PLoS ONE: beclin-1 expressie is een belangrijke voorspeller van de overleving bij patiënten met lymfkliertest-positieve maagkanker

De abstracte

Achtergrond

beclin 1 is een hoofdrolspeler van autofagie. De expressie van beclin 1 en de prognostische rol bij maagkanker grotendeels onontdekt. Het doel van deze studie is om de expressie van beclin 1 bij maagkanker cellen, weefsels en de relatie met de prognose te onderzoeken.

Methods

De expressie van beclin 1 werd gedetecteerd in 271 exemplaren van lymfe-node positieve maagkanker patiënten door immunohistochemie. De correlatie van beclin 1 expressie clinicopathologic kenmerken en overleving van maagkanker bestudeerd. Beclin-1 expressie in maagkanker cellijnen en klinische monsters wordt ook gedetecteerd met behulp van reverse transcriptie-PCR en Western blotting.

Resultaten

beclin 1 is up-gereguleerd, zowel op mRNA en eiwit niveaus in zes maagkanker cellijnen vergeleken met die van normale maagslijmvlies cellijn (GES-1). De expressie van beclin-1 in gastrische klinische monsters is hoger dan die in de aangrenzende goedaardige weefsels. Van de 271 patiënten, 229 (84,5%) waren beclin 1 hoge expressie tumoren door immunohistochemie. Beclin 1 expressie is nauw verbonden met intravasculaire embolie. Kaplan-Meier-analyse toonde een hoge beclin 1 expressie werd geassocieerd met een langere algemene overleving. Univariate analyse en multivariate analyse bleek dat beclin 1 expressie waren onafhankelijke prognostische factoren bij patiënten met klierpositief maagkanker.

Conclusies

Onze resultaten suggereren sterk dat beclin 1 een mogelijke rol in tumorigenese van maagkanker en kan een veelbelovende biomarker voor het voorspellen van de prognose van patiënten met lymfeklier-positieve maagkanker is. Het kan ook dienen als een nieuw therapeutisch doelwit voor maag kankerbehandeling

Citation:. Geng Q-R, Xu D-Z, hij L-J, Lu J-B, Zhou Z-W, Zhan Y-Q, et al. (2012) beclin-1 expressie is een belangrijke voorspeller van de overleving bij patiënten met lymfkliertest-positieve maagkanker. PLoS ONE 7 (9): e45968. doi: 10.1371 /journal.pone.0045968

Uitgever: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chili

​​Ontvangen: 4 april 2012; Aanvaard: 23 augustus 2012; Gepubliceerd: 27 september 2012

Copyright: © Geng et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Medical Science Foundation van de provincie Guangdong (nr 2010B031600071). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker blijft een groot probleem voor de volksgezondheid in de wereld, vooral in Oost-Aziatische landen, de leeftijd gestandaardiseerde incidentie is > 20 per 100.000 [1]. Voor de gevorderde maagkanker, de prognose is nog steeds slecht, met een geschatte totale 5-jaarsoverleving van 25% of minder [2], [3]. Lymfklier metastase is de krachtigste voorspellende indicator volgende curatieve resectie [4] - [7]. Ongeveer 75% van geavanceerde patiënten klierpositieve maagkanker, waarvan prognose significant slechter dan voor die met kliernegatieve ziekte [4].

In eerdere studies hebben we gevonden positieve lymfklier ratio een onafhankelijke prognostische indicator voor de patiënten met klierpositief maagkanker en intraperitoneale chemotherapie kan gunstig zijn [8], [9]. Echter, een fundamentele stap naar het verbeteren van de overleving van patiënten met lymfeklier-positieve maagkanker ligt in de toegenomen kennis van de tumor biologisch gedrag en het zoeken naar mogelijke doelen voor individuele therapie [10], [11]. Zo heeft de humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) inmiddels een nieuwe marker van maagkanker na evidence-based principes [12] .Adding trastuzumab aan standaard chemotherapie kon de arme overleving van patiënten te veranderen met HER2-positieve uitgezaaide maagkanker [13] - [15]

Onlangs is de rol van autofagie in tumorigenese en kankerbehandeling gekregen groot belang [16] -. [18]. Beclin 1, een belangrijke regulator van autofagie formatie bleek overexpressie in verschillende humane kankers [19] -. [22]

Er zijn echter nog relatief weinig studies die het verband onderzochten tussen 1 en beclin maagkanker. In het bijzonder, geen gegevens over de effecten op de prognose bij maagkanker, nog gemeld.

