PLoS ONE: antitumoreffecten van een Sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, tegen maagkanker cellen via Death Receptor 5 Up-Regulation

Abstract

Up-gereguleerde sirtuïne 1 (SIRT1), een NAD ^{+ afhankelijke klasse III histondeacetylase, deacetylates p53 en remt de transcriptie-activiteit, wat leidt tot celoverleving. SIRT1 overexpressie is beschreven dat slechte overleving voorspellen sommige tumoren, waaronder maagkanker. De antitumoreffect van SIRT1 remming ongrijpbaar bij maagkanker. Hier hebben we onderzoek gedaan naar de anti-tumor mechanismen van een sirtuin inhibitor, tenovin-6, in zeven menselijke maagkanker cellijnen (vier cellijnen met wild-type TP53
, twee met een mutant-type TP53
, en één met null TP53
). Interessant tenovin-6 geïnduceerde apoptose in alle cellijnen, niet alleen die met een wild-type TP53,
maar ook mutant-type en null versies, begeleid door up-regulatie van death receptor 5 (DR5). In de KatoIII cellijn ( TP53
-null), DR5 geluidsdemping aanmerkelijk verzwakt tenovin-6-geïnduceerde apoptose, wat suggereert dat de cruciale mechanisme achter de anti-tumor effect is gebaseerd op de activering van de death receptor signaalroute. Hoewel endoplasmatisch reticulum stress veroorzaakt door sirtuin remmers werd gemeld dat DR5 induceren up-regelgeving op andere kanker cellijnen, we konden geen duidelijke activering van verwante moleculen, zoals ATF6, PERK en CHOP, bij maagkanker cellen behandeld met tenovin- vinden 6. Tenovin-6 in combinatie met docetaxel of SN-38 uitgeoefend een lichte tot matige synergistische cytotoxiciteit tegen maagkanker cellen. Tot slot, tenovin-6 heeft krachtige anti-tumor activiteit tegen menselijke maagkanker cellen via DR5 up-regelgeving. Onze resultaten zouden nuttig zijn voor de toekomstige ontwikkeling van klinische sirtuin remmers}

Citation:. Hirai S, Endo S, Saito R, M Hirose, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antitumoreffecten van een Sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, tegen maagkanker cellen via Death Receptor 5 Up-verordening. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10.1371 /journal.pone.0102831

Editor: Andrei L. Gartel, Universiteit van Illinois in Chicago, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 28 oktober 2013; Aanvaard: 23 juni 2014; Gepubliceerd: 17 juli 2014

Copyright: © 2014 Hirai et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies-in-hulp van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan (tot IH). Geen extra externe financiering ontvangen voor deze studie. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken van overlijden door kanker wereldwijd [1], [2]. Hoewel verscheidene chemotherapieën voor gevorderde maagkanker ontwikkeld, de prognose is nog steeds slecht en nieuwe antikanker geneesmiddelen voor maagkanker nodig. Maagkanker is een biologisch en genetisch heterogene kanker aanwezigheid van vele genetische mutaties en epigenetische alternaties [3]. Onder deze, afwijkingen van de TP53
tumorsuppressorgen een belangrijke rol spelen bij tumorigenese [4], [5]. Ongeveer 30% van de patiënten met maagkanker hebben TP53
mutatie [6]. Zelfs in kankercellen met wildtype (wt) TP53
, is gemeld dat de functie van TP53
wordt onderdrukt door negatieve regulatie zoals ubiquitinatie, methylatie, en deacetylering [7], [8]. In dit verband zou een veelbelovende strategie dat remming van deze negatieve regulatoren tot versterking van de antitumor effecten nemen door activatie van p53 in wt TP53
kankers. Murine dubbele minuut 2 (MDM2) is een belangrijke fysiologische antagonist van p53 [7]. We hebben eerder gemeld dat een MDM2-remmer, nutlin-3, toonde krachtige anti-tumor effect tegen maagkanker cellen door activering van de p53-route [9]

