer gástrico.

No presente estudo, identificamos que HoxD10 poderia vincular diretamente as regiões promotoras de IGFBP3 potencialmente através do elemento TTAT, assim, regula a transcrição sua expressão no câncer gástrico. Além disso, o nível de expressão IGFBP3 é frequentemente regulados negativamente nos tecidos de cancro gástrico e relacionados com a sobrevivência global, o que sugere que IGFBP3 desempenha um papel importante na progressão do cancro gástrico. Funcionalmente, IGFBP3 poderia suprimir a migração e invasão das células cancerosas gástricas, pelo menos em parte, através da regulação desses fatores invasivos, incluindo metaloproteinase-14 (MMP14) e do tipo uroquinase ativador do plasminogênio (UPA).

materiais e Métodos

cultura celular

Oito linhas celulares de cancro gástrico (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 e SGC7901) foram obtidos a partir Riken Gene Bank (Tsukuba, Japão) e American Type Culture Collection (Manassas, EUA). Um não-malignas linha celular gástrica (GES-1) foi obtido a partir de Pequim Instituto de Pesquisa do Câncer (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Sijiqing, Huzhou, China), e incubadas em 5% de CO _{2, 37 ° C e 95% de humidade.}

Construção de plasmídeos repórter IGFBP3 luciferase

Três fragmentos diferentes na região promotora do IGFBP3, incluindo -2.282-56 pb (2,3 kb, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 pb (HoxD10 local I, HBSI) e -1727 ~ -943 pb (HBSII), foram amplificados por PCR utilizando ADN genómico extraído a partir de células selvagens HEK-293T como o modelo de ligação. HBSI engloba HBS1 e 2, contém HBSII de HBS3, 4 e 5, em que são previstos por HBS1-5 PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. sequências iniciadoras HBS foram como se segue: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'e 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'e 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'e 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. Os fragmentos de PCR foram ligados em PGM-T vector (Tiangen, Pequim, China), digerido com KpnI /BglII (Promega, Madison, EUA) e, em seguida, sub-clonado nos locais KpnI /BglII do vector pGL3-basic (Promeg) para gerar plasmídeos repórter de luciferase pGL3-pIGFBP3-base, e o vector pGL3-promotor (Promega) para produzir (II) -promoter plasmídeos repórter de luciferase pGL3-HBSI. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN.

Construção de plasmídeos repórter da luciferase de HBSS

sintetizados oligonucleótidos com os locais de ligação previstos Hox (HBSS) nas regiões promotoras de IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) e cada um com o site mutante único ponto (A → C), oligonucleotídeos foram os seguintes:

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'e 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

HBS3 mutante, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'e 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'e 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';

HBS4 mutante, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'e 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'e 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';

HBS5 mutante, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'e 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.

O HBSS de cadeia dupla foram emparelhados e inseridos no vector a montante do promotor pGL3-para gerar os plasmídeos repórter da luciferase [18]. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN.

celular transfecção

células cacner gástrica (BGC823 e SGC7901) foram transfectadas com pcDNA3.1-HoxD10 ou pcDNA3.1 vector vazio usando Fugene� HD (Promega) . Para gerar linhas celulares estáveis ​​HoxD10 superexpressão, acima células transfectadas foram seleccionadas em 400 pg /ml de G418 (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante mais 14 dias. Para silenciamento de genes mediada por siRNA, BGC823 e SGC7901 células foram transfectadas com controle negativo siRNA ou siRNA (Qiagen, Hilden, Alemanha), as células HGC27 foram transfectadas com controle negativo siRNA ou segmentada por HoxD10 siRNA (Genepharma, Xangai, China) segmentadas IGFBP3 utilizando Lipofectamina RNAiMAX Reagent (Invitrogen).

