PLoS ONE: Gene Expression Signature Analysis Geeft Vorinostat als een kandidaat-therapie voor maagkanker

De abstracte

Achtergrond

Maagkanker blijft één van de meest dodelijke soorten kanker de wereld en dus identificatie van nieuwe medicijnen die deze vorm van kanker is dan ook van groot belang zijn. Het doel van deze studie was het identificeren en valideren van een therapeutisch middel dat de resultaten voor maagkanker patiënten in de toekomst kunnen verbeteren.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Met microarray technologie genereerden wij een gen expressieprofiel van menselijke maagkanker specifieke genen van maagkanker menselijke weefselmonsters. We gebruikten dit profiel in de globale Instituut Connectivity Map analyse om kandidaat-therapeutische verbindingen te identificeren voor maagkanker. We vonden de histondeacetylaseremmer vorinostat als lead compound en dus een potentieel therapeutisch medicijn voor maagkanker. Vorinostat geïnduceerde zowel apoptose en autofagie bij maagkanker cellijnen. Farmacologische en genetische inhibitie van autofagie groeide echter de therapeutische werking van vorinostat, wat aangeeft dat een combinatie van vorinostat met autophagy remmers therapeutisch voordeliger kan zijn. Bovendien genexpressie analyse van maagkanker identificeerde een verzameling van genen ( ITGB5, tyms, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A, Kopen en KIF20A
) waarvan de expressie werd verhoogd in de maag tumorweefsel en meer dan 2-voudig door vorinostat behandeling bij maagkanker cellijnen neerwaarts gereguleerd. In tegenstelling, SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1, Kopen en NQO1
gemanifesteerd een omgekeerde patroon.

Conclusies /Belang

We hebben laten zien dat de analyse van gen expressie signatuur kan een nieuwe aanpak zijn therapeutische middelen voor maagkanker, zoals vorinostat ontdekken. De waarneming van veranderde genexpressie na vorinostat behandeling kan de sleutel tot het moleculaire mechanisme van vorinostat en die patiënten baat hebben bij een behandeling vorinostat identificeren bieden

Visum:. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Park YY, Kim K, SB Kim, et al. (2011) Gene Expression Signature Analysis identificeert Vorinostat als een kandidaat-therapie voor maagkanker. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10.1371 /journal.pone.0024662

Uitgever: David L. McCormick, IIT Research Institute, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 29 maart 2011; Aanvaard: 16 augustus 2011; Gepubliceerd: 9 september 2011

Copyright: © 2011 Claerhout et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Financiering SC als Odyssey Fellow werd gesteund door de Odyssey Programma en de Theodore N. wet Endowment for Scientific Voltooiing aan de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center. Dit werk werd ook gesteund door fondsen van de 2009 Interne Geneeskunde Academic Research Fund en Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea gefinancierd door het ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (No. 2010-0024248). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kankersterfte ter wereld [1], met een totale overleving van ongeveer 10 maanden [2] - [4]. Behandeling van maagkanker kan omvatten chemotherapie, chirurgie en radiotherapie. Helaas stroombegrenzing gebaseerde chemotherapie behandelingen voor gevorderde maagkanker tonen teleurstellende resultaten [2] - [4]. Inderdaad, complete remissies zijn zeldzaam en duren slechts zeer kort.

Een aantal gerichte agenten die de overleving voordelen bij andere soorten kanker te kennen hebben in onderzoek bij maagkanker geweest. Hoewel sommige vroege klinische studies met vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGFR) en epitheliale groeifactor receptor (EGFR) -1-remmers, zoals cetuximab en bevacizumab, blijkt enigszins activiteit, is er zelden een effectief overlevingsvoordeel voor patiënten [5] , [6]. Een van de redenen kan zijn dat deze studies patiënten heeft geselecteerd op basis van de aanwezigheid van biomarkers. Onlangs heeft de Trastuzumab voor maagkanker (ToGA) studie merkte op dat de toevoeging van trastuzumab chemotherapie leidde tot een statistisch significante verbetering in progressievrije overleving (PFS) en algehele overleving (OS) van de ongeveer 20% van de patiënten met gemetastaseerde maag- en gastro-oesofageale (GE) knooppunt tumoren overexpressie HER2 [7]. Dit benadrukt de noodzaak voor gerichte biologische therapie en de zoektocht naar biomarkers om patiënten te selecteren voor klinische proeven die in aanmerking te overleven. Hoewel er aanwijzingen van potentiële doelen, waaronder HER2 [8], [9], wordt de werkzaamheid van deze biologisch gerichte therapieën niet bekend en er is een gebrek aan een standaard doelgerichte therapie voor maagkanker. Door de biologische heterogeniteit van maagkanker, is het onwaarschijnlijk dat er een wondermiddel genezen. Moleculaire merkers zullen dus belangrijk in de toekomst resultaten van patiënten en het afstemmen behandelingen volgens individuele biologie voorspellen.