Sirtuin 1 (SIRT1), een NAD ^{+ -. Afhankelijke histondeacetylase (HDAC), heeft een verscheidenheid aan functies die betrokken zijn bij chromatine silencing, levensduur, en genomische stabiliteit. Het is in de kern en werkt als een sensor cel metabole status overleving en veroudering onder genotoxische en oxidatieve stress [10], [11]. Naast histondeacetylering deze functies mede afhankelijk van de deacetylering van verschillende niet-histon eiwitten die transcriptionele factoren omvatten: p53, forkhead box (FOXO) Eiwitten, kernfactor KB, c-MYC, N-MYC, E2F1 en hypoxie-induceerbare transcriptiefactoren (HIF) 1α /2α; Chromatine verwante enzymen: histone acetyltransferase, p300, DNA-afhankelijke kinase subeenheid Ku80 en Tip60; DNA-reparatie elementen: Ku70, RAD51 en NBS1; en cel signaalfactoren: STAT3, β-catenine en Smad7 [11] - [13]. SIRT1 fysiologisch interageert met p53 en vermindert zijn functies met deacetylation aan zijn C-terminale residuen Lys382 [12]. Overexpressie van SIRT1 werd gevonden in veel kankers, zoals maag en colon [10], [14], en gerapporteerd om als een tumor promotor. SIRT2 is een van de cytoplasmatische NAD + - afhankelijke histondeacetylase en deacetylates histon H3 lysine 56 (H3K56) en α-tubuline. Het deelt ook niet-histon substraten FOXO1, FOXO3 en p53 met SIRT1 [11]. Echter, de precieze rol van SIRT2 blijft ongrijpbaar in de biologie van kanker.}

Tegen deze achtergrond hebben we onderzocht of tenovin-6, een klein molecuul verbinding die SIRT1 en SIRT2 functies remt [15], [16], die wordt uitgeoefend antitumor effecten bij activatie van de p53 route bij maagkanker cellen. Recent is gerapporteerd dat SIRT remmers opwaarts gereguleerd dood receptor 5 (DR5), een lid van de tumor necrosis factor receptor familie, in sommige kankers [17], [18]. We bovendien onderzochten de rol van deze receptor in de antitumoractiviteit van tenovin-6 voor maagkanker. Verder onderzochten we de synergie van tenovin-6 met conventionele cytotoxische geneesmiddelen voor de toekomstige klinische ontwikkeling van maagkanker.

Materialen en methoden

Cellijnen

Seven maagkanker cel lijnen werden gebruikt: vier cellijnen met wt TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), twee cellijnen met mutant-type (mt) TP53
(NUGC-3, STKM-1), en één cellijn met null TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Cellijnen met wt TP53
(MCF-7 borstkanker, HEK293 humane embryonale niercellen) en MRC-5 normale humane fibroblasten werden als controles in deze studie. MKN-45, NUGC-4, KatoIII en MRC-5 cellijnen werden verkregen van RIKEN Cell Bank BRC (Tsukuba, Japan). SNU-1 en MCF-7 cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (Rockville, MD). NUGC-3 en HEK293 cellijnen werden verkregen van Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). STKM-1 en STKM-2 cellijnen werden vriendelijk verschaft door Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japan).

Chemie

Tenovin-6 werd gekocht van Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, cisplatine, 5-fluorouracil (5-FU), doxorubicine en thapsigargin werden verkregen van Wako (Osaka, Japan). Ze werden bij een concentratie van 20 mM opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en hoeveelheden werden opgeslagen bij -20 ° C. Voorraadoplossingen werden verdund tot de gewenste uiteindelijke concentraties groeimedium voor gebruik.