De huidige studie onderzocht beclin 1 expressie bij maagkanker cellen, weefsels en zijn Clinicopathologische betekenis bij patiënten met lymfeklier-positieve maag kanker. Verder analyseerden we de relatie tussen de beclin 1 expressie met de prognose te bepalen of beclin 1 kunnen klinische uitkomst te voorspellen.

Materialen en Werkwijzen

Cellijnen en kweekomstandigheden

Human maagkanker cellijnen HGC-27, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823 waren giften van Peking University School of Oncology (Beijing, PR China.) [23], [24]. De normale maagslijmvlies cellijn GES-1, afgeleid van een humane foetale maagslijmvlies epitheel werd verkregen uit de Eerste Affiliated Hospital voor Sun University [25]. Deze cellijnen werden gehandhaafd in RPMI 1640 medium (Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Hyclone), penicilline (100 eenheden /ml) en streptomycine (100 eenheden /ml) bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator .

Reverse transcriptie-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol methode. Het RNA werd voorbehandeld met DNase en gebruikt voor cDNA-synthese met willekeurige hexameren. Het mengsel (25 pl totaal) voor PCR bestond uit 0,5 pi cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymerase, 2,5 pi 10 x PCR-buffer, 2,5 mM dNTP mengsel en 50 pM sense en antisense primers elk. Beclin 1 werden geanalyseerd door volgende primers: beclin 1 5'CGTGGAATGGAATGAGAT3 '

reverse primer 5' GTAAGGAACAAGTCGGTAT3 ';

Actin: 5'AGCCATGTACGTAGCCATCC3'

en 5 'GTGGTGGTGAAGCTGTAGC 3 '.

Western blotanalyse

de cellen werden gelyseerd in lysis buffer en de eiwitconcentratie werd bepaald door de Bradford kleurstof-methode (Bio-Rad Laboratories). Gelijke hoeveelheden celextract werd onderworpen aan SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membraan (Bio-Rad). Expressie van beclin 1 werd bepaald met een konijn monoklonaal antilichaam (1:1000, Novus Biologicals, NB500-249) volgens voorgestelde protocollen van de fabrikant.

patiënten bestudeerd

De studie bestond uit 271 maag kankerpatiënten die radicale resectie ondergingen voor histologisch bevestigde maagcarcinoom van het Cancer Center van Sun Yat-sen Universiteit tussen januari 1998 en december 2006. We verkregen geïnformeerde toestemming van alle betrokken in deze studie deelnemers. Ethische goedkeuring werd verkregen van Sun Yat-sen Universiteit Cancer Center onderzoek ethische commissie. De criteria opgenomen histologisch bevestigde R0 resectie, die werd gedefinieerd als geen macroscopische en microscopische residuele tumor en postoperatieve overleving tijd ≥6 maanden. Patiënten met metastasen op afstand of preoperatieve therapie of lymfeklier-negatieve werden uitgesloten van de studie. De 7thTNM indeling door het Gemengd Comité Amerikaanse on Cancer en de International Union Against Cancer criteria werd gebruikt voor pathologische staging [26]

Alle patiënten hadden een follow-up na de operatie op 6 tot 12 maanden met tussenpozen.; Mediane follow-up periode was 38 (bereik 10-145) maanden voor alle patiënten. Overall survival was gedefinieerd als werd gedefinieerd als de periode tussen het moment van de operatie en dood of werd geschrapt ten laatste follow-up.

