PLoS ONE: MicroRNA-10A žemyn reguliuojama DNR metilinimo ir funkcionuoja kaip auglio slopinamojo skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

Fonas

mikro RNR veikia kaip posttranscriptional reguliuojančių genų ekspresijos daugelyje biologinių procesų. Jų deregulations pasitaiko dažniausiai skrandžio vėžiu (GC). Nors DNR metilinimas yra svarbus mechanizmas MicroRNA dereguliavimo vėžiu, šis laukas labai lieka neištirta.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Viso RNR buvo išskirta iš 100 pacientų audinių su GC ir keturių skrandžio vėžio ląstelių linijos. Ekspresijos lygis miR-10a buvo nustatomas pagal realaus laiko PGR su konkrečių TaqMan zondų. Be to, buvo atliktas funkcinės analizės miR-10a reguliuojant ląstelių dauginimosi, migracijos ir invazija. Vėliau, kiekybinis metilinimas konkrečių PGR (qMSP) buvo naudojamas aptikti DNR metilinimo statusą CpG salos prieš srovę nuo Pasaulis-10a
. Šiame tyrime mes nustatėme, kad miR-10a išraiška GC ląstelių buvo mažesnis negu normalios ląstelės, kurios buvo dėl to, kad CpG salos prieš srovę nuo Pasaulis-10a
hypermethylation. Mes taip pat patvirtinta, kad šiek tiek mažesnę raišką PPN-10a GC audinių nei jų gretimų ne navikinių audinių 100 GC pacientų ir patvirtino CpG salos prieš srovę Pasaulis-10a
kai kuriems pacientams hypermethylation. Be to, iš naujo diegti miR-10a į GC ląstelių galėjo slopinti ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija. Bioinformatikos ir Imunoblotingas nurodė, kad navikas slopintuvas vaidmenys PPN-10a GC ląstelės buvo galbūt nukreipti HOXA1.

Išvados /Reikšmė

Mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-10a veikia kaip naviko slopintuvas GC ląstelėse ir yra dalinai nutildė DNR hypermethylation GC, o tai rodo, kad Pasaulis-10a gali tarnauti kaip potencialus diagnostinį ar terapinį tikslą GC

nurodomoji dalis:. Jia o Zhang Z Zou d Wang B yan Y, Lo, M, ir kt., (2014) MicroRNA-10A žemyn reguliuojama DNR metilinimo ir funkcionuoja kaip auglio slopinamojo skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 9 (1): e88057. Doi: 10,1371 /journal.pone.0088057

redaktorius: Jorg Tost CEA - Institut de Genomique, Prancūzija

Įstojo: sausio 26, 2013; Priėmė 4 January 2014 m Paskelbta 31 sausio 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Jia et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (2011, 91129716, į JY), Pekino savivaldybės Science & Technologijos Komisija (2010B071, kad J.Y.) institutas, pagrindinės medicinos mokslų, kinų medicinos mokslų akademijos (2009RC03, kad J.Y .; 2010PYB06, kad J.Y .; 2012G04, kad J.Y.). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra antra dažniausia mirties nuo vėžio [1] visame pasaulyje. Iki šiol kelios naviko slopintuvas genų ir naviko susijusių genų buvo pranešta apie GC. Nors nebuvo atlikta išsamių tyrimų nustatyti genetinius kelius ir dalyvauja vėžio vystymosi mechanizmus, kurie buvo pagaminti keli patobulinimai dėl anksti diagnozuoti vėžį. Mikro RNR (miRNAs) yra endogeninių mažų ne kodavimo RNR, kurios buvo nustatytos kaip posttranscriptional reguliuojančių genų ekspresiją. Ankstesni tyrimai parodė, kad miRNAs daryti savo funkcijas per netobulos bazinių Kergimas su 3'untranslated regione (3'UTR) tikslinių mRNR [2] ir miRNAs buvo plačiai tiriamas ląstelių ciklo reguliavimo, diferenciacija, plėtros ir apoptozės kontekste [3], [4]. Sukaupta įrodymų matyti, kad miRNAs yra nereguliuojama įvairių ligų, ypač vėžį. Pavyzdžiui, PPN-216B yra labai žemyn reguliuojama nosiaryklės karcinomą [4]; Pasaulis-340 yra nereguliuojama krūties vėžio ir gali slopinti krūties vėžio ląstelių migraciją ir invazija [5]; ir miR-31 buvo identifikuojamas kaip į stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma [6] onkogeno. Kartu paėmus, miRNAs buvo nustatyti kaip potencialūs kandidatai į naujus diagnostikos biologinių žymenų ar terapinių tikslų vėžio.