Antilichamen en Western blotanalyse

SDS-polyaclylamidegel elektroforese en Western blotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [22]. De primaire en secundaire antilichamen waren als volgt. Konijn polyklonale antilichamen tegen SIRT1 (D739), geacetyleerd (Ac) -p53 (Lys382), gefosforyleerd (fosfo) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubuline (Lys40), death receptor 5 (DR5), Fas geassocieerde dood domein (FADD), gesplitst poly (ADP) -ribose polymerase (PARP) (Asp214), en de muis monoklonale antilichamen tegen p21 ^{Waf /Cip1
(DCS60), histon H3 (96C10) , β-actine (8H10D10), α -tubulin (DM1A) en C /EBP homoloog proteïne (CHOP) (L63F7), konijnen en monoklonale antilichamen tegen TRAIL (C92B9), caspase-3 (8G10), inositol-enzym vereist (IRE ) 1α (14C10) en fosfo-RNA-afhankelijke eiwitkinase-achtige endoplasmatisch reticulum kinase (PERK) (16F8) werden verkregen van Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Muis monoklonaal antilichaam tegen p53 (BP53-12) werd gekocht bij Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) monoklonaal antilichaam van Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), en anti-activerende transcriptiefactor 6 (ATF6) monoklonaal antilichaam (70B1413.1) was van Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Konijn polyklonaal antilichaam tegen Ac-histon H3 (Lys18) was bij Merck Millipore (Billerica, MA). Zowel mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis IgG schaap en anti-konijn IgG ezel sera van GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Antilichaambinding werd gedetecteerd met een ECL Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare), volgens het protocol van de fabrikant. De intensiteit van het signaal werd gekwantificeerd met behulp van Ez-capture II chemiluminescentie imaging-systeem (Atto, Tokyo, Japan).}

Real-time kwantitatieve PCR voor de analyse van SIRT1 Kopen en SIRT2
genexpressie

RNA-monsters werden uit cellysaat geëxtraheerd met een High Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Nadat het genomische DNA werd verwijderd door DNase werd cDNA bereid met een hoge capaciteit RNA naar cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Real-time kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met een Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primers en TaqMan probe voor SIRT1 Kopen en SIRT2
werden verkregen van Applied Biosystems (Assay ID: Hs01009005 en Hs00247263, respectievelijk), en die voor 18S ribosomaal RNA (18S rRNA)
ontworpen en gesynthetiseerd door Sigma-Aldrich waren als volgt: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (voorwaartse primer) 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (reverse primer) 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sonde). Reacties werden in drievoud uitgevoerd onder standaard omstandigheden thermocycling via 30 ng cDNA, 900 nM primers, sondes 250 nM en een Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) volgens het protocol van de fabrikant.

RNA geëxtraheerd uit cellen werden geanalyseerd op de relatieve hoeveelheden van het doelwitgen ( SIRT1, SIRT2
) en de referentie-gen ( 18S rRNA
) door kwantitatieve real-time PCR.

WST-8 cellevensvatbaarheidsassays

WST-8 colorimetrische assays werden uitgevoerd onder toepassing van een Cell Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan), volgens het protocol van de fabrikant. Cellen werden gezaaid in 96-well platen met een dichtheid van 5 x 10 ^{3 cellen per putje met 100 pl kweekmedium voor 24 uur, behandeld met tenovin-6 gedurende 72 uur geïncubeerd in aanwezigheid van WST-8, en vervolgens geanalyseerd met een microplaat reader iMark (Bio-Rad, Hercules, CA).}

Analyse van apoptose door flowcytometrie

de cellen werden gezaaid in 60-mm schaaltjes met een dichtheid van 5 × 10 ^{5 per gerecht. Na incubatie met tenovin-6 (10 uM) of een gelijkwaardige hoeveelheid DMSO gedurende 72 uur werden de cellen tilde met Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, PA) bij kamertemperatuur gedurende 10 min. De cellen werden vervolgens eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing gewassen. Apoptotische cellen werden gedetecteerd door dubbele kleuring met propidiumjodide (PI) en fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabeld annexine V met een Annexine V-FITC Apoptose Detectie Kit (Beckman Coulter, Brea, CA), volgens het protocol van de fabrikant. Flow cytometrische analyse werd vervolgens uitgevoerd met een FACS Calibur stromingscytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en CELLQuest software (BD Biosciences).}

siRNA targeting DR5

siRNA gericht DR5 is gemaakt met behulp siDirect software (http://sidirect2.rnai.jp/), zoals eerder [22] beschreven. siRNA transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), volgens de instructies van de fabrikant. Controle siRNA was een kunstmatige sequentie ontworpen om de minste homologie met menselijke en muizen genen. De sense en antisense strengen van siRNA gebruikt in deze studie waren als volgt: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(sense) 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (antisense); control siRNA, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(sense) 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antisense).