Immunohistochemie

beclin 1 werd gedetecteerd met een konijn monoklonaal antilichaam ( 1:100, Novus Biologicals, NB500-249). Alle tumormonsters werden verkregen van chirurgisch uitgesneden maagkanker voor adjuvante therapie. Met formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel blokken werden bewaard bij kamertemperatuur geïdentificeerd met een identificatienummer. De procedures werden uitgevoerd op soortgelijke wijze aan de eerder beschreven werkwijze [23]. De immuun-secties werden geëvalueerd en weefsel van menselijke prostaat adenocarcinoma diende als positieve controle. Alle objectglaasjes werden beoordeeld door twee onafhankelijke waarnemers op basis van het aantal positief gekleurde tumorcellen en intensiteit van kleuring. Volgens recent beschreven criteria beoordeeld beclin 1 expressie, de intensiteit van membraankleuring varieert van zwak tot sterk: 0 (geen kleuring), 1 (zwakke kleuring), 2 (matig kleuring) en en 3 (intense kleuring) [27]. Het percentage positieve tumorcellen werd gescoord als 0 (< 5%), 1 (6% tot 25%), 2 (26% tot 50%), 3 (51% tot 70%) en 4 (> 70% ). Kleuring index werd berekend door de som van de kleurintensiteit score en het percentage positieve cellen te scoren. Immunoreactief score gelijk aan of hoger dan 4 werd gebruikt om tumoren te classificeren met een hoge beclin 1 expressie en een kleuring score lager dan 4 werd gebruikt om lage beclin 1 expressie te geven.

Statistische analyses

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS-software (versie 18 voor Windows, SPSS, Chicago, IL). Verschillen in P < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant. De associatie van beclin-1 expressie met verschillende clinicalopathologic functies werd geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraat test. Survival curves werden uitgezet door de Kaplan-Meier-methode en vergeleken met de log-rank test. Een Cox model (achteruit, stapsgewijze) voor multivariabele analyse werd aangevraagd factoren die betekenis univariabele analyse bereikt.

Resultaten

beclin 1 expressie in maagkanker cellijnen

Overexpressie van beclin 1 is gerapporteerd in vele kankers. De expressie status maagkanker cellijnen blijft echter onduidelijk. Om de expressieniveaus van beclin-1 transcripten en eiwitten, semi-kwantitatieve reverse transcriptie-PCR-analyse en Western vlekanalyse bepalen werden afzonderlijk in normale humane maagepitheelcellen (GES-1) en zes maagkanker cellijnen (HGC-27 uitgevoerd, MKN803, MGC-803, SGC-7901, MKN-28, BGC-823). We vonden dat beclin 1 mRNA en eiwit expressie opgereguleerd in alle zes maagkanker cellijnen in vergelijking met normale maagepitheelcellen GES-1. (Afb. 1 A en B)

beclin 1 expressie bij maagkanker weefsels

Om te bepalen beclin-1 mRNA en eiwit expressie bij maagkanker weefsels, 4 gekoppeld maagkanker weefsels en goedaardige weefsels aangrenzende kanker laesies werden gedetecteerd door reverse transcriptie-PCR-analyse en Western vlekanalyse, apart. Het bleek dat beclin-1 in alle vier tumorweefsel specimens hadden een significant hogere expressie op zowel mRNA en eiwitniveaus dan in het normale weefsel grenzend aan tumoren van deze patiënten (Fig. 1 C en D).

beclin 1 expressie bij maagkanker

Om te onderzoeken of beclin-1 kon klinisch correleren met maagkanker progressie, expressie en subcellulaire lokalisatie van beclin 1 eiwit werd gedetecteerd door immunohistochemie in 271-paraffine ingebedde maagkanker weefsels. Specifieke beclin 1 kleuring was voornamelijk op de membraan-plasma en cytoplasma in de kankercellen, soms de kern. Figuur 2 toont representatieve voorbeelden van beclin 1 immunokleuring. Van de 271 patiënten, 229 (84,5%) waren beclin 1 hoge expressie tumoren.

Survival analyse

Patiënten met beclin 1 lage expressie maagkanker bleek significant korter 5-jaars overleving (OS , p = 0,011; fig. 3) en ziektevrije overleving (DFS, p = 0,010; figuur 4) dan die met beclin 1 hoge expressie degenen.. De expressie van beclin 1 is nauw verbonden met intravasculaire embolie (P = 0,017). Echter was er geen significante correlatie tussen het expressieniveau van beclin 1 en leeftijd, geslacht, plaats, tumorgrootte, T classificatie, N indeling of pathologische stadium van maagkanker patiënten (tabel 1). Beclin 1 expressie, site, intravasculaire embolie, pathologische T indeling, pathologische N classificatie en pathologisch stadium waren onafhankelijke prognostische factoren in univariate analyse (gegevens niet getoond) .In multivariabele analyse, beclin 1 expressie, intravasculaire embolie, plaats en pathologisch stadium waren significant onafhankelijke voorspellende factor voor overlevingsduur (tabel 2).

