PLoS ONE: RABEX-5 opgereguleerd en speelt een Oncogene rol bij maagkanker Development door het activeren van de VEGF-signaleringsroute

Samenvatting

RABEX-5, een guanine-nucleotide exchange factor (GEF) voor RAB-5, is betrokken bij het ontstaan ​​van tumoren en de ontwikkeling van bepaalde humane kankers. Hier vermelden wij dat RABEX-5 bevordert de groei van de tumor en het metastatische vermogen van maagkanker cellen zowel In vitro Kopen en In vivo
. Expressie van RABEX-5 significant hoger bij maagkanker weefsels en wordt geassocieerd met tumorgrootte en lymfeklier. Bovendien gerichte silencing van RABEX-5 verminderde maag- proliferatie van kankercellen en kolonievorming in vitro
via de inductie van een G0 /G1 fase, en gestimuleerd maagkanker apoptose. Knockdown van RABEX-5 ook geremd wondgenezing, migratie en de invasieve mogelijkheden van maagkanker cellen. De resultaten van de In vivo
dierexperimenten waren ook in overeenstemming met deze In vitro
bevindingen. Silencing van RABEX-5 heeft geleid tot verminderde expressie van VEGF. Deze resultaten geven aan dat RABEX-5 opgereguleerd en speelt een rol bij oncogene maag kankerontwikkeling door activering van de VEGF signaleringsroute

Citation:. Wang S, Lu A, Chen X, L Wei, Ding J (2014) RABEX-5 opgereguleerd en speelt een Oncogene rol bij maagkanker Development door het activeren van de VEGF-signaleringsroute. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10.1371 /journal.pone.0113891

Editor: Xin-Yuan Guan, de Universiteit van Hong Kong, China

Ontvangen: 3 september 2014; Aanvaard: 31 oktober 2014; Gepubliceerd: 26 november 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Deze auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

Ondanks een daling in de wereldwijde incidentie in bepaalde regio's van de wereld, blijft maagkanker het vierde hoogste in de incidentie en de tweede plaats in de sterfte onder alle vormen van kanker in de wereld [1]. Studies tonen aan dat milieufactoren, zoals Helicobacter pylori infectie
, roken en voeding kan een belangrijke rol spelen bij maag- kankerontwikkeling [2]. Beginnende maagkanker is meestal asymptomatisch of geassocieerd met specifieke symptomen, zoals dyspepsie, en tegen de tijd symptomen optreden, is het vaak ver gevorderd. Ondanks het gezamenlijk gebruik van multimodale therapie (chemotherapie, bestraling en chirurgie), de 5-jaars overleving van patiënten blijft laag, bij 20-40% [3]. Hoewel onderzoek bij maagkanker grote vorderingen heeft gemaakt, blijft de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van maagkanker onvolledig begrepen.

Exocytosis en endocytose zijn belangrijke processen die worden gebruikt door de cellen om de normale fysiologische functie te behouden en blaasje vervoer is een kern onderdeel van dit proces. Kleine GTPases spelen een schakelfunctie in intracellulaire moleculen en een zeer belangrijke rol in endocytose en vesicle transport, waaronder de regulering van celgroei, signaaltransductie, differentiatie en actine cytoskelet overig vele aspecten van de andere cellulaire processen [4]. In de Ras superfamilie, zijn er meer dan 50 soorten GTPases, waaronder Rab, dat tot de grootste subfamilie [5]. Studies hebben aangetoond dat de meeste Rab eiwitten reguleren gericht transport, fagocytose en docking specifieke membranen, waarbij een klein aandeel van Rab eiwitten reguleren vesikel knopvorming [6], [7]. De kleine GTPase RAB-5, die wordt verspreid in het plasmamembraan en de vroege endosomen, is een meester regulator van de vroege endocytische mensenhandel [8]. Net als andere kleine GTPases, wordt RAB-5 geactiveerd door een uitwisseling van gebonden BBP met GTP, gekatalyseerd door een familie van guanine nucleotide uitwisseling factoren [9]. RABEX-5 werd geïdentificeerd als een interactor van Rabaptin-5 en bezit GEF activiteit tegenover RAB-5 en gerelateerde GTPases. Op dezelfde manier, zowel RABEX-5 en Rabaptin-5 nodig zijn voor RAB-5-driven endosoom fusie in vitro
[10].