Voor analyse van de effecten van siRNA op celgroei en levensvatbaarheid werden cellen uitgeplaat bij een lage dichtheid (1 x 10 ^{3 cellen per well) in 96-putjes platen die 100 pl RPMI1640-medium met 10% foetaal kalfsserum (Sigma-Aldrich). De levensvatbaarheid van getransfecteerde cellen werd geëvalueerd 72 en 120 uur na transfectie door WST-8 assay.}

Combinatie index

Om te bepalen of tenovin-6 de antitumor effecten van de conventionele chemotherapeutica kunnen verbeteren, we gebruikt een combinatie index (CI) en een isobologram berekend met CalcuSyn software (Cambridge, UK), volgens de Chou en Talalay mediaan effect principe [23]. In deze analyse, CI > 1,3 aangeeft antagonisme; BI = 1,1-1,3 matige antagonisme; BI = 0,9-1,1 additief effect; BI = 0,8-0,9 geringe synergie; BI = 0,6-0,8 matige synergie; BI = 0,4-0,6 synergie; en Cl = 0,2-0,4 sterk synergisme.

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en werden ten minste driemaal herhaald. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De significantie van verschillen werd bepaald met de Student t-test en Dunnett's test. p
-waarden < 0,05 werden beschouwd als significant

Resultaten

De expressie van SIRT1, SIRT2 en geacetyleerd (Ac) -p53 bij maagkanker cellijnen
.

eerst onderzochten we de expressie van SIRT1, SIRT2 en Ac-p53 in zeven maagkanker cellijnen. We gebruikten HEK293 cellen voor de positieve controle van SIRT1 /2 en MCF-7 cellen behandeld met doxorubicine voor de positieve controle van Ac-p53 [24]. Alle maagkanker cellijnen behalve NUGC-4 en STKM-1 cellen brachten hoge niveaus van SIRT1 eiwit en SIRT2 expressie niveaus waren laag in alle cellijnen, behalve voor MKN-45-cellen (Figuur 1A). Ac-p53 expressie niveaus waren zeer laag in alle maagkanker cellijnen met wt TP53
.

We analyseerden de genexpressie van SIRT1 Kopen en SIRT2
door real-time kwantitatieve PCR. MKN-45 cellen vertoonden SIRT1
genexpressie die ongeveer 2,5 maal hoger dan in fibroblasten was, maar andere maagkanker cellijnen niet (Figuur 1B). In NUGC-4 cellen, het niveau van de genexpressie van SIRT1
laag was, als SIRT1 eiwit was. MKN-45 cellen vertoonden een beetje hoog SIRT2
genexpressie, terwijl andere cellijnen toonde eerder lage expressie niveaus.

Tenovin-6 remde de groei van maagkanker cellen

Om naar tenovin-6 activiteit te bevestigen, we onderzocht of tenovin-6 van invloed op de acetylering van histone H3 en α-tubuline. Tenovin-6 verhoogde de acetylering van histone drie (MKN-45, NUGC-4 en KatoIII) van de vier maagkanker cellen geteste lijnen, waarin de remming van SIRT1 deacetylering activiteit (Figuur 2A). Ac-α-tubuline nam slechts in één cellijn (MKN-45) behandeld met tenovin-6, waardoor remming van SIRT2 deacetylering activiteit kan niet definitief worden weergegeven bij maagkanker cellen.

