PLoS ONE: Høy Mannose-Binding Antiviral lektin PFL fra Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Fremmer Cell Death of Gastric Cancer Cell MKN28 via Interaksjon med α2-Integrin

Abstract

Novel anti-HIV lektin familie som viser en streng bindingsspesifisitet for høyt mannoseinnhold glykaner har blitt funnet i lavere organismer. Den bakterielle orthologue er blitt identifisert i genomet til Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 og genet som koder en antatt lectin ble klonet, uttrykt i Escherichia coli
og renset ved hjelp av ett trinn gelfiltrering. Glycan rekke screening av rekombinante lektin, betegnes PFL, har avdekket at PFL fortrinnsvis gjenkjenner høyt mannoseinnhold glykaner med α1-3 Man som var sterkt eksponert på D2 posisjon. I motsetning til maskering av denne α1-3 Mann med α1-2 Man dramatisk svekket lektin-karbohydrat interaksjoner. Redusere terminal disakkarid, GlcNAc-GlcNAc av høye mannose glykaner var også avgjørende for PFL-binding. PFL viste en potent anti-influensa-virus-aktivitet ved å hemme viruset trer i cellene ved doser på lav nanomolar konsentrasjon. Ved mikromolar konsentrasjon eller høyere, PFL viste cytotoksisitet medfølgende tap av celleadhesjon mot humane magecancerceller MKN28. Celleoverflatemolekyl hvortil PFL bundet ble ko-utfelt med biotinmerket PFL og identifisert som inte α2 av peptid masse fingerprinting ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri. Intriguingly, ved behandling med eksogen PFL, integrin α2 på celleoverflaten gjennomgikk hurtig internalisering til cytoplasma og akkumulert til perinukleært region, sammen med det bundne PFL. Den resulterende tap av celle tilslutning ville utløse en signalveien som induseres anoikis lignende celledød. Disse hendelsene ble effektivt inhibert ved forbehandling av PFL med mannnan, noe som indikerer involveringen av høyt mannoseinnhold glykaner på PFL-indusert celledød som ble utløst av PFL-integrin a2-interaksjoner

relasjon:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) High Mannose-Binding Antiviral lektin PFL fra Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Fremmer Cell Death of Gastric Cancer Cell MKN28 via Interaksjon med α2-Inte. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil

mottatt: 7 mai 2012; Godkjent: 27 august 2012; Publisert: 20.09.2012

Copyright: © Sato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) (Grant nummer 24790101). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Høye mannose-bindende lektiner som er rettet mot spesifikke glykaner på et virus overflaten er lovende potensielle virus-inaktive midler som kan brukes til forebygging og kontroll av virusinfeksjoner [1], [2]. Tallrike lektiner som spesifikt gjenkjenner høyt mannoseinnhold glykaner er funnet fra forskjellige taksonomi, inkludert bakterier, alger, planter og dyr, og noen av disse har vist seg å oppvise anti-HIV-aktivitet [3]. Vi har nylig funnet en ny anti-HIV lektin familie distribuert i lavere organismer som bakterier, cyanobakterier og marine alger [4]. De viser felles kjennetegn, for eksempel sekvens multiplikasjon av svært konservert N-terminal domene og eksklusive høy mannose oligo anerkjennelser. Noen lektiner i denne familien som cyanobacterial OAA fra Oscillatoria agardhii product: [4] og røde alger ESA-2 fra Eucheuma serra product: [5] har vist seg å hemme HIV oppføring i vertsceller med EF _{50-årene av lav nanomolar spekter av direkte binding til konvolutten gp120. Videre, en rød alge lektin KAA-2 fra Kappaphycus alvarezii
, som også tilhører denne familien hemmer infeksjon av ulike influensavirus stammer med EF 50-årene av lave nanomolare nivåer i en stamme-uavhengig måte, gjennom erkjennelsen av høy mannose oligosakkarid på den virale kappe glykoprotein hemagglutinin (HA) [6].}

i tillegg til potent antiviral aktivitet, viser ESA-to forskjellige biologiske aktiviteter som mitogene aktivitet for mus og humane lymfocytter og in vitro
vekstinhibering av tumorceller [7], [8]. Selv om biologiske egenskapene til denne lektin familie er blitt tydelige, egenskapene til bakterielle orthologues fra Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 og Herpetosiphon aurantiacus
fortsatt gjenstår å avklare.