In de zoektocht naar biomarkers, gen expressie signatuur analyse is gebruikt in diverse toepassingen, zoals voor het ophelderen van de mechanismen van biologische routes [10], rangschikken subtypes van een ziekte [11], het voorspellen van de prognose van kanker [12] en profilering genexpressie in reactie op specifieke middelen [13], [14]. Gen-expressie signatuur analyse kan worden gedaan met behulp van het Broad Institute Connectivity Map (http://www.broadinstitute.org/cmap). De Connectivity Kaart is bedoeld om een ​​kaart die genexpressie patronen geassocieerd met de ziekte om overeenkomstige patronen geproduceerd door kandidaat-geneesmiddelen en genetische manipulaties [15], [16] koppelt genereren. Deze systemen aanpak maakt het mogelijk verbindingen worden gescreend tegen genoombrede ziekte handtekeningen, in plaats van een vooraf geselecteerde set van target genen. Drugs zijn gekoppeld aan ziekten met behulp van geavanceerde patroon-matching methoden met een hoog niveau van resolutie en specificiteit. Hoewel het laat veel open vragen, heeft de Connectivity Kaart aangetoond dat genomische handtekening analyse kan worden gebruikt om drugs met gemeenschappelijke mechanismen van de acties te herkennen, ontdekken onbekende werkingsmechanismen en identificeren van potentiële nieuwe therapieën [15], [16].

het doel van dit onderzoek was om potentiële nieuwe therapieën identificeren voor de behandeling van maagkanker. Om dit te doen, moeten we eerst een analyse van de genomische handtekening van menselijke maagkanker. Het resulterende handtekening maag kanker gen werd vervolgens gebruikt in silico
door gebruik Connectivity kaartanalyse therapeutische middelen die potentieel effectief tegen deze vorm van kanker zou kunnen identificeren. We verder gevalideerd boven gericht geneesmiddel voor de werkzaamheid bij maagkanker cellijnen. Wij vonden dat vorinostat, als een potentieel nieuw medicijn, veroorzaakte zowel apoptose en autofagie bij maagkanker cellen. Samen studie toont aan dat de kaart Connectivity analyse kan worden gebruikt voor de identificatie van therapeutische middelen die succesvol kunnen zijn bij de behandeling van een subset van maagkanker.

Methods

Analyse van microarray data

Voor de Connectivity Map analyse, gebruikten we de microarray gegevens van 65 maagkanker patiënten, waarvan 65 kanker en 19 normale maag weefsels, die werden verkregen uit ons eerdere werk, Yonsei gegevens [17]. Tumor monsters werden verzameld van patiënten met maagkanker gastrectomie ondergaan als primaire behandeling. Weefselmonsters werden onderzocht door pathologen ten tijde van het verzamelen en opgeslagen bij -80 ° C in de weefselbank tot de start van het experiment. Totaal RNA werd uit de vers-bevroren weefsels geëxtraheerd met behulp van een RNA-isolatie Mirvana labeling kit (Ambion, Inc.). Primaire microarray data is beschikbaar in NCBI Gene Expression Omnibus openbare database (microarray platform, GPL6884; microarray data, GSE 13861). Een ander gen expressie profiel werd verkregen van 69 maag weefselmonsters, met inbegrip van 38 kanker en 31 niet-kanker stroma, van de Stanford Microarray Database (http://smd.stanford.edu, GSE13911), Stanford data. Maagkanker-specifieke genen werden geselecteerd door BRB-ArrayTools versie 3.6.1 (Biometric Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Class vergelijking met twee sample t-test (significantie < 0,001, 10.000 willekeurige permutatie) geïdentificeerd maagkanker specifieke genen en genen waarvan de expressie gemiddelde intensiteiten werden gewijzigd door ten minste twee-voudig in vergelijking met normaal weefsel genexpressie betekenen geselecteerd
.