Vervolgens evalueerden we het potentieel antitumoreffect van tenovin-6 tegen maagkanker cellen. Elke maagkanker cellijn werd gekweekt in aanwezigheid van tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20 en 50 uM) gedurende drie dagen. Dosis-afhankelijke remming van de groei werd waargenomen in alle cellijnen, niet alleen die met wt TP53
maar ook mt en null-versies (Figuur 2B). De IC _{50 waarden varieerden 2,34-4,28 uM. Daarnaast werd WST-8 assay uitgevoerd in de humane fibroblast cellijn MRC-5 (IC 50: 6,09 uM) om de toxiciteit van tenovin-6 vergelijken maagkanker cellijnen. De levensvatbaarheid van NUGC-4 cellen behandeld met tenovin-6 significant lager dan die van MRC-5 cellen, zoals weergegeven in figuur 2C.}

Tenovin-6 geïnduceerde apoptotische celdood bij maagkanker cellen

Zoals getoond in figuur 3A en S1, tenovin-6 behandeling verhoogde de expressie van p53 en p21 in wt TP53
cellen (MKN45 en NUGC-4). Up-regulatie van Ac-p53 werd aangetoond in MKN-45 cellen, maar niet in NUGC-4 cellen. Verhoogde p21 expressie werd ook waargenomen in mt TP53
cellen (NUGC-3). Daarentegen was bcl-2-expressie niet veranderen bijna vier maagkanker cellijnen. Verhogingen van DR5 en gesplitst PARP expressie werden waargenomen in alle geteste cellijnen. De expressieniveaus van TRAIL, die functioneren als een ligand in koppeling doodsignaleringscomplex, was enigszins verhoogd in alle cellijnen, hoewel de expressie van FADD, een belangrijke adapter, niet werd beïnvloed door tenovin-6.

Wij onderzocht of tenovin-6 verminderde de levensvatbaarheid van maagkanker cellen door de inductie van apoptotische celdood. Kankercellen werden blootgesteld aan een concentratie van 10 uM of een equivalente mate van controle drager (DMSO) gedurende 72 uur, en vervolgens gekleurd met FITC-annexine V als PI. Ze werden geanalyseerd door flow cytometrie: cellen negatief voor zowel annexine V als PI werden beschouwd als niet-apoptotische zijn cellen positief voor annexine V alleen waren als vroege apoptotische en cellen positief voor zowel annexine V als PI zijn werden beschouwd laat worden apoptotische of necrotische. Blootstelling van MKN-45 cellen tenovin-6 verhoogde de fracties van vroege en late fasen van apoptose van 2,8% tot 52,1% en van 1,8% tot 18,5%, respectievelijk (Figuur 3B). Vergelijkbare verhogingen van de bevolking in de vroege en late fasen van apoptose werden waargenomen in andere cellijnen (NUGC-4, NUGC-3, en KatoIII). Tenovin-6-geïnduceerde apoptose in alle geteste cellijnen, ongeacht de TP53
-status.

Effect van DR5
knock-down on tenovin-6-geïnduceerde apoptose

Vervolgens na te gaan of DR5
silencing beïnvloed tenovin-6-geïnduceerde apoptose, levensvatbaarheid van de cellen en apoptotische rate werden geanalyseerd door WST-8 assay en flowcytometrie, respectievelijk in TP53
-null KatoIII cellen. Remming van DR5-expressie door specifieke siRNA (figuur 4A) aanzienlijk verminderd tenovin-6-geïnduceerde celdood en apoptose in KatoIII cellen (Figuur 4B en 4C). We gebruikten drie verschillende siRNAs in onze voorlopige experiment en we vergelijkbare resultaten kregen met enige siRNA.