I denne studien har vi klonet orthologue lektin genet fra P. fluorescens
Pf0-1 og kodet lektin protein (PFL) ble uttrykt i Escherichia coli
. Funksjonell PFL ble vellykket renset i high yield og karakterisert i form av sine biologiske aktiviteter som antiviral og anti-tumor aktivitet. Som forutsagt fra intens strukturell likhet av PFL med andre medlemmer av denne familien lektin, PFL oppviste eksklusiv spesifisitet for høyt mannoseinnhold oligosakkarid og potent antiviral aktivitet mot influensavirus. Videre PFL indusert anoikis lignende celledød av magekreft celle MKN28 via interaksjon med celleoverflaten inte α2.

Materialer og metoder

Material

Stab kultur P. fluorescens
Pf0-1 ble sjenerøst gitt av Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Influensavirus og Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler ble sjenerøst gitt av Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan): De influensavirus ble dyrket i chorioallantoic væske av 10 dager gamle kylling egg. MDCK-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin. En magekreft cellelinje, MKN28 ble vennlig levert av Prof. Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japan). Cellelinjen ble holdt i RPMI-1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicillin G-natrium og 100 mg /ml streptomycin sulfat. En annen magekreft cellelinje, GCIY, ble kjøpt fra RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japan) og opprettholdt på samme måte som beskrevet ovenfor. Primær normal menneskelig hepatocytter celle (ACBRI 3716) ble kjøpt fra DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) og vedlikeholdes i CS-C medium kit R (DS Pharma Biomedical).

hemaqqlutinering analysen

Hemagglutineringen analysen ble utført ved bruk av en 2% (v /v) suspensjon av trypsin-behandlet kanin-erytrocytter som tidligere beskrevet [9]. I korthet, kanin innfødt erytrocytt suspensjonen ble behandlet med 0,5% trypsin i saltløsning, og blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 60 min. Etter vasking med saltløsning, ble 2% trypsin-behandlet erytrocytt suspensjon fremstilt i saltvann. Hemaggluineringsaktivitet ble uttrykt som en titer, den resiproke verdi av den høyeste to-ganger fortynning som utviser positiv hemagglutinasjon.

Gene kloning og ekspresjon av lektin PFL

Genomisk DNA fra P. fluorescens
Pf0-1 ble brukt som en mal for genet kloning av PFL-genet. Til å begynne med en oligonukleotidprimer set, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'og 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', som hybridiserte med oppstrøms og nedstrøms for PFL kodende region, respektivt, ble anvendt, og PCR ble utført ved å bruke Prime STAR DNA polymerase (TAKARA). Ved hjelp av det amplifiserte PCR-fragment som et templat, ble den påfølgende PCR utført med en forover-primer, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', som hadde CACC ytterligere sekvens til ATG startkodonet av det PFL-genet, og en revers primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA, svarende til stoppkodonet av RFL-genet). De amplifiserte fragmentene ble ligert inn i pET101 /D-TOPO ekspresjonsvektor. Den rekombinant plasmid ble forvandlet i Escherichia coli
top10 celler (Invitrogen). De oppnådde rekombinante kloner ble bekreftet å være en korrekt konstruksjon av DNA-sekvensering. De funksjonelle kloner ble forvandlet i Escherichia coli
BL21 Star (DE3) celler for induserbar ekspresjon av PFL-genet. IPTG til en sluttkonsentrasjon på 0,8 mM ble tilsatt til den transformerte kulturen for å indusere ekspresjon PFL. Etter 6 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene høstet ved sentrifugering ved 8000 rpm i 20 min.