A actividade da luciferase ensaio

1,0 × 10 ^{5 BGC823 e SGC7901 células foram semeadas em placas de 24 poços durante 24 horas, em seguida, transfectadas com pcDNA3.1 0.4μg vector vazio ou pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-basic (promotor) vector vazio ou pGL3-pIGFBP3 (HBS) -Basic (promotor), e 0.004μg pRL-TK vector (Promega) contendo Renilla controlo de referência usando Fugene� HD [18]. A actividade da luciferase foi analisada pelo sistema de ensaio de repórter duplo de luciferase após 48h de acordo com os protocolos do fabricante (Promega).}

Cromatina imunoprecipitação

Em estável HoxD10 overexpressed linhas celulares BGC823 e SGC7901 (CHIP)
, a cromatina foi imunoprecipitado com anticorpo monoclonal HoxD10 (coelho, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, EUA) [19] ou de IgG de coelho normal (controlo negativo), de acordo com o kit de simples ChIP enzimática cromatina IP (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , EUA). ADN precipitados ou amostras de entrada de 2% com o ADN genómico a partir de células selvagens HEK-293T foram amplificados com Taq DNA polimerase (Takara, Otsu, Japão) [20,21]. Quatro iniciadores abrangendo HBSS nos diferentes locais de promotor IGFBP3 foram concebidos como se segue: A1 (-2251 ~ -2073 pb, para HBS1 e 2,), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'e 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 pb, para HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'e 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp, para HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'e 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp, por HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'e 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.

A transcrição reversa-PCR

O RNA total foi isolado com Trizol reagente (Cwbiotech, Beijing, China). A transcrição reversa (RT) -PCR foram determinados com M-MLV de transcriptase inversa (Takara) e Taq DNA polimerase. Os seguintes iniciadores foram utilizados para amplificação:

GAPDH, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'e 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'e 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'e 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'e 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'e 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'e 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'e 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';

inibidor de tecido de metaloproteinase-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'e 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'e 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';

uPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'e 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'e 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

Western Blotting

As proteínas totais foram extraídas com tampão de lise RIPA (Beyotime, Haimen, China). Triton X-100 tampão de lise foi utilizado para extrair a E-caderina e solúvel SS-catenina, tampão de lise de SDS foi usado para extrair o complexo insolúvel de E-caderina /catenina SS-[22]. Os lisados ​​foram separados em gel de SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Bedford, EUA). As manchas foram sondadas com HoxD10 (1: 1.000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), a caderina-E (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), SS-catenina ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) ou GAPDH (1: 2500 de anticorpos, Cwbiotech). As manchas foram visualizadas utilizando um quimioluminescência com Las-Imaging System 4000 (Fujifilm, Tóquio, Japão). As densidades relativas de proteínas foram quantificadas com imagem J. software e normalizadas para GAPDH [20].

-cicatrização de feridas ensaio

BGC823 e SGC7901 células foram transfectadas com IGFBP3 ou ARNsi de controlo negativo placas de seis poços e então riscado com uma ponta de p10 pipeta para criar uma lacuna. Os poços foram lavados com PBS para remover as células deslocadas e meio fresco (1% de FBS para BGC823 e soro livre para SGC7901) foi adicionado. Três imagens aleatórias das áreas riscados foram tomadas (40 × ampliação) sobre 0h, 12h e 24h [23].

migração e invasão ensaios Transwell

A migração celular e invasão foram avaliadas pela Boyden modificado câmaras Transwell (Corning Inc., Corning, EUA), revestido com (por invasão) ou sem (por migração) Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, EUA). células de transfecção e fome siRNA foram plaqueadas para a câmara superior em meio de cultura contendo 1% de FBS (BGC823) ou sem FBS (SGC7901), meio contendo FBS a 15% foi adicionado para a câmara inferior, as células na câmara superior foram cuidadosamente removidas após incubação durante 16 h (para a migração) ou 36h (para invasão). células migradas foram coradas com 0,5? g /mL de DAPI Staining Solução (Roche, Penzberg, Alemanha). Os números de células foram contadas em cinco campos aleatoriamente (400x ampliação) [24]. células invadidas foram incubadas com solução de células Mancha (Millipore) e fotografado (200x). A mistura de corantes foi lavada com tampão de extracção e transferida para um de 96 poços para a medição colorimétrica a 560 nm em um leitor de microplacas (Thermo, Boston, EUA) [25,26].