Connectiviteit Map analyse

Om potentiële geneesmiddelen gericht maagkanker, het gen lijsten van de top 500 van de gereglementeerde en de top 500 naar beneden gereguleerde genen uit de maag kanker-specifieke genen werden gebruikt (Tabel S1) te identificeren. De Connectivity Map analyse werd uitgevoerd via de webinterface (http://www.broadinstitute.org/cmap) met behulp van versie, build 02, die meer dan 7.000 expressie profielen die effecten van 1309 verbindingen op verschillende gekweekte menselijke cellen [15] bevat, [16]. De Connectivity kaart toont functionele verbindingen tussen drugs, genen en ziekte. Geneesmiddelen die ziekte nabootsen gen handtekeningen te produceren kan helpen bij het identificeren van routes die potentiële therapeutische doelen vormen voor die ziekte. Omgekeerd, geneesmiddelen die een "omgekeerde" signature, d.w.z. veranderingen in genexpressie tegengesteld aan dat van de ziektetoestand induceren in een richting, kunnen vertegenwoordigen nieuwe therapeutische middelen. Kandidaat-middelen tegen een bepaalde ziekte kan worden herkend door het toepassen van ziekte-specifieke genexpressie profiel om het Connectivity Map analyse. We hebben gekozen voor kandidaat-medicijnen voor de validatie In vitro
op basis van de connectiviteit score, correlatie, en P-waarde.

Chemie en celcultuur

Vorinostat werd verkregen van Merck en bereid als een voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO). Chloroquine en bafilomycine A1 (Sigma) werden opgelost in respectievelijk water en DMSO. Menselijke maagkanker cellijnen AGS, NCI-N87 en KATO-III werden verkregen van de American Type Culture Collection en volgens hun aanbevelingen gehandhaafd. Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 100 U penicilline en 100 ug /ml streptomycine bij 37 ° C in 5% CO _2.

Celgroei, levensvatbaarheid en celcyclus assays

Voor de 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide (MTT) assay MTT werd opgelost in PBS bij 5 mg /ml. Ongeveer 5 x 10 ^{3 cellen gezaaid in 96-well platen en overnacht hechten. Het kweekmedium werd vervolgens vervangen door vers medium dat de aangegeven concentraties vorinostat of DMSO. Na 72 uur werd 20 ul MTT-oplossing toegevoegd en de platen werden gedurende 4 uur geïncubeerd bij 37 ° C. Na incubatie werd 100 pl DMSO toegevoegd aan het formazan op te lossen en de absorptie werd afgelezen bij 570 nm met een spectrofotometrische microplaatlezer (Vmax kinetische microplaat reader, Molecular Devices). De experimenten werden in drievoud uitgevoerd.}

Voor kristalviolet kleuring werden de cellen behandeld gedurende 12 uur werd het medium verwijderd en de cellen werden gewassen met PBS en daarna gedurende 30 minuten met 0,5% kristalviolet (in 20% methanol en 80% dubbel gedestilleerd water). De cellen werden daarna drie keer gewassen met PBS. De resterende kristalviolet werd in azijnzuur geëxtraheerd gedurende 5 min en de absorptie werd gemeten bij 595 nm met een spectrofotometer microplaat lezer.

levensvatbaarheid van de cellen te bepalen, werden cellen geïncubeerd met Vorinostat gedurende 72 uur. Hechtende cellen werden daarna losgemaakt van kweekplaten door behandeling met trypsine en samengevoegd met zwevende cellen gecentrifugeerd en gesuspendeerd in 500 ul propidiumjodide (PI) -exclusive oplossing (niet celmembraan penetrerend) gedurende 15 min bij 4 ° C. Gekleurde cellen werden gevolgd door flowcytometrie (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

Voor celcyclusanalyse werden de cellen geïncubeerd met Vorinostat gedurende 24 uur verzameld en gesuspendeerd in 500 pl hypotone oplossing (0,1% natriumcitraat, 0,1% Triton X-100, 100 ug /ml RNAse en 50 ug /ml PI) gedurende 15 min bij 4 ° C. -PI gekleurde cellen werden gevolgd door flowcytometrie. Celcyclus werd geanalyseerd door Multicycle software AV.