Rensing av lektin PFL

De høstede bakterielle celler ble resuspendert i 20 mM fosfatbuffer ( pH 7,0) inneholdende 0,15 M NaCl (PBS) og ble avbrutt ved sonikering. Etter sentrifugering ved 8000 rpm i 20 minutter ble en aliquot av supernatanten underkastet Superose 12 kolonne (GE Healthcare) ekvilibrert med PBS. Kolonnen ble eluert med PBS ved en strømningshastighet på 0,8 ml /min ved hjelp av en isokratisk modus. Eluatet ble overvåket ved absorbsjon ved 280 nm og kontrollert for hemagglutinasjon aktivitet, og de aktive fraksjoner ble slått sammen.

Molekylvekt Bestemmelse av PFL

Molekylvekten av PFL ble bestemt ved MALDI-TOF MS-analyse med en Autoflex massespektrometer (bruker, Japan) etter kalibrering med et peptid masse standard kit (bruker, Japan) bruker sinapinic syre som en matrise.

DNA sekvensanalyse

Nukleotidsekvenser ble bestemt ved dideoksy-kjede-terminator-metoden ved hjelp av en BigDye Terminator Cycle Sequencing versjon 3.1 kit (Applied Biosystems). DNA-sekvensering ble utført ved hjelp av en ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Glycan rekke analyse

PFL var merket med Alexa Fluor 488 i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Eugene, Oregon). Glycan binding spesifisitet PFL ble bestemt av de trykte sukker mikromatriser (versjon 5.0) i henhold til standard prosedyre for CoreH av Consortium for Funksjonelle glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Den gjennomsnittlige relative fluorescens i gjentak av seks ble beregnet ved gjennomsnitt fire verdier etter å ha fjernet de høyeste og laveste verdiene for å eliminere noen av de falske treff med svært høye eller lave punkter. De feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet (SEM), og% CV er variasjonskoeffisienten (SD /gjennomsnitt) beregnet som%.

Anti-Influensa aktivitet av PFL

In vitro
anti-influensaaktivitet av PFL ble bestemt ved nøytral rød (NR) fargestoff opptaksanalyse. Forskjellige konsentrasjoner av PFL ble fremstilt med DMEM inneholdende 10 ug /ml trypsin i en 96-brønns mikroplate. Til hver brønn ble det tilsatt virus som en multiplisitet av infeksjon på ca. 0,001 infeksiøse partikler pr celle. Etter inkubering ved 37 ° C i 48 timer ble 100 pl NR fargestoff (150 ug /ml i DMEM) tilsatt og ytterligere inkubert i 2 timer. NR fargestoff inkorporert i cellene ble ekstrahert ved tilsetning av 100 ul av 1% eddiksyre /50% etanol. Brønnene ble målt ved 540 nm med en mikroplateleser (1420 multilabel teller, PerkinElmer, MA, USA) som en faktor av overlevende fra viruset cytopatisk effekt.

immunfluorescens Mikros

immunfluorescens farging var utføres for å visualisere inngangs inhibering av influensavirus ved PFL. Kort sagt ble MDCK-celler dyrket på dekkglass infisert med A /Udorn /72 ved en multiplisitet av infeksjon på ca. 0,001 infeksiøse partikler pr celle, i nærvær eller fravær av 200 nM PFL i DMEM inneholdende 10 ug /ml trypsin. Etter 24 timer etter infeksjon ble de infiserte cellene fiksert med 80% aceton i 5 minutter. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med muse-monoklonalt anti-HA-antistoff (HyTest, Turku, Finland) ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff (Anticorps Secondaires, Compiegne, Frankrike) ved 37 ° C i 1 time. Etter ytterligere PBS vasking ble cellene monteres ved hjelp av Vectashield med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og ble observert under et fluorescens-mikroskop (Olympus BX51, Olympus, Japan).