Pacientes e amostras
86 cirurgia de adenocarcinoma gástrico foram inscritos a partir de maio de 2007 a fevereiro de 2008, após a assinatura do consentimento informado. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Sir Run Run Shaw Hospital da Universidade de Zhejiang Ética em Pesquisa Clínica. Foram obtidos tecidos tumorais combinados e tecidos livres de tumor adjacentes. dados clínico-patológicos dos pacientes, incluindo sexo, idade, estágios TNM e as notas patológicos foram recuperados de registros médicos. O acompanhamento foi realizado em um intervalo de 1 ano após a cirurgia, uma história médica foi gravado quando o paciente veio para a visita subsequente. O tempo de corte de acompanhamento foi de agosto de 2012, eo tempo médio de acompanhamento foi de 35 meses (variação, 1-63 meses).

microsséries de tecido e imuno coloração

Cores medindo 1,5 milímetros na sua maior dimensão foram perfurados a partir de áreas não necróticas de tecidos tumorais combinados e tecidos livres de tumor adjacentes. lâminas de tecido microarray contendo seções de microarray grossas 4μm foram construídos utilizando técnicas padrão (em colaboração com Xangai superchip Company, Ltd., Shanghai, China). As lâminas foram incubadas com anticorpo IGFBP3 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) durante a noite a 4 ° C, e, em seguida, incubadas com o sistema de detecção Envision-plus (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Copenhaga, Dinamarca). As secções foram desenvolvidas em solução de 3,3'-diaminobenzidina sob observação microscópica e contrastadas com hematoxilina [27]. Os tecidos de cancro da mama avançado foram coradas como controlo positivo [28]. A proporção de células positivas em cada amostra foi quantificada ao microscópio e classificados em quatro grupos. 0: 0-5% de células positivas; 1: 6% a 50% de células positivas; 2: 51% a 75% de células positivas e 3: células positivas 76-100%. A intensidade de coloração IGFBP3 foi classificada como se segue: sem coloração = 0; coloração fraca = 1; coloração moderada = 2; coloração densa = 3. A pontuação da intensidade, mais a proporção de coloração positiva foi definida como IGFBP3 pontuação coloração. Uma pontuação de 0-3 foi considerado um preço tão baixo expressão e 4-9 como alta expressão.

A análise estatística

A expressão diferencial de IGFBP3 entre o tecido tumoral e tecido não-tumoral foi determinada por Mann-Whitney U-teste. teste do qui-quadrado foi utilizado para analisar as relações entre características clínicas e graus de marcação IGFBP3. A probabilidade de sobrevida global foi calculado com o método de Kaplan-Meier ea diferença entre as curvas foi avaliada com o teste de Log-rank. Um corte de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

HoxD10 regula positivamente a expressão de IGFBP3
análise

Genome-wide revelou que vários genes, incluindo IGFBP3 foram regulamentados. por HoxD10 em células cancerosas gástricas em nosso estudo anterior (4). Para determinar se HoxD10 poderia transcrição regulam a expressão de IGFBP3 em células cancerosas gástricas, observou-se o nível de IGFBP3 expressão após a introdução de forma estável gene HoxD10 em BGC823 e SGC7901 células, ou transitoriamente derrubando de HoxD10 em HGC27 células. RT-PCR e resultados de transferência de Western mostraram consistentemente que a expressão de IGFBP3 foi significativamente regulada positivamente em células HoxD10 sobre-expressos (Figura 1A e 1B), enquanto regulada negativamente após o silenciamento de HoxD10 HGC27 em células (Figura 1C e 1D).

Uma sequência de 2,3 kb (-2.282-56 pb) a montante da região de IGFBP3 foi clonado no vector pGL3-basic e utilizado para avaliar a actividade da luciferase por ensaios de repórter de luciferase dupla. Os resultados demonstraram que a actividade do promotor e IGFBP3 em BGC823 SGC7901 células foi aumentada em 4,2 e 3,8, respectivamente, dobras após a co-transfectadas com pcDNA3.1-HoxD10 transfectantes em relação ao vector pcDNA3.1 (p < 0,01, Figura 1E). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que HoxD10 poderia transcricionalmente upregulate a expressão de IGFBP3 em células cancerosas gástricas.