RNA-isolatie en microarray experimenten

RNA-isolatie en microarray experimenten werden uitgevoerd volgens het protocol zoals eerder beschreven [17]. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit maagkanker cellijnen met of zonder behandeling met een Vorinostat Mirvana RNA isolatie kit (Ambion, TX, USA). De integriteit van het grote RNA fractie werd bepaald met een Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, USA) als een surrogaat voor kwaliteitscontrole mRNA. Totaal RNA werd gemerkt en gehybridiseerd met humane HT12 v.3 expressie BeadChips volgens de protocollen van de fabrikant (Illumina, CA, USA). Na de BeadChips werden gescand met een Illumina BeadArray Reader werden de microarray gegevens worden genormaliseerd met de quantile normalisatiemethode in Linear Models for Microarray gegevenspakket in het R taalomgeving [18]. De expressie van elk gen werd getransformeerd in een logboek _{2 basis voor verdere analyse. Cluster analyse werd uitgevoerd met cluster en Treeview [19].}

Western blotanalyse

De cellen werden afgeschraapt in medium en gecentrifugeerd, en eiwitten werden geïsoleerd middels lysis buffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA en 10 mM natriumpyrofosfaat (pH 7,4)) bevattende 100 mM NaF, 10% glycerol, 1,5 mM MgCl _{2, 1% Triton X-100 en protease inhibitor (Roche). Extracten werden geïncubeerd op ijs gedurende 20 minuten en gecentrifugeerd bij 20.800 g gedurende 20 min. De eiwitconcentratie werd bepaald met BCA eiwit reagens (Pierce). Gelijke hoeveelheden eiwit uit elk monster werden gescheiden door elektroforese op SDS-PAGE en overgebracht naar Hybond-C Super membraan (Amersham Pharmacia Biotech). Membranen werden geblokkeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20 en 5% magere melkpoeder. Membranen werden overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met primair antilichaam verdund in 5% niet vette droge melk of 5% BSA in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing plus 0,1% Tween-20. Antilichamen tegen LC3 (Novus Biologicals), actief caspase-3 (Epitomics) en p62 (BD Biosciences) gebruikt. Antilichamen tegen a-tubuline en beclin-1 waren van Cell Signaling Technology; antilichaam tegen P-actine was van Sigma. Membranen werden vervolgens gewassen en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (Cell Signaling Technology). Eiwitbanden werden gevisualiseerd met verbeterde chemiluminescentie zoals beschreven door de fabrikant (GE Healthcare).}

siRNA transfectie

Het siRNA targetsequentie voor beclin-1, nontargeting siRNA (Risc Free) en Dharmafect 1 waren gekocht van Dharmacon. Cellen werden gezaaid in 10-cm schalen en getransfecteerd met siRNA 24 h later volgens het protocol van de fabrikant. De volgende dag werden de cellen getrypsiniseerd en uitgezet in 6-cm of 96-well platen met dezelfde transfectie-efficiëntie te verkrijgen. Eiwitexpressie werden bepaald door Western blotanalyse.

Transmissie elektronenmicroscopie

Monsters werden gefixeerd met een oplossing die 3% glutaaraldehyde plus 2% paraformaldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer, pH 7,3, gedurende 1 uur. Na fixatie werden de monsters gewassen en behandeld met 0,1% Millipore cacodylate gebufferde looizuur, gefixeerd met 1% gebufferde osmiumtetroxide gedurende 30 min, en gekleurd en bloc met 1% Millipore uranyl acetaat. De monsters werden gedehydrateerd in toenemende concentraties ethanol, geïnfiltreerd en ingebed in LX-112 medium. De monsters werden gepolymeriseerd in een 70 ° C oven gedurende 2 dagen. Ultradunne secties werden gesneden in een Leica Ultracut microtoom (Leica, Deerfield, IL), gekleurd met uranyl acetaat en leiden citraat in een Leica EM stainer, en onderzocht in een JEM 1010 transmissie-elektronenmicroscoop (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) bij een versnellend voltage van 80 kV. Digitale beelden werden verkregen met AMT Imaging System (Advanced Microscopietechnieken Corp., Danvers, MA).