ELISA-analysen

direkte interaksjon av PFL med virale kappe-glykoprotein HA ble analysert ved bruk av en enzymbundet immnosorbent assay (ELISA). PFL (5 ug /ml) i karbonatbuffer (pH 9,6) ble belagt på 96-brønners ELISA-plater (BD Biosciences, Bedford, MA). Brønnene ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBST) og blokkert med 3% skummet melk ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBST, varierende konsentrasjoner av influensa HA-vaksine preparat (Astellas, Tokyo, Japan) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBST, ble brønnene inkubert med mus-anti-HA-monoklonalt antistoff (HyTest) ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff (GE Healthcare, UK ) ved 37 ° C i 1 time. Deretter 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) substrat (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) ble tilsatt. Reaksjonen ble stanset ved hjelp av TMB stopp reagens (Sigma-Aldrich) og absorbansen ved 450 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (1420 multilabel telleren, PerkinElmer).

tumorcelleproliferasjon ved MTS-analyse

celleproliferasjon ble kvantifisert ved en konvensjonell analyse ved bruk av MTS CellTiter 96 celleproliferasjonsanalyse (Promega, Madison, WI). Celler seeded på 96-brønns mikroplate ble inkubert i 72 timer med forskjellige konsentrasjoner av PFL i passende medium med 10% FBS. Cellene ble deretter inkubert med 20 ul av MTS-reagens i 1 time ved 37 ° C og målt med en mikroplateleser (1420 multilabel telleren, PerkinElmer) ved 490 nm. Effekten av gjær mannan på cytotoxity av PFL, ble bestemt ved å inkubere cellene med 5 uM PFL i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av gjær mannan i RPMI 1640 med 10% FBS i 72 timer, og cellenes levedyktighet ble målt som beskrevet ovenfor.

Isolering av PFL bindingsmolekyl (er) på MKN28 celle

PFL ble merket med biotin ved hjelp av biotin merkingskit (Dojindo molekyl teknologier, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. For å sammenflytende MKN28 cellene på dekkglass, biotinylert-PFL (200 ug) tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking med kald PBS ble cellene skrapet av og lysert i 800 ul av RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% natriumdeoksycholat, protease inhibitor cocktail, 0,1% SDS ). Deretter ble 100 pl av biotin-avidin-kuler capture (Adar Biotech, Israel) tilsatt til cellelysat og inkubert over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Kulene ble vasket tre ganger med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fangede proteiner på kulene ble eluert med 50 ul SDS-PAGE prøvebuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% merkaptoetanol, 0,003% bromfenol-blått) i 15 min ved 90 ° C og underkastes SDS-PAGE. Den proteinbånd som er spesifikt for PFL behandling fraksjon ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS etter in-gel spalting med trypsin. Kort sagt ble de CBB farget proteinbånd skåret ut og avfarget med 25 mM ammonium-bikarbonat inneholdende 50% acetonitril. Den reduktive alkylering ble utført med 50 mM TCEP (tris [2-karboksyetyl] fosfin) i 25 mM ammoniumbikarbonat, etterfulgt av inkubering med 50 mM iodoacetoamide i 1 time. Etter dehydrering med acetonitril, ble proteinet i gelen spaltet med 10 ul TPCK-trypsin (100 ug /ml) i 50 mM ammoniumbikarbonat. Fordøyelsen ble renset med Zip tips (Millipore, Japan) og prikket inn en MALDI mål. En ul av matriseoppløsning (α-cyano-4-hydroxycinnapic syre matrisen [Bruker, Japan] i aceton-etanol [01:02]) ble deretter tilsatt til stedet. MALDI-TOF-MS-analyse ble utført ved en Autoflex massespektrometer (Bruker, Japan) etter kalibreringen med et peptid masse standard kit (Bruker, Japan). Peptid massen finger utskrift data ble søkt av Mascot programvare (Matrix Science, Japan).