Recente studies hebben aangetoond dat RABEX-5 expressie is aanzienlijk hoger in verschillende kankers, waaronder borstkanker [11], prostaatkanker [12] en colorectale kanker [13]. Abnormale RABEX 5-expressie in tumoren suggereert dat RABEX-5 significant bij kanker pathogenese en progressie, en kunnen tumor biologisch gedrag beïnvloeden. Echter, de rol en het werkingsmechanisme van RABEX-5 bij maagkanker carcinogenese en progressie zijn nog niet bepaald. In deze studie hebben we eerst geanalyseerd expressie van RABEX-5 bij maagkanker weefsels met behulp van kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (qRT-PCR) en immunohistochemie. Vervolgens hebben we de effecten van RABEX-5 onderzocht op tumor biologische functie In vitro Kopen en In vivo
. Onze resultaten tonen aan dat RABEX-5 wordt overexpressie en speelt een oncogene rol bij maagkanker.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Alle dierproeven in deze studie beschreven, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan Taishan Medische Universiteit en alle dieren werden in overeenstemming met de richtlijnen IACUC gehandhaafd. Het verzamelen en het gebruik van menselijke monsters werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Taishan Medische Universiteit en de aangesloten Taian Central Hospital Medical Center, na geïnformeerde schriftelijke toestemming van alle patiënten.

Patiënten en weefselmonsters

Een totaal van 110 sets van maag tumoren en aangrenzend, niet-tumorweefsels (minimaal 5 cm van de tumor marge) werden verkregen van patiënten die curatieve geopereerd in Tai Central Hospital tussen januari 2010 en december 2013. Deze omvatten 27 mannen en 83 mannen, met een gemiddelde leeftijd van 59,3 jaar (spreiding: 32-80 jaar). Geen van de patiënten had radiotherapie of chemotherapie kregen voorafgaande aan operatie. Clinicopathologische gegevens werden verzameld en pathologische tumor enscenering werd bepaald op basis van de gemengde commissie Amerikaanse on Cancer (AJCC) maagkanker TNM-classificatie. Histologische typering werd uitgevoerd door ten minste twee ervaren pathologen, zelfstandig werken in een dubbel-blinde manier. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van Taishan Medische Universiteit en de aangesloten Taian Central Hospital Medical Center. Schriftelijke toestemming werd verkregen van elke patiënt voorafgaand aan de inschrijving in de studie.

Cellijnen en kweekomstandigheden

Human maagkanker cellijnen en de vereeuwigd maag, mucosale epitheliale cellijn, GES-1 , werden gekocht van de Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen, de Chinese Academy of Sciences. Cellijnen werden routinematig aangehouden in RPMI-1640 medium dat 10% kalfsserum, penicilline (100 IU /ml) en streptomycine (100 IE /ml) in een 5% CO _{2 atmosfeer bij 37 ° C.}

Totaal RNA isolatie en qRT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit weefselmonsters of cellijnen behulp van Trizol reagens (Invitrogen, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Reverse transcriptie werd uitgevoerd onder gebruikmaking van 1 ug van totaal RNA volgens de instructies van de fabrikant (Promega, Madison, WI, USA). PCR werd uitgevoerd met SYBR Green reagens (Applied Biosystems, CA, USA) en de volgende PCR primers; RABEX-5
(voorwaarts) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'en (omgekeerde) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3'; VEGF
(voorwaarts) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'en (omgekeerde) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3' en GAPDH
(voorwaarts) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'en (omgekeerde) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. PCR reacties werden uitgevoerd met een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min. GAPDH
werd gebruikt als een interne controle en alle reacties werden uitgevoerd in drievoud. De relatieve expressie verhoudingen van RABEX-5
in elk gepaarde tumor niet-tumorweefsel monster werden berekend met behulp van de 2 ^{-ΔΔCt methode.}