Resultaten

handtekening Genexpressie van maagkanker

Tabel 1 geeft de karakteristieken van de patiënten uit Yonsei data [17]. Maagkanker werden meestal gevestigd in de distale maag en stadium III /IV. Met de genexpressie microarray gegevens van deze patiënten, vonden we 3360 tumorspecifieke genen waarvan de gemiddelde expressie intensiteiten werden gewijzigd door ten minste twee maal in vergelijking met normaal weefsel genexpressie betekenen ( P
< 0,001 figuur S1 ). Deze set van 3.360 genen (dwz maagkanker-specifieke handtekening) werd gebruikt voor verdere in silico
screening van potentiële therapeutische geneesmiddelen voor maagkanker.

Connectiviteit Map analyse identificeert potentiële geneesmiddelen gericht maagkanker

Om potentiële geneesmiddelen te identificeren gericht maagkanker, werd de maagkanker specifieke signatuur gebruikt als input zoekopdracht in Connectivity Kaart zoals beschreven in de sectie 'Methode'. We specifiek gezocht naar verbindingen die een handtekening omgekeerd gecorreleerd met de gastrische kankerspecifieke handtekening hadden en die meerdere geneesmiddelen zijn samengevat in Tabel 2. De ordening van kandidaat middelen werd vastgesteld op basis van omgekeerde correlatiewaarde en de p-waarde. Tabel 2 (kolommen 2-4) toont de hoogst gerangschikte verbindingen uit Yonsei data. Connectiviteit Map analyse bleek dat histondeacetylase (HDAC-remmers), met inbegrip van vorinostat en trichostatine A vertegenwoordigen potentiële kandidaten voor het richten van maagkanker. De fosfatidylinositol-3-kinase remmer LY294002, de fenothiazine trifluoperazine en de heat shock protein inhibitor tanespimycin werden ook geïdentificeerd als kandidaat doelwit agenten voor maagkanker. Vervolgens gevalideerde we onze bevindingen met behulp van een onafhankelijke set van genexpressie profiel data van Stanford Microarray Database (tabel 2, Stanford gegevens; kolommen 5-7). Connectivity Kaart analyse van deze dataset bevestigd vorinostat als de top gerangschikt kandidaat. Tot slot, Connectivity Kaart analyse geïdentificeerd vorinostat als een potentieel therapeutisch middel voor maagkanker.

Vorinostat toont therapeutische werkzaamheid In vitro
bij maagkanker cellijnen

Om de therapeutische evalueren werkzaamheid van Vorinostat, onderzochten we de groei van gevestigde maagkanker cellijnen (AGS, KATO III en NCI-N87) na 72 uur behandeling met Vorinostat MTT assay. In vergelijking met onbehandelde cellen, Vorinostat significant geremd cellevensvatbaarheid op een dosis-afhankelijke wijze aan maagkanker cellijnen (Figuur 1A). We bevestigden de vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen door de celcyclus analyse van AGS en KATO-III kankercellen. We toonden aan dat behandeling met Vorinostat (5 uM) gedurende 24 uur veroorzaakte een duidelijke toename van de sub-G1 hoeveelheid AGS cellen vergeleken met de controlegroep (2,3 ± 0,07% vs 39,2 ± 0,99%, respectievelijk P
<0,01), met vermelding van de inductie van celdood (Figuur 1B). In tegenstelling, de sub-G1 percentage vorinostat behandelde KATO III cellen werd niet beïnvloed (Figuur 1B), terwijl het aandeel van G2 /M-cellen significant verhoogd (21,4 ± 1,91% vs 29,3 ± 0,35%; P
= 0,044), indicatief voor het stoppen van de celcyclus. We verder cellevensvatbaarheid getest met PI-uitsluiting. We behandelden AGS en KATO III cellen met 5 uM Vorinostat voor 72 uur en beoordeeld nemen met flowcytometrie (Figuur 1C). De hoeveelheid dode cellen die lage voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing hoge hebben, was significant verhoogd in cellen AGS (12,4 ± 4,3% versus 79,4 ± 5,7%), en in KATO III cellen, vergeleken met controlecellen (8,7 ± 0,6% versus 46,8 ± 2,1%). We eindelijk analyseerden de inductie van apoptose na behandeling vorinostat AGS en KATO III maagkanker cellijnen middels immunoblot. Vorinostat verhoogde apoptose, zoals beoordeeld door caspase-3 splitsing in AGS cellen en in mindere mate in KATO III cellen (figuur 1D).