Cellular lokalisering av PFL og inte α2

MKN28 cellene ble dyrket på Dekk i en seks-brønns plate . Cellene vokser på dekk ble behandlet med 30 ug /ml Alexa488 konjugert-PFL i RPMI 1640 og inkubert i forskjellige tidsperioder. Etter vasking med PBS ble cellene fiksert med 80% aceton i 5 minutter. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med muse-monoklonalt anti-integrin α2 /CD49b antistoff (R &D Systems, MN, USA) ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med Alexa568-konjugert geit-anti-mus-IgG-antistoff (Life Technologies, Japan) ved 37 ° C i 1 time. Etter ytterligere vasking PBS ble cellene monteres ved hjelp av Vectashield med DAPI (Vector Laboratories) og ble observert i henhold til konfokal laser scanning mikroskop (IX70, Olympus, Japan). Ved å anvende den andre magekreft cellelinje GCIY og normale humane hepatocytter celler ACBRI 3716, ble cellulære lokaliseringer av integrin α2 og Alexa488-PFL undersøkt på samme måte som beskrevet ovenfor, og observert under et fluorescens mikroskop (Olympus BX51). Effekten av gjær mannan på cellulær lokalisering av PFL og integrin α2 ble evaluert som følger. Konfluent MKN28 celler dyrket på dekkglass i en 6-brønns plate ble behandlet med 20 ug /ml Alexa488-PFL i RPMI 1640 i nærvær eller fravær av 700 ug /ml gjær-mannan i 4 timer. Cellene ble fiksert, visualisert ved anvendelse av anti-integrin α2 /CD49b-antistoff som beskrevet ovenfor, og observert under et fluorescens mikroskop (Olympus BX51). Effekten av forskjellige lektiner på cellulær lokalisering av integrin α2 ble undersøkt på lignende måte, ved å inkubere MKN28 cellene med 20 pg /ml av hver lektin i RPMI 1640 i 4 timer.

Resultatene

molekylær kloning, uttrykk og rensing av PFL

Vi har tidligere funnet genomet til P. fluorescens
Pf0-1 inneholder en mulig homolog av anti-HIV lectin familie som nylig ble funnet i lavere organismer som bakterier, cyanobakterier og marine alger [4]. Basert på nukleotidsekvensen til hypotetisk lektin av P. fluorescens
Pf0-1 på databasen, ble primersettene utformet for å forsterke det lektin-genet. Antatte lektin-genet ble vellykket klonet ved retningsbestemt kloning TOPO system, og det kodende protein ble, heterologt uttrykt i E. coli
BL21 (DE3). Det uttrykte lektin-proteinet ble renset til homogenitet ved et enkelt trinn gelfiltrering på Superose 12-kolonne (fig. 1A). Den aktiv topp med hemaggluineringsaktivitet ga et enkelt proteinbånd på 13 kDa på SDS-PAGE (Fig. 1B). Til slutt, fra en søppel E. coli
kultur, høyt utbytte av rensede lektin (240 mg) ble erholdt. Det rensede lektin ble kåret PFL og brukes for videre undersøkelse. Molekylmassen PFL (13883,7) bestemt ved MALDI-TOF MS var i overensstemmelse med den beregnede massen (13881,1) fra den utledede aminosyresekvens og den anslåtte verdi av den mobilitet på SDS-PAGE.

Den utledede aminosyresekvensen av PFL næret to homologe områder, som hver består av de N- og C-terminale halvdeler med 62% sekvensidentitet mellom dem. PFL utstilt høy sekvenshomologi cyanobacterial lektin OAA fra Oscillatoria agardhii
, rød alge lektin ESA-2 fra Eucheuma serra
, og bakteriell lectin MBHA fra Myxococcus xanthus plakater (Fig . 2B), som utgjør en ny anti-HIV-lektin familien. Molekylmassen PFL og OAA var like, 13883,7 og 13924,1, henholdsvis, og begge lektiner var sammensatt av 132 aminosyrer. Både PFL og OAA har en felles eiendom i sin sekvens duplisering men OAA viser høyere grad av intern sekvensidentitet med 75% mellom de to gjentatte domener. I kontrast er ESA-2 og MBHA sammensatt av fire tandem gjentatte homologe områder av 67 aminosyrer. Grader av likhet av OAA, ESA-2 og MBHA med PFL i deres N-terminale deler (hver på 132 rester) av aminosyresekvensene var 62,1, 61,4, og 62,1% for identiske aminosyrer, respektivt.