A identificação de novos regiões reguladoras no promotor IGFBP3 responsáveis ​​pela HoxD10

A seguir, analisou o HoxD10 potencial locais no promotor IGFBP3 vinculativo. A sequência a montante de 2,3 kb do gene IGFBP3 foi introduzido em PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), um programa para a predição do fator de transcrição sites em uma única sequência ou em um grupo de sequências relacionadas ligação (17 ) e 5 locais potenciais de ligação HoxD10 (HBS1 ~ 5) foram previstos (Tabela S1). Como mostrado na Figura 2A, estes cinco HBSS foram localizadas na -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) e -953 ~ -944bp (HBS5), respectivamente. Em estável HoxD10 overexpressed BGC823 e SGC7901 células, ligando regiões no promotor IGFBP3 foram investigados por meio de ensaios de chip. Identificou-se que a cromatina precipitado por anticorpo específico HoxD10 foi amplificado utilizando A2, A3 e A4, iniciadores que abrangem HBS3, HBS4 e HBS5 respectivamente, enquanto nenhuma amplificação foi observada com os iniciadores A1 englobando HBS1 e 2 (Figura 2B).

Para ganhar ainda mais para os segmentos de regulação de promotor IGFBP3 por HoxD10, nós clonado 2 fragmentos de DNA diferentes, que abrangem HBSI (HBS1 e 2) e HBSII (HBS3, 4 e 5), respectivamente, em SV40 promotor luciferase repórteres. Os resultados mostraram que a co-transfectadas com HoxD10, HBSII aumentada a actividade do promotor de SV40 por 4,0 vezes quando comparado com esses transfectantes vector vazio em BGC823 células (P < 0,01, Figura 3A). Em contraste, HBSI não mostrou nenhum efeito significativo sobre a actividade do promotor de SV40 (Figura 3A). Resultados semelhantes foram revelados em outras células SGC7901 independentes, as mudanças atividade do promotor SV40 foram 3,3 e 0,9 vezes por HBSII e HBSI, respectivamente (Figura S1A em S1 Arquivo).

HBS3, 4 e 5 compartilhada elemento "TTAT" ligação comum, enquanto HBS1 ou HBS2 não têm nenhum desses elementos. Nós HoxD10 hipótese de que se liga directamente ao promotor de IGFBP3 em locais "TTAT". Para confirmar isso, sintetizamos oligonucleótidos de 10 pb que contêm as sequências de HBS3, HBS4 e HBS5 respectivamente. Tal como mostrado na Figura 3B, as actividades do promotor SV40 foram aumentadas de 1,8, 2,0, e 2,7 respectivamente dobras quando co-transfectado com o plasmídeo HoxD10 em BGC823 células, enquanto que mutantes pontuais de HBS3, HBS4 HBS5 e não mostrou mudanças significativas. Reproduzimos resultados semelhantes em SGC7901 células (Figura s1b no arquivo S1).

Em conjunto, os resultados acima indicam que IGFBP3 é um alvo direto de HoxD10 em células cancerosas gástricas. Foram identificados três locais de ligações funcionais entre -1727 ~ -943bp no montante do gene IGFBP3 responsável por HoxD10. HoxD10 poderia vincular diretamente o promotor de IGFBP3 potencialmente através de elemento de ligação Hox "TTAT".

IGFBP3 é regulada negativamente em câncer gástrico e relacionou com prognóstico
dos pacientes

Para determinar o padrão de expressão de IGFBP3 no câncer gástrico, 86 de par espécimes cirúrgicos de câncer gástrico humano e de acordo gástrica benigno adjacente foram examinados tecidos. A intensidade de coloração IGFBP3 foi pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderada), ou 3 (densa), tal como determinado de forma independente por dois patologistas (Figura S2 em S1 do ficheiro). Os resultados mostraram que o nível de expressão de IGFBP3 em tecidos de tumor foi significativamente menor do que nos tecidos adjacentes livres de tumor (p < 0,001, Figura 4A e 4B). Além disso, a expressão IGFBP3 foi avaliada no que diz respeito às características clinicopatológicas dos pacientes. expressão IGFBP3 foi significativamente menor no tumor gástrico com metástases em linfonodos (p = 0,045). Além disso, a alta expressão de IGFBP3 em tumores de pequena dimensão (T1 + T2, 8/12) foi observada com maior frequência em relação ao que, em grandes (T3 + T4, 36/74), embora sem diferença significativa (p = 0,062) . Também não houve correlação significativa entre a expressão de IGFBP3 e características clínico-patológicas, incluindo sexo, idade e grau patológico (Tabela 1).
IGFBP3 imunocoloração intensidade
Classificação clínica
Número total
Low (número)
alta (número)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Sexo, idade e clínico-patológico características e resultados de imuno-histoquímica de amostras de tecido de tumor gástrico.
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Foram analisados ​​ainda mais a correlação entre a expressão de IGFBP3 ea sobrevida global de câncer gástrico pacientes. maior expressão de IGFBP3 foi associada com o tempo de sobrevivência mais longo nos 5 anos de seguimento (p = 0,011, Kaplan-Meier sobrevivência Log-rank test) (Figura 4C).