MIR-10a buvo pranešta vaidina svarbų vaidmenį į genezė ir raida žmogiškųjų vėžio įvairovė. Pavyzdžiui, miR-10a yra nebereguliuojamos galvos ir kaklo suragėjusių ląstelių karcinomos, o taip pat kepenų ląstelių karcinoma [7], [8]. Be to, gimdos kaklelio vėžio, miR-10a tarnauja kaip kontroliuojant CHL1 onkogeno [9]; žemyn reguliavimo PPN-10a lėtinės mieloleukemijos skatina CD34 ^{+ ląstelių proliferaciją [10]. Tačiau miR-10a funkcija ir mechanizmo, lemiančio skrandžio Kancerogeninis lieka neaiški. Šiame tyrime mes tiksliai išmatavo PPN-10a išraišką 100 pacientų, sergančių skrandžio vėžiu ir tyrė PPN-10a vaidmenis skrandžio vėžio ląsteles. Mes nustatėme, kad Pasaulis-10a buvo žemyn reguliuojama GC audinių ir vykdomi išraišką PPN-10a represuoti į dauginimosi, migracijos ir invazija GC ląsteles.}

Epigenetiniai modifikacijos įskaitant DNR hypermethylation, Histonas deacetilinant ir Histonas metilinimo yra glaudžiai susijęs su genų nukenksminimą. Rėmėjas hypermethylation Manoma, kad alternatyvų mechanizmą žemyn reguliuoti auglio slopinamojo genų žmogaus vėžio [11]. MiRNAs kurio išraiška yra represuoti DNR metilinimo buvo pranešta apie keletą žmogaus vėžio [12] - [14]. Toliau tirti, ar žemyn reguliavimas miR-10a kilęs iš genomo regione aukštyn nuo hypermethylation Pasaulis-10a
, mes išanalizavo DNR metilinimas CpG sala promotoriaus regione miR- 10a
55 GC pacientų ir nustatė, kad žemyn reguliavimo PPN-10a GC audiniuose gali būti dėl to, kad CpG sekas hypermethylation jo rengėjas.

medžiagos ir metodai

pacientams ir mėginiai

Žmogaus klinikiniai mėginiai buvo imami iš chirurginio egzempliorių iš 100 pacientų, sergančių GC prie vėžio instituto ir ligoninė, Kinijos medicinos mokslų akademijos, General Hospital Liaudies išlaisvinimo armijos ir Shanxi vėžio ligoninėje. Atitinkami gretimų ne neoplastinių audinius nuo makroskopiniame naviko skirtumą buvo išskirti tuo pačiu metu ir naudojamas kaip kontrolės. Navikai buvo pastatytas pagal TNM (2010) klasifikavimo kriterijus Sąjungos Tarptautinės vėžio kontrolės (UICC). Visi mėginiai buvo padalintas į dvi dalis ir buvo nedelsiant spragtelėjimu, užšaldomos skystame azoto ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol RNR ekstrakcijos. Keturi skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC-27, MSV-803, SGC-7901 ir MKN-45) visi buvo išsaugojęs mūsų laboratorijoje ir prižiūrimi DMEM arba 1640 su 10% FBS. Klinikinių tyrimų etikos komitetas instituto pagrindinės medicinos mokslų, kinų medicinos mokslų akademijos patvirtintas mokslinių tyrimų protokolus ir raštu informuoti sutikimas buvo gautas iš dalyvių.