karbohydrat-bindende spesifisitet av PFL

for å bestemme karbohydratbindende spesifisitet PFL, ble sukker rekke analyse utført på Consortium for Funksjonelle glycomics bruker trykte utvalg versjon 5.0. Av de 611 slags oligosakkarider som ble testet, PFL (10 ug /ml) viste eksklusiv spesifisitet for høyt mannoseinnhold typen glykaner som vist i fig. 3. Hele listen over oligosakkarid testet og resultatene kan bli funnet på Internett på (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL sterkt bundet til M6 glykan (216 ) og M8 glykan (212), som begge har en eksponert α1-3 Man på D2 arm, med den tilsvarende nivåer av høye RFU verdier, 43471 og 40759, respektivt. I motsetning til maskering av denne α1-3 Mann med α1-2 Man dramatisk svekket samspillet mellom PFL og glykaner. Dette var mest tydelig ved en sammenligning av M6 glykan (216) og M7 glykan (211), hvor den ytterligere α1-2 Man at D2 arm redusert binding potens omtrent til 53%. På lignende måte ble binding potens av PFL til M9 glykan (213) ble redusert (RFU = 8535) sammenlignet med dens motstykke M8 glykan (212) som mangler D2 terminal α1-2 Man, som viser bare 21% av styrken. Interessant, fjernelse av den reduserende terminale disakkarid, GlcNAc-GlcNAc av høyt mannoseinnhold glykaner mye drastisk redusert PFL-binding. For eksempel ble det PFL bindende styrke nesten fullstendig opphevet til glykaner 316 og 317 som ikke har noen GlcNAc GlcNAc-sekvens, mens de motstykke glykaner 212 og 213, henholdsvis, oppviste mye høyere potens. Betydningen av terminal-GlcNAc GlcNAc ble ytterligere bekreftet ved sammenligning av glykaner 217 og 315, selv om graden av svekkelse av PFL-binding var begrenset. Dette lektin var blottet for monosakkarid-bindende inkludert mannose. Videre PFL interagerer ikke med Man α1-6 Man (314) og mannotriose (214), som er bestanddeler av den forgrenede del av høyt mannoseinnhold glykaner. Pentasakkarid kjernen av N-glykan (50) ble ikke anerkjent av PFL men fucosylated motstykke (485) vises svak interaksjon (RFU = 746). Disse oligosakkarid bindings profiler av PFL var tett lik de OAA, ESA-2 og KAA-2 som hører til en ny anti-HIV-lektin familie i lavere organismer [4] - [6].

Anti- influensa virus aktivitet av PFL

Anti-influensavirus aktivitet av PFL ble evaluert med to influensavirus stammer, A /Udorn /72 (H3N2) og A /Beijing /262/95 (H1N1) ved NR farveopptaks analyse. PFL effektivt hemmet cytopatisk effekt forårsaket av både influensa virusstammer, med EF _{50-årene av 19,4 ± 1,5 nM, og 4,5 ± 0,4 nM (Fig. 4A). For å bekrefte at PFL hemmet den første trinn av influensavirus adgang inn i cellene, fordeling av virale antigener i infiserte celler ble observert i nærvær eller fravær av PFL ved hjelp av immunfluorescens-mikroskopi. Fig. 4B viser fordelingen av virusantigen etter 24 timer etter infeksjon med A /Udorn /72 detektert av spesifikke anti-hemagglutinin-antistoff. PFL effektivt hemmet influensavirus adgang inn i cellene, mens virus var i stand til å trenge inn i og replikere i vertscellene i fravær av PFL. En galaktose spesifikk lektin PNA fra Arachis hypogaea
unnlatt å hemme virus inntreden i cellene. Disse resultatene tyder på nærvær av høyt mannoseinnhold glykaner på den virusoverflaten ved posisjonen kritisk for virus inntreden i celler. For å teste om PFL ville direkte binde seg til viral konvolutt glykoprotein HA, ble en ELISA-analyse utført med kommersielt tilgjengelig vaksine preparat som inneholder HA fra A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), og B /Brisbane /60/08 som en hovedkomponent. Som vist i fig. 4C, ble det observert doseavhengig binding av HA til PFL.}