Immunohistochemie

Paraffine Ingebedde weefselcoupes van patiënten of naakt muizen werden thermisch behandeld bij 60 ° C gedurende 1 uur was ontdaan in xyleen, gerehydrateerd in een ethanol reeks (100-50%) en 0,01 mol /l citraatbuffer (pH 6,0 behandeld ) voor het antigen herstel. Endogene peroxidase activiteit werd geremd na incubatie met methanol dat 0,3% H _{2O 2 gedurende 30 minuten. Secties werden vervolgens geïncubeerd met antilichamen detecteren RABEX-5 (01:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) of VEGF (1:150, Ab46154, Abcam, VS) bij 4 ° C overnacht. De volgende experimentele procedure werd geïncubeerd met het secundaire antilichaam. Weefsel secties werden tegengekleurd met Mayer's hematoxyline. Dia's werden onafhankelijk beoordeeld door twee pathologen, verblind aan elke patiënt gegevens. De kleuring intensiteit RABEX-5 werd gescoord als 0 (geen kleuring), 1 (mild kleuring), 2 (matig kleuring) of 3 (intense kleuring). Kleuring gebied werd gescoord als 0 (0%) 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) of 4 (76-100%), op basis van het percentage positief gekleurde cellen. De uiteindelijke kleuring score, berekend als de som van de intensiteit en verlenging scores, werd verdeeld in drie groepen als volgt: 0-2, negatief expressie; 3-4, zwakke expressie; en 5-6, sterke expressie.}

Gerichte silencing van RABEX-5

De RABEX-5 lentivirale interferentie vector werd gekocht van Shanghai GenePharma Co., Ltd. De sequentie van de RABEX-5 interferentie gericht oligo was 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', terwijl de niet-homologe sequentie controle was 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. SGC-7901 en NCI-N87-cellen werden uitgeplaat in 6-well platen (5 x 10 ^{4 cellen /putje) gekweekt tot 40% confluentie en behandeld met getitreerd virale supernatant bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10.}

Western blotanalyse

Totaal celeiwitten werden geëxtraheerd uit cellen met behulp RIPA buffer die Protease Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). Eiwit werd gekwantificeerd onder toepassing van een BCA Protein Assay Kit (Pierce). Celextracten (100 ug) werden gescheiden door 10% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese en overgebracht op polyvinylideenfluoride membranen. Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 ° C overnacht. De primaire antilichamen gebruikt werden, waren konijnen anti-RABEX-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), konijn anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) en muis anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Membranen werden vervolgens driemaal gewassen in TBS-Tween oplossing gedurende 15 minuten en geïncubeerd met secundaire antilichamen. Signalen werden gedetecteerd onder toepassing van een versterkte chemiluminescentie detectiesysteem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) volgens het protocol van de fabrikant.

celproliferatie assay

Celproliferatie werd gemeten onder toepassing van een Cell Counting Kit -8 (CCK-8; DOJINDO Laboratories, Kumamoto, Japan). SGC-7901 of NCI-N87-cellen werden gezaaid in 96-well platen (1,5 x 10 ^{3 cellen /putje) en gedurende verschillende tijdstippen (24, 48, 72, 96 en 120 uur). Kweekmedium werd vervolgens verwijderd en vervangen door 200 ul RPMI-1640 medium dat 10% FBS en 20 pl CCK-8 en de platen werden gedurende 3 uur geïncubeerd bij 37 ° C. De absorptie werd gemeten bij 450 nm onder toepassing van een Safire2 microplaat reader. RPMI-1640 medium dat 10% FBS en CCK-8 werd gebruikt als controle.}

kolonievorming assay

De cellen werden uitgezaaid in 6-well platen (1 x 10 ^{3 cellen /putje) en kweekmedium werd elke 3-4 dagen vervangen. Na 14 dagen kweek werden cellen kolonies gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 10 min gekleurd met 0,1% kristalviolet gedurende 20 min, en gefotografeerd. Kolonies met meer dan 50 cellen werden geteld in elk dashboard.}