RNR gavyba, kDNR sintezė mRNR ir miRNAs ir tikruoju laiko PGR

viso RNR buvo išskirta iš skrandžio vėžio audinių ir ląstelių, naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. RNR buvo įvertintas, absorbciją prie 260 nm ir kDNR buvo susintetintas M-MLV atvirkštinės transkriptazės (Invitrogen) iš 2 mikrogramai visos RNR. Oligo (dT) 18 buvo naudojami kaip RT pradmenis, atvirkštinės transkripcijos iRNR. Kamieninių kilpa VK gruntas buvo naudojamas atvirkštinės transkripcijos iš mirna. Kiekybinė PGR buvo atliekama Bio-Rad CFX96 realiojo laiko PGR sistema (Bio-Rad, CA, JAV), naudojant SYBR Pašaro ex Taq Kit (Takara Dalian, Kinija) arba TaqMan zondai (Applied Biosystems, Foster City, CA , JAV) pagal gamintojo nurodymus. PGR sąlygos buvo taip: 95 ° C temperatūroje 30 s, o po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 5 s ir 60 ° C temperatūroje 34 s. Už mRNR, duomenys buvo normalizuoti naudojant vidinį GAPDH kontrolę. Dėl miRNAs, U6 snRNA buvo naudojamas kaip endogeninio kontrolę. Santykinis miR-10a buvo matuojamas su 2 ^{-ΔΔCT metodu. Gruntas sekos pateikiamos S1 lentelėje.}

DNR ekstrakcijai, Metilinimas konkrečius PGR (JEP) ir kiekybinė Metilinimas konkrečius PGR (qMSP)

Didelės molekulinės masės genomo DNR buvo išskirta iš skrandžio vėžio audiniuose naudojant DNR išskyrimo rinkinys (BIOMED BJ, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Bisulfite modifikacija buvo atlikta naudojant Epitect bisulfite sekvenavimo komplektas (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal protokolą. Iki 2 mikrogramai genominės DNR buvo naudojamas kaip pradinės vaistinės medžiagos. Normalus limfocitų DNR gydomi CpG metiltransferazės (M.SssI) (NVUI, MA, JAV) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, ir reakcija sistema be jokių šabloną buvo naudojamas kaip kontrolinis variantas.

natrio bisulfate- elgiamasi DNR buvo papildyta naudojant Bio-Rad CFX96 realaus laiko PGR sistema (Bio-Rad), naudodami KAPA SYBR® GREITAS qPCR rinkiniai (Kapa BIOSYSTEMS) su šių sąlygų: 95 ° C temperatūroje 5 min po 40 ciklų 95 ° C 30 S, 54 ° C temperatūroje 30 s ir 72 ° C temperatūroje 30 s, ir paskutinį kartą pratęsti 72 ° C temperatūroje 10 min. GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. qMSP reakcijos buvo pakartotas tris kartus. Metilinimo lygis mėginyje buvo apskaičiuota kaip Lu L et al. aprašytas [15]. Gruntas sekos pateikiamos S1 lentelėje.

5-aza-2'-deoxyazacytidine Gydymo

skrandžio vėžio ląstelės buvo pasėjamos 10 cm patiekalų (1 × 10 ^{6 ląstelės per patiekalas) vieną dieną prieš gydymą nuo priklausomybės narkotikams. Ląstelės buvo gydomi 1 pM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-aza) (Sigma, MO, JAV) kiekvienas 24 val 3 dienas.}

ląstelių kultūroje, Oligonukleotidai transfekciją

žmogaus skrandžio ląstelių linijos HGC-27, SGC-7901 ir MKN-45 buvo auginamos RPMI 1640 (Lanksčiai, BRL, UK) žiniasklaidos papildyti su 10% vaisiaus galvijų serumo ir MSV-803 buvo išlaikytas DMEM (Gibco, BRL , Jungtinė Karalystė), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo. Šios ląstelių linijos buvo palaikoma 37 ° C drėkinamame oru, kuriame yra 5% CO _2.