PFL indusert celledød av human magekreft celle MKN28

In vitro
anti-tumor effekt av PFL videre magekreftcelle MKN28 ble evaluert ved konvensjonell MTS-analyse. Som vist på fig. 5A (venstre panel), viste PFL en doseavhengig effekt på proliferasjonen av MKN28 celle. Ved 72 timer etter PFL-behandling, ble cellenes levedyktighet signifikant redusert ved doser på 0,5 pM eller høyere. I motsetning til dette, ved de lave doser av 0,1-0,3 uM, celleproliferasjon ble svakt stimulert. PFL-indusert celledød av MKN28 celler ble fulgt av et tap av celleadhesjon til bunnen av kulturplaten, som vist i fig. 5B hvor vrengte klynge av celler ble observert som brunaktige linjer. PFL-indusert celledød ble effektivt inhibert i nærvær av gjær mannan, et glykoprotein som bærer høyt mannoseinnhold oligosakkarider (Fig. 5A, høyre panel). Dette indikerer høy mannose glykaner på MKN28 cellene er involvere i PFL-indusert cellesignalisering som til slutt fører til celledød. I motsetning til dette, normale humane hepatocytter celler (ACBRI 3716) var relativt resistente mot PFL behandling sammenlignet med MKN28 celler (fig. 5A, venstre panel).

Isolering av PFL-bindingsmolekyl (er) på human magekreftcelle MKN28

for å møte den molekylære mekanismen som PFL induserer celledød av MKN28 cellen, celleoverflatemolekyl (e) som PFL bundet ble undersøkt. Biotinylert PFL ble inkubert i 2 timer med MKN28 celler og cellene ble lysert med RIPA-buffer inneholdende 0,1% SDS. Celleoverflatemolekyl (er) som biotin-bundet PFL ble ko-utfelt med avidinbelagte kuler. Proteinene som er fanget på kulene ble deretter eluert med SDS-PAGE-prøvebuffer og analysert på SDS-PAGE (Fig. 6A). Selv om flere ikke-spesifikke bånd ble påvist, observerte vi et 150 kDa bånd som spesifikt påvist i PFL behandlede fraksjon. Dette bånd ble ytterligere underkastet in-gel fordøyelse av trypsin, etterfulgt av MALDI-TOF massespektrometrisk analyse. De oppnådde peptid masse fingerprinting data (Fig. 6B) ble søkt etter database og proteinet ble identifisert som inte α2, med sannsynlighetsbaserte score på 57 (p < 0,05).

Cellular lokalisering av eksogent lagt PFL og inte α2

Den atferd av PFL selv og inte α2 ved behandling med PFL ble undersøkt ved hjelp av en confocal fluorescerende mikroskop. I dette eksperimentet, fluorescent-merkede PFL (Alexa488-PFL) ble brukt til å spore PFL lokalisering. En Alexa488-PFL ble inkubert med MKN28 celler i 1, 5 og 24 timer ved doser på 30 ug /ml. Integrin α2 ble detektert med anti-integrin α2 /CD49b monoklonalt antistoff etterfulgt av Alexa568-konjugert andre antistoff. Interessant, Alexa488-PFL bundet til celleoverflaten og initiert internalisering til cytoplasma i løpet av 1 time (fig. 7). Inte α2 som ble hovedsakelig er lokalisert på celleoverflaten ved steady state gikk også intern, og viktigere, lokalisering av inte α2 sammenfalt godt med PFL. Etter 5 timers inkubering, både PFL og integrin α2 ble ko-lokalisert og akkumulert i perinukleær region og ytterligere inkubering i utgangspunktet ikke forandre plasseringen av begge proteiner. Det er derfor sannsynlig at når PFL bundet til integrin α2, begge proteiner har aldri blitt resirkulert tilbake til celleoverflaten. Rapid intracellulær trafficking av PFL-inte α2 kompleks skjedde selv på kollagen jeg belagte dekkglass (data ikke vist). Tilsvarende omfordeling av integrin α2 ved behandling med PFL ble observert i en annen magekreft cellelinje, GCIY, men ikke i normale humane hepatocytter celler, ACBRI 3716 (fig. 8). I ACBRI 3716 celler, ble internalisering av PFL ikke observert muligens av mindre uttrykk for inte α2 på celleoverflaten.