Analyse van de celcyclus en apoptose

SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD cellen en controlecellen werden verzameld en celcyclus en apoptose werd vastgesteld door flowcytometrie. Voor celcyclusanalyse werden de cellen gefixeerd met 75% ethanol en opgeslagen bij 4 ° C overnacht. De volgende dag, gefixeerde cellen werden gewassen met PBS, behandeld met RNase A (50 ug /ml) en gekleurd met propidium jodide (PI) (50 ug /ml) gedurende 30 minuten in het donker. De gekleurde cellen werden geanalyseerd door flowcytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson).

Voor apoptose analyse een Annexine V-APC Apoptose Detectie Kit I (BD Pharmingen, USA) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. PI en annexine V-APC dubbele kleuring werd uitgevoerd en de cellen werden geanalyseerd met flowcytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson), met de Cell Quest software (Becton-Dickinson). Annexine V-APC-positieve en PI-negatieve cellen werden gedefinieerd als apoptosis ondergaan. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de gemiddelde waarden van deze groepen werden berekend.

Transwell migratie en invasie assay

Voor de migratie assays, 1 x 10 ^{5 cellen werden gesuspendeerd in serum vrij RPMI-1640 medium en uitgeplaat op kamers die niet werden bekleed met Matrigel (Corning Costar, NY, USA). Voor de invasie assay, werd de bovenste kamer vooraf bekleed met Matrigel (BD Bioscience, CA, USA) volgens de protocollen van de fabrikant, en 1 x 10 5 cellen in serumvrij RPMI-1640 medium werd toegevoegd aan de kamer. Voor beide testen werd medium met 10% FBS aan de onderste kamer als een chemoattractant toegevoegd. Na 24 uur kweek werden kamers gekleurd met 0,5% kristalviolet oplossing voor 15 min, en ondergedompeld in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 10 min. Cellen in de onderste kamer werden vervolgens geteld onder een geïnverteerde microscoop. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde celaantallen in vijf willekeurige gezichtsveld (200 x).}

Wondhelende assay

De cellen werden uitgezaaid in 6-putjesplaten en gekweekt totdat zij confluentie bereikten. Wonden werden gekrast op de monolaag van cellen met behulp van 20-ul pipetpunten. De platen werden eenmaal met vers medium gewassen om niet-hechtende cellen na kweek van cellen voor 0 of 48 uur (gemiddeld zonder kalfsserum) te verwijderen, en gefotografeerd.

xenotransplantaatmodel

Vier-week- oude mannelijke BALB /C naakt muizen werden gekocht van het Institute of Zoology, de Chinese Academie van Wetenschappen van Shanghai. De dieren werden gehuisvest in kooien met houtsnippers beddengoed in een temperatuur-gecontroleerde ruimte (68-72 ° F) met een 12-uur licht-donker cyclus en 45-55% relatieve vochtigheid, en mochten gratis toegang tot voedsel en drinkwater. In het kort SGC-7901 /KD of SGC-7901 /NC cellen getrypsiniseerd en opnieuw gesuspendeerd in PBS (pH 7,4) voor injectie in een muis, in een totaal volume van 100 ul. De celsuspensie (1 x 10 ^{6 cellen) geïnjecteerd in de rechterflank van muizen. Tumorgrootte uitwendig gemeten om de 3 dagen met een schuifmaat, en tumorvolume werd geschat met behulp van de formule: lengte (mm) x breedte 2 (mm) x 0,52. Om het lijden van de muizen waargenomen tijdens deze experimentele studies te verbeteren, werden de muizen gedood door CO _{2 inhalatie op de 28e dag na de intraperitoneale injectie, en tumoren werden gewogen na dissectie. Monsters werden opgeslagen in vloeibare stikstof voor qRT-PCR of in 4% formaline gefixeerd aan paraffine ingebedde coupes verkrijgen. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de Animal Care en gebruik Guidelines door de Taishan Medische Universiteit Animal Care goedgekeurd.}}