Mir-10a mimikos, The peštynės mimikos, siHOXA1 siRNA ir kepti plaktą siRNR buvo sintetinamas GenePharma (Šanchajus, Kinija ) ir transfekuota į ląsteles, kurio galutinė koncentracija 50 nmol /L, naudojant DharmaFECT1 reagentas (Dharmacon, TX, JAV).

ląstelių proliferaciją ir kolonija formavimas Analizės

mimic- arba siRNA- transfekuotos ląstelės buvo pasėjamos į 96-duobučių lėkštelėse (5000 ląstelių /gerai). Ląstelės buvo inkubuotos su 10% CCK-8 (DOJINDO, Japonija), esant 37 ° C temperatūroje, kol vaizdo spalva, kai įvyko konversija. Platinimu normos buvo nustatomos ne 0, 12, 24, 48, 72, 96 valandos po transfekciją.

mimikos-perkeltų ląstelės buvo tripsinizuojamos ir replated 200 ląstelių viename gerai 6-duobučių lėkštelėse ir prižiūrimi 1640 su 10% FBS. Ląstelės buvo auginamos 7 dienas, fiksuojami metanoliu ir tamsintas su 0,1% violetinei 20% metanolio 15 min.

Mobilaus ryšio Apoptozę Analizės

apoptozę tyrimai buvo atliekami HGC-27 ir MSV-803 ląstelių linijas, naudojant aneksinu-FITC Apoptozę nustatymo rinkinys I (BD biomokslų) pagal gamintojo protokolą ir tada ištirtų Calibur tėkmės citometre (Becton Dickinson).

Mobilusis Migracija ir invazija Bandymai

žaizdų gijimo tyrimas buvo atliktas siekiant įvertinti ląstelių migraciją. Dirbtinis žaizda buvo sukurtas ant susiliejantis ląstelių monosluoksnio be FBS naudojant 200 iL pipetės galiuką 24 valandas po transfekciją. Vizualizuoti migruoja ląsteles ir žaizdų gijimą, foto darytos 0, 12, 24, 36, 48, 60 valandų.

Dėl transwell invazija tyrimus, HGC-27 ir MGC-803 ląstelių sustabdytas 0,2 ml RPMI 1640 arba DMEM be FBS buvo pateikti į viršų kameroje kiekvieno įdėklu (Millipore, MA, JAV) precoated 40 įxL 1 mg /ml Matrigel. Apatinė kamera prisipildė 600 įxL RPMI 1640 ar DMEM terpėje su 10% FBS kaip mitybos jauką. po 24 valandų, invazijos ląstelės, pridedamus prie apatinio paviršiaus buvo nustatytas 20% metanolio ir tamsintas su gegužės-Gruwald-Giemsa (MGG). tada Membranos buvo iškirpti ir įterpti pagal motyvacinius lapeliai. Ląstelės trijų skirtingų laukų svarbu buvo skaičiuojamas, ir visi tyrimai atliekami buvo pakartotas tris kartus.

Imunoblotingo

Western blot analizė buvo atlikta pagal standartines metodikas. Baltymai buvo atskirti 10% SDS-PAGE ir tada perkelti į PVDF membranų (Amersham, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė). Membranos buvo užblokuotas per naktį 5% neriebalinės sausas pienas ir inkubuojama 2 h su anti-HOXA1 antikūnų (Bioworld, MN, JAV) ne 1:500 skiedinių arba anti-GAPDH antikūnų (Proteintech, Čikaga, JAV) ne 1: 50000 skiedinius. Po plovimo su TBST (10 mM Tris, pH 8.0, 150 mm NaCl ir 0,1% Tween20), Membranos buvo inkubuojami 2 h su antriniais antikūnais (zsgb-bio, Pekinas, Kinija).