Involvering av høye mannose glykaner på PFL-inte α2 interaksjon

For å teste om mobilnettet omfordeling av inte α2 forårsaket av PFL kan oppstå fra en spesifikk interaksjons av PFL med høyt mannoseinnhold glykaner på inte α2 molekyl, har vi vurdert effekten av gjær mannan på PFL-indusert inte α2 intern hjelp MKN28 celler. I fravær av gjær mannan, begge proteiner gikk betydelig internalisering (fig. 9A, øvre panel). I motsetning til dette, i nærvær av gjær mannan, PFL unnlot å binde seg til celleoverflaten, og etterfølgende intracellulær handel med PFL ble fullstendig opphevet (fig. 9A, nederst til høyre). Enighet til denne observasjonen, integrin α2 ikke endre sin lokalisering i nærvær av gjær mannan (fig. 9A, nederst til venstre). Disse resultatene viser tydelig at PFL bundet til inte α2 gjennom anerkjennelse av høye mannose glykaner på inte α2. For ytterligere å bekrefte kravet om høyt mannoseinnhold glykaner for integrin omfordelingen α2, vi har testet effekten av forskjellige lektiner på cellulær lokalisering av integrin α2. Som vist på fig. 9B, andre lektiner med ulike særegenheter som galaktose-bindende PNA fra Arachis hypogaea
, fucose-bindende AOL fra Aspergillus oryzae
, Sialinsyren bindende MAM fra Maackia amurensis
, D-GlcNAc-bindende UDA fra Urtica dioica
ikke påvirke plasseringen av inte α2. Interessant, selv høy mannose bindende lektiner som en monocot mannose (Man) -binding lektin, GNA fra snøklokke
viste ingen signifikant endring på inte α2. I kontrast, høy mannose bindende belgfrukt lektin ConcanavalinA (ConA) forvrengt ordningen med inte α2 som PFL gjorde.

Diskusjoner

I denne studien har vi vurdert den biologiske aktiviteten av romanen bakteriell lektin PFL fra P. fluorescens
Pf0-1 som tilhører nylig funnet anti-HIV lektin familie i lavere organismer. Forekomst av økende resistente influensavirus stammer samt nye høypatogen virusstammer som avian H5N1 ledet oss til å utforske PFL som en roman anti-influensa agent. PFL viste potent anti-influensa-virus-aktivitet, og den mekanismen som PFL hemmet virusreplikasjon ble inhibering av den første trinn virus inntreden i celler. Det er mest sannsynlig at PFL som utøves anti-influensaaktivitet ved selektivt å binde seg til høyt mannoseinnhold glykaner på virale kappe HA, som vist i ELISA-analyse [9]. Faktisk har stedsspesifikke forekomsten av høy mannose oligosakkarid vist på regionen HA nær reseptorbindingssetet [10].

For å utforske anti-tumor effekt av PFL, ansatt vi human magekreft cellelinje MKN28 som stammer fra et moderat differensierte tarmtypen tumor. Den røde alge lektin ESA-2 som tilhører samme lektin familie med PFL utstilt anti-tumor effekt både in vitro Hotell og in vivo product: [7], [8]. ESA-2 er et protein avledet fra den spiselige tang og forventet å utøve anti-tumor effekt på mage- og tarmkanalen cancer ved oral administrering. Det er bemerkelsesverdig at PFL fremmet celledød av MKN28 celle, utelukkende gjennom en erkjennelse av høyt mannoseinnhold glykaner på integrin α2 molekyl, som hovedsakelig ligger på celleoverflaten ved steady-state. Heterodimere integriner fungere ikke bare som ankringsmolekyl for å feste celler til en passende ekstracellulær matriks (ECM), men også som sensorer av ECM miljø [11].

• PLoS ONE: Honokiol induserer kalpain-mediert Glukose-regulert Protein-94 Cleavage og apoptose i Human Gastric kreftceller og reduserer tumorvekst
• Typer av magekreft