Statistische analyse

De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische verschillen tussen de twee groepen werden onderzocht door Student's t
-test. Correlaties tussen RABEX-5 expressie bij maagkanker weefsels en clinicopathologische parameters werden geanalyseerd door chi-kwadraat of exacte toets van Fisher. P Restaurant < 0,05 werd als significant beschouwd, en P Restaurant < 0,01 werd beschouwd als zeer belangrijk

Resultaten

RABEX-5 expressie is opgereguleerd in. maagkanker weefsels

De expressie van RABEX-5
werd bij maagkanker en naburige niet-tumorweefsels door qRT-PCR onderzocht. We zagen significant hogere expressie van RABEX-5
mRNA bij maagkanker weefsels in vergelijking met overeenkomstige niet-tumor weefsel ( P
. ≪ 0,01, figuur 1A). Deze resultaten werden bevestigd op eiwitniveau door immunohistochemische kleuring (fig. 1B, C, D, E). RABEX-5 expressie werd voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma van kankercellen. RABEX-5 werd opgereguleerd in 61,8% (68/110) van maagkanker patiënten. Vervolgens onderzochten we de relatie tussen RABEX-5 expressie en clinicopathologic kenmerken van maagkanker. Opregulatie van RABEX-5 werd in verband gebracht met een grootte van de tumor ( P
= 0,035) en de lymfeklieren metastase ( P
= 0,006), maar niet met andere klinische en pathologische factoren zoals geslacht, leeftijd of tumor locatie (Tabel 1).

negatieve regulatie van RABEX-5 maag remt proliferatie van kankercellen en kolonievorming

vervolgens onderzochten we de expressie van RABEX-5 gastrische cellijnen en de niet-kanker-cellijn , GES-1, door western blot analyse. RABEX-5 werd tot expressie gebracht in alle geteste cellijnen en was bijzonder hoog in SGC-7901 en NCI-N87-cellen (Fig. 2A). Om de functies van RABEX-5 verkennen in maagkanker cellijnen, uitgevoerd we gerichte knock-down van RABEX-5 in de hoge expressie cellijnen, SGC-7901 en NCI-N87. RABEX 5-expressie was significant verlaagd in SGC-7901 /KD en NCI-N87 /KD cellen vergeleken met controle cellen (Fig. 2B). Eerst hebben we het effect van het verlies van RABEX-5 op de groei van maagkanker cellen onderzocht. Na 5 dagen van de cultuur, de groei van de SGC-7901 /KD en NCI-N87 /KD-cellen was beduidend langzamer dan de controlegroep (Fig. 2C). Ook bevestigde deze observaties in kolonievorming assays. Kolonie aantallen significant verlaagd SGC-7901 /KD cellen en NCI-N87 /KD cellen vergeleken met controle cellen (Fig. 2D), en we geconstateerd dat koloniegrootte ook kleiner in experimentele groepen ten opzichte van controles. Deze gegevens suggereren dat neerwaartse regulatie van 5-RABEX onderdrukt maag kankercelproliferatie.

negatieve regulatie van RABEX-5 bevordert apoptose van maagkanker cellen en induceert G0 /G1 celcyclus

De waargenomen effecten van RABEX-5 knockdown op celgroei mogelijk door veranderingen in de celcyclus en apoptose. Daarom onderzochten wij de effecten van RABEX-5 silencing op celcyclus en apoptose In vitro
, met behulp van flowcytometrie. Flow cytometrische analyse bleek dat het percentage van cellen in de G0 /G1 fase SGC-7901 /KD of NCI-N87 /KD cellen was hoger dan in SGC-7901 /NC of NCI-N87 /NC controlegroepen, terwijl het percentage cellen in de G2 /M fase werd significant verminderd vergeleken met controles (Fig. 3A, B). Ook waargenomen aanzienlijk apoptose in de verschillend behandelde groepen (Fig. 3C, D), met downregulatie van RABEX-5 expressie leidt tot een toename van maagkanker cel apoptose.

negatieve regulatie van RABEX-5 remt migratie , invasie en wondgenezing vermogen van maagkanker cellen