We onderzochten de activering van het endoplasmatisch reticulum (ER) spanning pathway, die gekoppeld is aan DR5 opwaartse regulatie, zoals eerder gemeld [17]. CHOP is één van de meest krachtige inductor van DR5 en stroomopwaarts van apoptose, en vaak vrijkomt bij het ER stress. Zoals getoond in figuur 5A en 5B, hoewel CHOP marginaal was opgereguleerd door tenovin-6 behandeling vier maagkanker cellijnen, de verhoogde niveaus waren significant lager dan in controlecellen behandeld met thapsigargine, die een selectieve remmer van sarcoplasmatisch /endoplasmatisch reticulum Ca ^{2+ - ATPasen en op grote schaal gebruikt als een cellulair ER stressor [25], [26]. Aan de andere hand, Ire1, dat een ER stress sensor en geplaatst stroomopwaarts van CHOP, iets opwaarts gereguleerd door tenovin-6 behandeling op alle cellijnen, maar niet gefosforyleerd PERK en ATF6. [27], [28]. Het leek onwaarschijnlijk dat tenovin-6 veroorzaakt ER stress leidt tot DR5-inductie in onze maagkanker cellen.}

antitumoreffect van tenovin-6 in combinatie met chemotherapeutische middelen

Tot slot hebben we onderzocht of tenovin- 6 versterkte het antitumor effect van chemotherapeutische middelen zoals docetaxel, SN-38, cisplatine en 5-FU, in maagkanker cellijnen. Vier cellijnen met wt TP53
(MKN-45, NUGC-4), mt TP53
(NUGC-3) en null TP53
(KatoIII) werden behandeld alleen of in combinatie met twee doses (2 en 5 pM) van tenovin-6 deze middelen. De concentraties waren 0,25 nM docetaxel, 1 nM SN-38, 0,5 of 1 uM cisplatin en 0,25 pM 5-FU. Zoals getoond in Tabel 1 (en figuur S2), docetaxel en SN-38 vertoonde een lichte tot matige synergistisch effect op tenovin-6 behandeling drie cellijnen en cisplatine tenovin-6 vertoonden een geringe synergistisch effect bij twee cellijnen, terwijl 5-FU in combinatie met tenovin-6 toonde een lager effect dan de andere middelen. Onderzochten we de uitingen van DR5 na toediening van tenovin-6 met chemotherapeutische middelen. DR5 up-regulatie door tenovin-6 werd uitgebreid met een combinatie van docetaxel in MKN-45 cellen (Figuur S3).

Discussie

We hebben aangetoond dat tenovin-6 vertoonde krachtige antitumoractiviteit vergezeld apoptotische celdood in menselijke maagkanker cellen met wt TP53
evenals die met mt TP53
. Verscheidene specifieke remmers van sirtuins zoals sirtinol, suramine, salermide en thiobarbiturates werden gerapporteerd celgroei bij verschillende soorten kanker [29] te remmen. De meeste onderzoekers beschreef de antitumor effecten van sirtuin inhibitoren in cellijnen met wt TP53
[15], [29] - [31], en deze toegeschreven aan de activering van apoptose door middel van acetylering van p53. Ondertussen werden verschillende rapporten gepubliceerd in de afgelopen jaren dat de anti-tumor activiteiten van sirtuin remmers in cellijnen toonde met mt TP53
door middel van p53-onafhankelijke routes [17], [18]. We toonden aan dat DR5 knock-down verzwakte de anti-tumor effect van tenovin-6 in TP53
-null maagkanker cellen. Activering van de dood receptor signaalroute via up-regulatie van DR5 speelt een centrale rol in tenovin-6-geïnduceerde celdood, zoals vermeld in andere verslagen over sirtuin remmers.

Er is beschreven dat DR5-expressie verhoogde salermide en geïnduceerde apoptose in menselijke niet-kleincellige longkanker cellen die mt TP53
[17]. In dat verslag, gelijktijdige silencing van SIRT1 Kopen en SIRT2
evenals salermide up-gereguleerd DR5, vergezeld van de up-regulatie van ER-stress-gerelateerde eiwitten, zoals ATF4 en CHOP. Deze resultaten suggereren dat ER stress is betrokken bij dit DR5 inductie. We speculeerden dat tenovin-6 leidde ook tot een toename van DR5-expressie via activatie van ER stress gemedieerd door PERK, Ire1, ATF6 en CHOP. Echter, in tegenstelling tot de verwachtingen, de signaalroute van ER stress geactiveerd door tenovin-6 werd niet duidelijk gedetecteerd. Toch was er duidelijk bewijs dat DR5 werd geïnduceerd door tenovin-6. Er zijn andere routes van CHOP gemedieerde DR5 opregulatie: reactive oxygen species (ROS), de c-Jun NH _{2-terminale kinase (JNK) route, de p38 mitogeen geactiveerde proteïne kinase pathway, enzovoort [ ,,,0],32] - [38]. Echter, we hebben niet deze trajecten onderzoeken hier omdat we CHOP activering niet kon identificeren in onze studie. Onze resultaten suggereren dat p53 en andere CHOP-onafhankelijke routes deelnemen tenovin-6 geïnduceerde DR5-expressie in maagkanker cellen.}