Samengevat geven deze gegevens aan dat Vorinostat antiproliferatieve effect op maagkanker cellijnen door het induceren van apoptose in AGS cellen en G2 /M celcyclus arrestatie in KATO III cellen.

Global genexpressie analyse van maagkanker cellijnen AGS en KATO-III na vorinostat behandeling

om het effect van vorinostat over globale genexpressie te analyseren, werden AGS en KATO III maagkanker cellen behandeld met 5 uM Vorinostat gedurende 48 uur en microarray-analyse werd uitgevoerd. Unsupervised cluster analyse van microarray gegevens na vorinostat behandeling toonden aan dat AGS en KATO-III cellen geclusterd met dezelfde cellijn, ongeacht om vorinostat behandeling (Figuur 2A). Omdat autophagy is vermeld dat een rol-vorinostat geïnduceerde effecten bij andere vormen van kanker [20] hebben, [21], voerden we toezicht analyse van de autofagie gerelateerde genreeks (80 genen en sondes 149, tabel S2). -Vorinostat behandelde maagkanker cellijnen werden geclusterd (Figuur 2B), wat aangeeft dat de inductie van autofagie is een belangrijke eigenschap van vorinostat bij maagkanker lijnen.

Remming van autofagie verbetert vorinostat werkzaamheid bij maagkanker cellen

Aangezien autofagie een rol in zowel kankercellen overleving en kanker celdood na behandeling met geneesmiddelen [22] kan hebben, [23], we verder geëvalueerd de bijdrage van deze werkwijze om het effect van vorinostat op maagkanker cellijnen. We functioneel geëvalueerd dit proces door immunoblot analyse van de autofagie marker microtubule-geassocieerd eiwit 1 lichte keten 3 (LC3). Vorinostat behandelde KATO III cellen en in mindere mate AGS cellen, toonde een duidelijke accumulatie van de sneller migrerende gelipideerde vorm van LC3 (LC3-II) (Figuur 3A). Accumulatie van LC3-II kan aan beide opregulatie van autophagosome vorming of geblokkeerde autofagocytische afbraak van LC3-II [24], [25]. Daarom geanalyseerd Vorinostat-behandelde cellen voor p62 degradatie, een marker van autofagocytische flux [24], en zagen we een verlaging van p62 eiwitniveaus in Vorinostat behandelde cellen in vergelijking met de tijd in overeenstemming waren onbehandelde kankercellen (figuur 3A). Bovendien gelijktijdige behandeling van vorinostat met bafilomycine A1 (BafA1), een remmer van autophagosome-lysosoom fusie verder verhoogd LC3-II accumulatie (Figuur 3B), geschikt Vorinostat induceren autofagocytische flux plaats van het blokkeren van de afbrekende capaciteit van autophagolysomes. Elektronenmicroscopie (EM) is een gevoelige en kwantitatieve definitieve detectiemethode voor autofagie [24]. Consistent met de western blot gegevens, EM analyse toonde dat Vorinostat duidelijk verhoogde autophagosome formatie AGS cellen (Figuur 4B en B) in vergelijking met cellen (figuur 4A en een controlegroep).

Om te onderzoeken of de accumulatie van autofagosomen beschermt de cellen tegen de cellulaire stress opgewekt door vorinostat, we remde de autofagie proces met behulp van de farmacologische inhibitor chloroquine en kleine interfererende RNA (siRNA) tegen beclin-1. Toevoeging van chloroquine naar Vorinostat behandelde AGS en KATO III cellen resulteerde in een dosis-afhankelijke afname in levensvatbaarheid (figuur 5A). De vermindering in levensvatbaarheid werd bevestigd in KATO III cellen behandeld met beclin-1 siRNA (figuur 5B). Samen suggereren de gegevens dat remming van vorinostat geïnduceerde autofagie de werkzaamheid van vorinostat behandeling van maagkanker cellen verbeteren.