Om de invloed van RABEX-5 over migratie en invasie onderzoeken we vervolgens uitgevoerd transwell migratie en invasie assays. Downregulatie van RABEX-5 onderdrukt celmigratie (SGC-7901 /KD groep, 121,3 ± 6,1 cellen /veld; SGC-7901 /NC-groep, 261,0 ± 10,5 cellen /veld; NCI-N87 /KD groep, 108,7 ± 6,1 cellen /veld; NCI-N87 /NC-groep, 241,7 ± 10,6 cellen /veld; P
. < 0,05) (figuur 4A, C). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in transwell invasie assays (SGC-7901 /KD-groep, 76,3 ± 6,1 cellen /veld; SGC-7901 /NC-groep, 108,7 ± 6,0 cellen /veld; NCI-N87 /KD-groep, 60,7 ± 6,0 cellen /veld; NCI-N87 /NC-groep, 119,0 ± 8,5 cellen /veld; P Restaurant < 0,05) (Fig 4B, D)

Om het effect van RABEX-5 op de beweeglijkheid te onderzoeken.. en wondgenezing, we ook uitgevoerd wondgenezing assays. We zagen dat de afstand tussen de wondranden van SGC-7901 /KD en NCI-N87 /KD cellen was aanzienlijk langer dan die van SGC-7901 /NC of NCI-N87 /NC-cellen (Fig. 4E). Overeenkomstig deze waarnemingen niveaus van VEGF werden neerwaarts gereguleerd zowel op mRNA en eiwitniveaus in SGC-7901 /KD cellen (fig. 4F, G).

zwijgen van RABEX-5 remt maagkanker in vivo

op basis van de in vitro
bevindingen hierboven beschreven, we vervolgens onderzocht het effect van RABEX-5 silencing op tumorgroei in vivo
door het injecteren SGC7901 /KD of SGC7901 /NC cellen subcutaan in de rechter flank regio's van naakt muizen. Tumorgrootte werd elke 3 dagen gevolgd met een schuifmaat. Tumor volume was significant verminderd bij muizen 2 weken na de injectie van SGC-7901 /KD-cellen in vergelijking met controle-cellen ( P Restaurant < 0,05; fig. 5A). Het tumorvolume van xenotransplantaten afgeleid van het SGC-7901 /KD groep was vergelijkbaar met dat van het SGC-7901 /NC groep, vertonen een opmerkelijke afname in tumorvolume 4 weken na tumorcelinoculatie ( P
< 0,05, Fig. 5B, C). Bovendien is het gewicht van tumoren afgeleid van SGC-7901 /KD cellen was significant lager dan die van de controles ( P
< 0,05; fig. 5D). We vervolgens gekeken naar de expressie van VEGF in transplantatie tumormonsters door qRT-PCR en immunohistochemie. Zoals getoond in Fig. 5E en 5F, niveaus van VEGF mRNA en eiwit werden afgenomen in de SGC-7901 /KD groep in vergelijking met de SGC-7901 /NC controle. Deze In vivo
gegevens zijn in overeenstemming met onze In vitro
observaties en bevestigen dat silencing van RABEX-5 remt maag groei en progressie van kanker door het moduleren van VEGF transcriptionele activiteit. Samengevat RABEX-5 speelt een oncogeen rol bij maagkanker

Discussie

Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat RABEX-5 speelt een rol in tumorvorming bij verschillende soorten kanker [11]. - [14], zijn rol bij maagkanker had niet onderzocht. In deze studie bleek dat RABEX 5-expressie aanzienlijk maagkanker weefsels opgereguleerd tegenover aangrenzend normaal weefsel, wat aangeeft dat RABEX-5 kan bijdragen aan maagkanker tumorgenese. Daarnaast werd de expressie van RABEX-5 significant geassocieerd met tumorgrootte en lymfeklier. In tegenstelling, waren er geen significante correlaties tussen abnormale RABEX-5 expressie en geslacht, leeftijd of tumor locatie. Dit is de eerste studie naar de klinische en betekenis van RABEX-5-expressie bij patiënten met maagkanker verhelderen.