Knockdown do gene IGFBP3 promove célula de câncer gástrico migração e invasão

Para avaliar o papel funcional da IGFBP3 no câncer gástrico, foi investigada a migração e invasão celular após knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 foi selectivamente knockdowned por interferência de ARN em BGC823 e SGC7901 células (Figura 5A e 5B), que tinha um nível relativamente elevado de IGFBP3 endógena num painel de linhas de células gástricas (Figura S3 em S1 do ficheiro). Os resultados mostraram que o silenciamento de expressão IGFBP3 significativamente melhorada a migração de células Transwell, tanto em ensaios de migração (Figura 5C e 5D) e teste de raspagem (Figura S4 no ficheiro S1), quando comparada com a do controlo negativo siARN. Além disso, knockdowning IGFBP3 exibido uma actividade significativamente maior de invasão celular nos ensaios Transwell (Figura 5E e 5F).

IGFBP3 modula a expressão de MMP14, uPA e uPAR

Para descobrir os possíveis mecanismos de como IGFBP3 regular a capacidade de invasão das células cancerosas gástricas, foram examinados os níveis de mRNA de MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA e seu receptor uPAR, todos os quais são factores relacionados com a invasão, especialmente no cancro gástrico. Após transientemente transfectadas com ARNsi durante 72h IGFBP3 em BGC823 e SGC7901 células, os níveis de MMP14, uPA e uPAR expressão de ARNm aumentada, enquanto nenhuma mudança significativa de MMP2, MMP7, MMP9 ou TIMP1 /TIMP2 foi observado (Figura 6A). E-caderina, ß-catenina e complexo /ß-catenina E-caderina foram extraídos utilizando diferentes lisados, os seus níveis não teve alteração significativa após silenciar IGFBP3 em BGC823 células (Figura S5 em S1 Arquivo). Estes resultados indicaram que IGFBP3 inibe a invasão das células cancerosas gástricas através de, pelo menos em parte, modulando as expressões de MMP14, uPA e uPAR (Figura 6B).

Discussão

Hox superfamília são um grupo de factores de transcrição importantes, que poderia regular a proliferação e diferenciação de células embronic [29,30]. Além disso, a expressão aberrante de genes Hox também desempenha papéis importantes na progressão de vários tipos de cancros [31]. proteínas Hox ter uma rede de regulação grande jusante e exercem suas funções principalmente através destes genes alvo [5]. Genome-wide análise foi levada a cabo para o rastreio dos genes a jusante de HoxD10 durante o desenvolvimento da espinal medula e em células de cancro gástrico [4,32]. Nós e outros revelaram uma IGFBP3 gene alvo comum, o que tem sido relatado para servir como um supressor de tumores [10].