Vorinostat verandert gen handtekening in menselijke maagkanker cellen

Om de effecten van begrijpen Vorinostat op genexpressie bij maagkanker cellijnen, voerden we microarray analyse vorinostat behandelde AGS en KATO III maagkanker cellijnen (Fig. 2). Onze analyse toonde significante genomische verschillen tussen de onbehandelde en vorinostat behandelde maagkanker cellen (AGS en KATO-III). Na Vorinostat behandeling, werd de expressie van 1014 genen verhoogd en de expressie van 760 genen was verlaagd bij de AGS cellijn. In KATO-III-cellijn, 164 genen waren en 191 genen werden naar beneden gereguleerd (twee-voudig verschil; P Restaurant < 0,001). Vorinostat ingrijpend veranderd de expressie van 140 genen in zowel AGS en KATO-III cellijnen (vorinostat specifiek gen handtekening). De genen die werden het meest veranderd na vorinostat behandeling werden geïdentificeerd als SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PrPh, NEU1, TXNIP, CCK
(> 4-voudig up -Verordening) en MUC1, IFITM1, ANKRD37
(>. 4-voudige neerwaartse regulering)

Vervolgens wilden we biomarker kandidaten die vorinostat gevoeligheid van menselijke maagkanker patiënten kunnen voorspellen identificeren . Daarom combineerden we de set van gewijzigde genen in Vorinostat behandelde maagkanker cellijnen (Vorinostat specifiek gen handtekening) en de twee menselijke maagkanker handtekeningen gegenereerd uit de Yosei en Stanford gegevens met behulp Venn diagram analyse. We vonden dat de relatieve expressieniveaus van 12 genen werden omgekeerd door Vorinostat behandeling (Figuur 6). Van deze 12 genen, 7 genen die hoog tot expressie in maagkanker weefsels werden down-gereguleerd ( ITGB5
, tyms
, MYB
, APOC1
, CBX5
, PLA2G2A
, KIF20A
) en 5 low-uitgedrukte genen waren up-gereguleerd na vorinostat behandeling ( SCGB2A1
, TCN1
, CFD
, APLP1
, NQO1
(tabel 3).

Discussie

Onze resultaten geven aan dat een globale handtekening menselijke maagkanker gen kan nuttig zijn om therapeutische middelen die eerder gericht op de genomische handtekening van maagkanker in plaats van gericht een of twee specifieke genen te vinden. de Connectivity kaart, vonden we dat HDAC-inhibitoren, zoals Vorinostat en trichostatine A, had een omgekeerde correlatie gen handtekening vergelijking met maagkanker specifieke gen handtekening en kunnen daarom leiden therapeutische kandidaten voor maagkanker. In vitro
evaluatie van de therapeutische werkzaamheid van vorinostat gebleken dat deze therapeutisch geneesmiddel onderdrukte groei van verschillende maagkanker cel lijnen. Naast de antiproliferatieve effecten, vorinostat opgereguleerd ook autofagie-specifieke genen. Remming van vorinostat geïnduceerde autofagie resulteerde in een verdere vermindering van de levensvatbaarheid. Bovendien gecombineerde analyse van maagkanker cellijnen behandeld met Vorinostat en monsters van maagkanker patiënten toonde dat Vorinostat veranderde de expressie van een set van twaalf maagkanker specifieke genen.

De resultaten toonden aan dat HDAC-inhibitoren, en vorinostat trichostatine A, waren de hoogste therapeutische kandidaten voor maagkanker, die overeenstemt met de HDAC concept dat tot overexpressie wordt gebracht bij maagkanker weefsels [26]. HDAC-remmers is aangetoond dat acetylering van histonen verhogen derhalve genexpressie beïnvloeden. Deze remmers manifest antikanker effecten door het induceren van de intrinsieke en extrinsieke apoptose pathway [27], [28], blokkeert tumorangiogenese [29], en inhiberen intracellulaire stressrespons routes [30]. Omdat HDAC remmers algemene effecten op genexpressie, kunnen zij invloed over nog niet geopenbaarde celprocessen [31], [32]. In een klinische context, zijn HDAC-remmers zijn meestal toegepast op hematologische maligniteiten, maar klinische proeven in vaste tumoren zijn gaande. Een recente studie, het ondersteunen van onze In vitro
bevindingen bleek therapeutische werkzaamheid van HDAC-remmers op de menselijke maagkanker monsters door het gebruik van de drug histologische respons test [33]. Het blijft echter unrevealed of specifieke moleculaire gedefinieerde subgroepen respons of resistentie tegen HDAC inhibitoren voorspellen zijn. Daarnaast is de toepassing van potentieel bruikbare biomarkers heeft nog steeds een aantal beperkingen [34].