We hebben aangetoond dat tenovin-6 geïnduceerde apoptotische celdood door stimulatie van DR5 route. Echter, p53 en CHOP trajecten leek waarschijnlijk niet zullen worden betrokken bij dit DR5 inductie, en het mechanisme van DR5 up-regulering blijft onduidelijk. We hebben recentelijk onderzocht antitumor effecten van tenovin-6 in verschillende darmkankercellijnen en vond zijn krachtige antitumor activiteit tegen de meeste een up-regulatie van DR5 en [39]. Maar in Caco2 darmkankercellen (mt TP53
), apoptotische celdood door tenovin-6 was minder evident en DR5-expressie was niet sterk up-gereguleerd. Caco2 cellen is gerapporteerd dat hoge hitteschok eiwitten bekend als suppressor van DR5 [40] drukken - [43]. Deze relatie moet verder worden ontwikkeld in de toekomst. SIRT1 kan deacetyleren histone H4 lysine 16 (H4K16) evenals H3K9, H3K14 en H1K26, die nauw verwant zijn aan gene silencing [11]. Daarnaast heeft vele overeenkomstige niet-histon ondergronden: transcriptiefactoren, DNA repair machine elementen, kern receptoren, histon-modificerende enzymen en cel signaalmoleculen, zoals elders beschreven [11] - [13]. Deze talrijke en ingewikkelde verenigingen van SIRT1 activiteit zijn betrokken bij verschillende biologische functies zoals regulering van genexpressie en DNA schade herstel. Kankercellen hebben de neiging om deze functies van SIRT1 nodig om te kunnen overleven, vermenigvuldigen, en reparatie katastrofisch genomische schade. Recente studies hebben het vermogen van tenovin-6 om differentiatie induceren en remmen autofagie als onderdeel van de anti-neoplastische effecten in leukemiecellen [44], [45] geïdentificeerd. Het kan afhangen van kankercel gedrag hoe tenovin-6 beïnvloedt neoplastische activiteit. Verdere studies zijn nodig om de link tussen de tenovin-6-gemedieerde dood route en de complexe rol van SIRT1 te verduidelijken.

We hebben gekeken naar de effecten van het combineren van docetaxel, SN-38, cisplatine en 5-FU met tenovin -6 omdat ze op grote schaal gebruikt voor de behandeling van patiënten met gevorderde maagkanker [46], [47]. Lichte tot matige synergetische effecten van docetaxel en SN-38 met tenovin-6 in de maagkanker cellijnen, ongeacht TP53
status gevonden.

Hoewel behandelingen in combinaties van docetaxel en sirtuin remmers niet gemeld, combinaties van docetaxel en andere HDAC-remmers zoals trichostatine A en suberoylanilide hydroxamzuur (SAHA) zijn gerapporteerd synergistische effecten met betrekking tot caspase activering of tubuline acetylering in verscheidene kankercellijnen hebben [48] - [50] . In onze studie, het blijft onduidelijk of de tubuline acetylering door tenovin-6 altijd van invloed op de anti-tumor effect, omdat de tubuline acetyleren bleek slechts in een cellijn. SN-38 (de actieve vorm van irinotecan) een DNA-topoisomerase-I-remmer die werkt alleen tijdens de S-fase en interfereert met DNA-replicatie en celdeling [51], [52]. HDAC-remmers induceren acetylering van histonen en draai de chromatine structuur, waarbij topoisomerase remmer kan gemakkelijker toegang krijgen tot DNA, het vergemakkelijken van DNA-schade [51], [53]. Daarnaast is een opmerkelijke toename van ROS generatie gerapporteerd in kleincellige longkankercellen bij gelijktijdige blootstelling aan SAHA en topotecan (een derivaat van camptothecine) [51]. De toegenomen potentie van behandeling combineren tenovin-6 en SN-38 kan worden toegeschreven aan coöperatieve regulering van de DNA schade respons.