Om de rol van RABEX-5 in de tumor promotie onderzoeken, we volgend uitgevoerd uitgebreide verlies van functie-analyse in RABEX- 5 hoog tot expressie cellijnen, SGC-7901 en NCI-N87. Succesvolle tegengaan van 5 RABEX-expressie werd bereikt door RNAi technologie en knockdown werd bevestigd door Western blot. Onze analyse bleek dat de celproliferatie aanzienlijk SGC-7901 /KD en NCI-N87 /KD cellen en vergelijkbare resultaten werden verkregen verlaagd in kolonievorming assays. Belangrijk is, In vivo
xenograft modellen ondersteund deze In vitro
observaties. Dit fenotype kan worden veroorzaakt door RABEX-5 betreffende specifieke genen en signaalwegen, waardoor celcyclus en apoptose beïnvloeden. In Transwell assays, minder SGC-7901 /KD en NCI-N87 /KD cellen gemigreerd naar de Tweede Kamer dan controle cellen, wat suggereert dat RABEX-5 verbetert de migratie en invasie bij maagkanker cellen. Wondgenezing was ook significant afgenomen na silencing van RABEX-5. Deze resultaten verifiëren de belangrijke rol van RABEX-5 in gastrische kanker celgroei en metastatische gedrag. De exacte werkingsmechanisme waardoor RABEX-5 oefent deze effecten nog onbekend, omdat studies met RABEX-5 beperkt.

Eerdere studies hebben aangetoond dat RABEX-5 kan specifiek binden aan de actieve vorm van RAB- 5, waardoor de docking en fusie van endosomale membranen, de beweeglijkheid van endosomen en intracellulaire signaaltransductie [15] reguleren. De expressie van RAB-5 eiwitten is geassocieerd met de ontwikkeling van diverse kwaadaardige tumoren [16] - [18] en kunnen bevorderen migratie van tumorcellen [19], [20]. Angiogenese speelt een belangrijke rol bij het ontstaan ​​van tumoren [21], en wordt gereguleerd door een aantal factoren zoals de bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) [22]. De PI3K /Akt signaleringsroute kan worden geregeld door zowel VEGF en PDGF. Bijvoorbeeld VEGF verbetert neuroblastoma proliferatie door activering van PI3K /Akt signalering [23]. Ook hebben studies aangetoond dat PDGF kunnen hebben voor de migratie vermogen van cellen via de PI3K /AKT pathway [24]. [29] [31] en bevorderen voortgang van de celcyclus [30], waardoor celoverleving en proliferatie bevorderen - activatie van PI3K /Akt signalering kan apoptose geïnduceerd door verschillende stimuli [25] remmen. Deze route neemt ook deel angiogenese [32], [33], en speelt een belangrijke rol in tumorvorming en metastase [34], [35]. Onze studie toont aan dat RABEX 5-silencing veroorzaakt een afname in VEGF-expressie. Daarom hebben we veronderstellen dat RABEX-5 bevordert de groei en metastatische vermogen van maagkanker cellen door activering van VEGF en de stroomafwaartse signaalwegen.

Tot slot laten we zien dat RABEX-5 bevordert proliferatie, kolonievorming, migratie en invasie, wat suggereert dat 5-RABEX een oncogen bij maagkanker kan zijn, en de gevolgen kan gedeeltelijk worden gemedieerd door de modulatie van VEGF activering. RABEX-5 kan daarom een ​​nieuwe diagnostische en prognostische marker en een nieuw therapeutisch doelwit bij maagkanker. Er moeten meer inspanningen worden gedaan om de signaalwegen ten grondslag liggen aan deze biologische fenomenen te verduidelijken.

• PLoS ONE: Serum OPN Uitdrukking voor Identificatie van maagkanker en atrofische gastritis en haar Beïnvloeden Factors
• PLoS ONE: CEACAM6 Bevordert maagkanker en metastase door inductie-mesenchymale transitie via PI3K /AKT Signalering Pathway