De Connectivity Kaart blijft moeilijk te beoordelen, totdat we de mate kunnen beoordelen in welke genomische handtekeningen afkomstig van In vitro
experimenten recapituleren de complexiteit van de ziekte bij de mens. Hoewel de Connectivity kaart bevat meer dan 7000 expressie profielen die 1309 verbindingen, haar aanpak nog steeds bezig met een aantal beperkingen, zoals de beperkte hoeveelheid cellijn data (MCF7, PC3, etc) en de onwetendheid van micro-omgeving invloeden van het menselijk lichaam [16] . Bovendien kan genexpressieprofielen afkomstig van de behandeling van gekweekte humane cellen niet worden gecorreleerd met In vivo
antikankereffect, vanwege de complexiteit van kanker. Bovendien is de invoer van slechts een beperkt aantal genen toegelaten, die al bias verkregen resultaten. Toekomstige studies moeten worden aangepakt of onze resultaten verkregen door middel van cmap analyse kan worden bevestigd in een In vivo
maagkanker model. Ondanks deze beperkingen Connectivity kaartanalyse een potentieel nuttige methode om nieuwe functies geneesmiddelen, waaronder vorinostat, reeds in kliniek voor andere doeleinden.

In vitro
evaluatie van de therapeutische werkzaamheid van vorinostat op maagkanker cellijnen bleek dat deze therapeutisch geneesmiddel vertoonde een antiproliferatief effect bij fysiologische relevante doses (5 uM) compatibel met andere publicaties: IC _{50 AGS en KATO-III is aangetoond dat respectievelijk 2,9 pM en 5,9 pM [ ,,,0],35]. Analyse van de celcyclus (Figuur 1B) cellevensvatbaarheid en (figuur 1C) apoptotische responsen (figuur 1D) gaf aan dat de effecten van vorinostat tonen een discrepantie in verschillende maagkanker cellijnen apoptose in AGS cellen en G2 /M arrestatie in KATO -III cellen. Het verschil in genetische /mutatie achtergrond van de cellijnen kan verantwoordelijk zijn voor het verschil.}

Microarray genexpressie analyse waarbij Vorinostat-behandelde en onbehandelde maagkanker cellijnen gaf aan dat dit geneesmiddel geïnduceerde autofagie, hetgeen in overeenstemming met eerdere rapporten in andere kankercellijnen [20], [21]. Aangezien zowel inductie en inhibitie van autofagie kan therapeutische voordelen hebben [22], [23], we verder geëvalueerd de rol van autofagie in maagkanker cellen na vorinostat behandeling. Remmen autofagie met een bekende antimalarial drug, chloroquine [21] en het gebruik van siRNA tegen beclin-1 resulteerde in een afname van de levensvatbaarheid van maagkanker cellijnen in aanwezigheid van vorinostat suggereert autofagie wordt geactiveerd als een beschermende overlevingsreactie na vorinostat behandeling (Figuur 5). Zo combineren antikanker middelen zoals vorinostat en remmers van autofagie kan een therapeutisch voordeel bieden in de strijd tegen maagkanker.

Om een ​​vorinostat geïnduceerde handtekening gen te identificeren, evalueerden we de genexpressie profielen van AGS en KATO-III cel regels na vorinostat behandeling. De expressie van 1774 en 355 genen werd omgekeerd (>, 2-voudig, p < 0,001) in AGS en KATO III-cellijnen, respectievelijk. Dit suggereert dat de AGS cellijn kwetsbaarder dan KATO III-vorinostat behandeling ten opzichte van genexpressie. Deze manifestatie kan de gevoeligheid van cellen voor AGS vorinostat leggen. We ontdekten dat vorinostat ingrijpend veranderd de expressie van een set van 140 genen in zowel AGS en KATO-III cellijnen.

• PLoS ONE: De prognostische betekenis van apoptose-gerelateerde biologische merkers in het Chinees MaagKanker Patients
• PLoS ONE: Gene Expression-Signatures kan onderscheiden maagkanker kwaliteiten en Stages