De voordelen van gecombineerde behandeling met tenovin-6 en cisplatine of 5-FU was minder dan met andere middelen bij maagkanker cellen, hoewel verscheidene verslagen versterking van apoptose aangetoond door gecombineerde behandeling met cisplatine of 5-FU en andere HDAC-remmers in andere tumoren [54] -. [57]

Wat de toxiciteit evaluatie van tenovin-6, gebruikten we een fibroblast cellijn als alternatieve niet-tumorigene cellen om de toxiciteit voor normale cellen betreffende de voorgaande rapporten [15], [18] voorspellen. Het was moeilijk om een ​​geschikte normale controle vergelijkende studies vinden, en derhalve definitief nodig om de toxiciteit van tenovin-6 (in combinatie met anti-kanker drugs) bestuderen In vivo
behulp dierlijke xenograft modellen.

Tot slot, een sirtuin inhibitor, tenovin-6, toonde een sterke anti-tumor effect tegen menselijke maagkanker cellen. Dit was onafhankelijk van de TP53
status en werd geïnduceerd via up-regulatie van DR5. Verder onderzoek is nodig om het mechanisme waarmee tenovin-6 reguleert DR5-expressie verduidelijken. Tenovin-6 combinatie met docetaxel en SN-38 had een klein voordeel voor remming van gastrische kankercelproliferatie, die een nieuwe strategie kan voorzien in de behandeling van gevorderde maagkanker.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
relatieve intensiteit van expressie van de eiwitten "in figuur 3A. Semi-kwantificering van Western blotting densitometrie betrokken normalisatie aan P-actine niveaus
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF)
Figuur S2.
cytotoxische effecten van chemotherapeutische middelen in combinatie met tenovin-6. Cytotoxische effecten van chemotherapeutische geneesmiddelen zoals docetaxel, SN-38, cisplatine en 5-FU, en de versterking van de effecten van tenovin-6 bij maagkanker cellen met maagkanker cellen. De cellen werden gedurende 72 uur met de aangegeven concentraties tenovin-6 en chemotherapeutische geneesmiddelen. A: Docetaxel (0,25 nM), B: SN-38 (1 nM), C: cisplatin (1 of 0,5 uM, NUGC-3 werd behandeld met 0,5 uM cisplatine) en D: 5-FU (0,25 pM) kregen in combinatie met tenovin-6. De statistische significantie van verschillen tussen groepen werd geëvalueerd met behulp van Dunnett's test. * p Restaurant < 0,01; ** p Restaurant < 0,05. DOC: docetaxel, CDDP. Cisplatine
doi: 10.1371 /journal.pone.0102831.s002
(TIF)
Figuur S3.
DR5 uitdrukkingen na toediening van tenovin-6 met docetaxel of SN-38 bij maagkanker cellen (MKN-45 en KatoIII). Docetaxel, SN-38 en tenovin-6 werden toegediend in een concentratie van 0,25 nM, 1 nM en 2 uM. Semi-kwantificering van Western blotting densitometrie betrokken normalisatie aan P-actine levels. DOC:. Docetaxel
doi: 10.1371 /journal.pone.0102831.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Slak-Gereglementeerde MiR-375 Remt Migratie en invasie van maagkanker cellen door Targeting JAK2
• PLoS ONE: een gemodificeerde Delta-vormige Gastroduodenostomy in Totally laparoscopische distale Gastrectomie voor maagkanker: Een veilige en Haalbaar Techniek