Discussie

Autofagie is een self-degradatie-mechanisme en geassocieerd met progressie van de tumor. Beclin 1, een zoogdier ortholoog gist Atg6, speelt een cruciale rol in het blaasje nucleatieproces van autofagie [28]. Het is een gen dat onontbeerlijk is voor de eerste fase van autofagie [29] -. [30]

De huidige studie is voor het eerst blijk beclin 1 is opgereguleerd zowel mRNA en eiwitniveaus in zes maagkanker cellijnen vergeleken met die van normale maagepitheelcellen GES-1. We bleek ook beclin 1 expressie is verhoogd in het primair maag-tumoren in vergelijking met vier gepaarde maagkanker monsters grenzend aan tumoren van dezelfde patiënten door middel van reverse transcriptie-PCR en western blotting. De resultaten verschillen van die welke in de lever kankercellen en cervicale kankercellen, die beclin 1 expressie significant lager in vergelijking met de overeenkomstige normale weefsels [31], [32] heeft. De mogelijke uitleg is dat beclin-1 expressie in maagkanker bijdragen tot de inductie van celdood autophagic, waardoor selectieve druk om celdood te negeren tijdens de ontwikkeling van de kanker [27], [33] produceren.

In deze studie zagen we dat 229 (84,5%) patiënten hadden hoge expressie beclin 1 in 271 maagkankerpatiënten, in overeenstemming met de bevinding van het vorige onderzoek door Ahn et al.Their gegevens toonden geen of zeer zwakke expressie van Beclin1 in normale mucosale cellen van maag door immunohistochemie [27]. Echter, hebben ze niet verken de beclin-1 expressie op mRNA-niveau in cellijnen, noch onderzoeken zijn rol in de prognose.

Vervolgens analyseerden de relatie tussen de expressie van beclin-1 en klinische kenmerken van de patiënten . Er was geen significante correlatie tussen de expressie van beclin-1 en leeftijd, geslacht, T classificatie, N indeling of fase van patiënten met maagkanker. Interessant, in de huidige studie was er een significante relatie tussen de expressie van beclin-1 en intravasculaire embolie. Het suggereert dat beclin-1 kan worden gebruikt als een marker intravasculaire embolie bij patiënten met klierpositief maagkanker. Deze waarnemingen wijzen op de belangrijke rol van beclin-1 in de ontwikkeling van maagkanker.

Verder vonden we lage beclin-1 expressie werd sterk geassocieerd met een verminderde overleving bij maagkanker patiënten ( P
= 0,011) en de intravasculaire embolie deelverzameling ( P
= 0,017). In multivariate analyse, beclin-1 expressie behield haar onafhankelijkheid als een prognostische factor ( P
= 0,044). Deze resultaten suggereren een potentieel veelbelovende nut van beclin-1 als prognostische indicator en overleving. Het mechanisme is nog niet duidelijk. De alternatieve verklaring hiervoor kan zijn dat beclin-1 expressie in maagkanker grenzen chromosomale instabiliteit en verlaagt de frequentie van de extra mutatie [34].

Voor zover ons bekend, de studie is het eerste verslag dat beclin 1 had een significant hogere expressie bij maagkanker cellen en weefsels zowel mRNA en eiwitniveaus in vergelijking met hun normale tegenhangers. Bovendien vonden we een hoge beclin 1 expressie werd geassocieerd met een langere algemene overleving. Zowel univariate analyse en multivariate analyse toonde beclin 1 expressie, site, intravasculaire embolie en pathologisch stadium waren onafhankelijke prognostische factoren. De resultaten suggereren sterk dat beclin 1 een mogelijke rol in tumorigenese van maagkanker. Het zou een veelbelovende biomarker en een nieuwe therapeutische strategieën om patiënten met lymfeklier-positieve maagkanker is. Verdere studies zijn ook nodig om het mechanisme waarmee autofagie actor beclin 1 is betrokken bij de ontwikkeling en progressie van maagkanker verduidelijken.

• PLoS ONE: Interactie tussen GSTP1 Val-allel en H. pylori-infectie, roken en alcoholgebruik en het risico op maagkanker onder de Chinese Population
• PLoS ONE: Aangeboren immuniteit en Non-Hodgkin lymfoom (NHL) gerelateerde genen in een geneste case-control studie voor maagkanker Risk