Nossos estudos fornecida primeira evidência para mostrar que HoxD10 se liga directamente o promotor IGFBP3 para activar a expressão de IGFBP3 em células cancerosas gástricas. proteína HoxD10 poderiam ser recrutados para a região promotor específico de gene IGFBP3, indicando que HoxD10 poderia ligar diretamente para gene IGFBP3. A actividade da luciferase com selvagem, enquanto não mutante, HBS3, HBS4 ou HBS5 foi significativamente aumentada por sobre-expressão de HoxD10, sugerindo que HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) e HBS5 (CTTTATTATT) foram três locais de ligação HoxD10 funcionais na região promotora de IGFBP3. Como esperado, o nível de ARNm e de proteína foram IGFBP3 expressão regulada positivamente pela expressão forçada de HoxD10 em diferentes linhas celulares de cancro gástrico [4]. Estudos têm demonstrado que as proteínas Hox tem alguns elementos de ligação do núcleo de consenso, incluindo TTAT, TAAT, e TTAC [7]. Ponto de mutação com "TTAT" a "TTCT" ou "TCTT" a "TATT" na região do promotor de IGFBP3 no presente estudo indicam que "TTAT" ou "TATT" são sítios de ligação importantes para HoxD10. proteínas Hox poderia regular directamente o processo de transcrição de genes alvo a jusante como monómeros ou homodímeros [33]. Dado que a competência de ligação do ADN das proteínas Hox si é relativamente baixo [34], as interacções com co-factores, como extradenticle (Exd) /PBX e Homothorax (Hth) /proteínas Meis como heterodímeros ou heterotrímeros são críticos para a selectividade alvo de proteínas Hox [33, 35]. Outros factores de transcrição incluindo PTEN e p53 pode regular a expressão de IGFBP3 ao nível da transcrição em células de carcinoma gástrico e do cólon [36,37]. Os mecanismos de regulação HoxD10 exatas e os co-factores envolvidos na regulação da IGFBP3 precisam de ser clarificados no futuro.

A expressão de IGFBP3 foi regulada negativamente em 86 tecidos adenocarcinomas gástricos em relação aos seus tecidos normais adjacentes e baixa expressão de IGFBP3 também foi correlacionada com o avançado metástase em linfonodo, metástase distante e sobrevida global pobres. Nossos resultados foram consistentes com o relatório anterior, que adenocarcinomas gástricos bem ou moderada diferenciadas teve significativamente maior percentagem da coloração IGFBP3 em tecidos tumorais do que aqueles em países pobres diferenciadas [38]. Além disso, a hipermetilação no promotor do IGFBP3 foi frequentemente detectada em tecidos de tumor gástricas [16,39,40]. SNPs IGFBP3 funcionais (rs2854744 e rs2960436) que determinam alta IGFBP3 níveis circulantes foram associados com prognóstico favorável dos pacientes com câncer gástrico avançado que receberam quimioterapia paliativa [41]. No entanto, um outro estudo mostraram os resultados bastante contrariamente, sugerindo que a expressão de IGFBP3 foi maior em amostras de tumor do que em mucosa normal (54 amostras tumorais e 20 amostras normais adjacentes, não emparelhadas) e a expressão positiva de IGFBP3 foi associada com histológico avançado grau, metástases em linfonodos e metástases à distância, sem diferença significativa [42]. A possibilidade de heterogeneidade intratumoral e critérios inscritos podem induzir resultados diferentes em diferentes estudos clínicos. populações grandes e estudos prospectivos foram permitiu avaliar a utilidade potencial de IGFBP3 como um biomarcador da progressão do cancro gástrico.

para continuar a identificar o papel de IGFBP3 na metástase do cancro gástrico, avaliou-se o seu papel na modulação a migração e a invasão de células de cancro gástrico. Descobriu-se que a expressão silenciamento de IGFBP3 resultou na rápida cicatrização da ferida zero e aumento do número de células que migram através da membrana Transwell se revestido com ou sem matrigel. Estudos anteriores principalmente centrada na função de IGFBP3 na proliferação celular e apoptose. Somente vários estudos relatou que estava relacionado com metástases em CE, câncer de próstata e HNSCC [13-15]. Silenciar a expressão de IGFBP3 poderia induzir a migração celular, invasão e metástase em EC [13]. IGFBP3 knockout camundongos machos tiveram uma maior incidência de metástases pulmonares ea capacidade de invasão das células tumorais da próstata primários foi aumentada mais de 3 vezes quando comparada com a de os selvagens [14]. IGFBP3 e adenoviral recombinante inibiu a vascularização e actividades de estimulação de angiogénese de HNSCC por suprimir a produção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [15]. Migração e invasão são facilitados por uma série de factores capazes de induzir epitelial-mesenquimal transição (EMT), como E-caderina, SS-catenina e factores que degradam a matriz extracelular, incluindo as MMPs, uPA e assim por diante [43]. Em células CE, siRNA alvejando IGFBP3 aumenta a expressão de MMP2 [13].

• PLOS ONE: A cisplatina ou não no cancro gástrico avançado: uma revisão sistemática e meta-Analysis
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