Statistika

Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent tris kartus. Studento t testas (du-tailed) ir x ^{2 testas buvo atliktas, ir statistinis reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip alfa = 0,05 (dviejų pusių). Į ± SD priemonė rodomi skaičiai.}

Rezultatai

Pasaulis-10a žemyn reguliuojama skrandžio vėžio ląstelių

Mes išnagrinėjome brandžios miR-10a išraišką keturi žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC-27, MSV-803, SGC-7901 ir MKN-45) ir žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linija (GES). Sąvoka lygis miR-10a per GES buvo reikšmingai didesnis nei dviejose skrandžio vėžio ląstelių linijų (HGC-27 ir MSV-803) lygio ir buvo ne labai, bet observably didesnis nei kitų dviejų skrandžio vėžio ląstelių linijų lygių (MKN-45 ir SGC-7901) (1 pav.). Šie duomenys rodo, kad žemyn reguliavimas miR-10a, gali būti susiję su genezė ir raida GC.

Apie miR-10a išraiška klinikinės GC pacientams ir jų koreliacija su klinikos Info

toliau studijuoti tarp miR-10a ir GC genezės santykius, mes nustatėme, kad PPN-10a iš 100 klinikinių pacientų ekspresiją TaqMan zondas gautas realaus laiko PGR, kaip aprašyta aukščiau. Iš 100 porų GC mėginių, miR-10a išraiška buvo žemyn reguliuojama 58 atvejais (58/100, 58%), palyginti su atitinkamais gretimuose audiniuose (Fig. 1b). Apskritai, miR-10a išraiška buvo žemyn reguliuojama GC audinių, palyginti su gretimų audinių, nors žemyn reguliavimas nebuvo statistiškai reikšmingas (p = 0,148, suporuotas T-testas, du-tailed) (pav. 1c).

Norint įvertinti tarp miR-10a išraiškos ir klinikos charakteristikų koreliaciją, pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes pagal santykinį išraiška miR-10a vėžiu audinių metu pagal iš anksto paskelbtą popieriaus [16] , Kaip parodyta S2 lentelėje, statistiškai reikšmingas ryšys buvo pastebėtas tarp dviejų TNM grupių. Yra daugiau pacientų, kurie yra I + II etapą grupės su mažesniu išraiškos PPN-10a jų GC audiniuose. Šis ryšys rodo, kad Pasaulis-10a gali būti svarbesnis ankstyvą vėžio kancerogenezėje. Tačiau mūsų duomenys rodo, kad pasakymas lygis miR-10a neturėjo koreliacija su amžiumi, lytimi, histologinio tipo, naviko procentais, venų invazijos, nervų invazijos, pareigos, BORRMANN rašyti, PT etape PN etape arba PM etape.

Pasaulis-10a Slopina ląstelių proliferaciją in vitro

Jei tyrinėti PPN-10a skrandžio kancerogenezėje vaidmenį, mes perkeltų Pasaulis-10a imituoti į GC ląstelių linijų HGC-27 ir MGC-803, kurie abu eksponuojama aukštą transfekciją efektyvumą (Fig. 2a). Kaip matyti iš CCK-8 augimo tyrimų 0, 1, 2, 3 ir 4 dienų po to, kai mimika transfekciją, raiškos miR-10a sumažintas ląstelių proliferaciją in abiejų ląstelių linijų, kadangi užsikeberioti kartojančius neturėjo jokio poveikio ląstelių proliferacijos poveikį, palyginti su kai nedengtų ląstelių (Fig. 2b). Vėliau kolonija formavimo tyrimai buvo atlikti siekiant įvertinti dauginimosi gebėjimas mimikos-perkeltų HGC-27 ir MSV-803 ląstelių ir parodė, kad padidėjusi miR-10a ir HGC-27 ląstelių sumažintas kolonija formavimas (. 2c pav). Tačiau nė vienas iš MSV-803 ląstelių susidaro kolonijos, kurios gali būti dėl to, elementai "gana silpna laikymusi. Toliau spręsti PPN-10a poveikį ląstelių apoptozę dviejų GC ląstelių linijų, ankstyvo apoptozę MGC-803 ir HGC-27 ląstelių buvo nagrinėjamas aneksinu dažymą po Pasaulis-10a mnemo transfekciją. Kaip ir tikėtasi, keletą anksti apoptozinių ląsteles (20,8% visų HGC-27 ir 22,9% visų MGC-803) buvo aptikta plaktai mimikos gydytų ląsteles, tuo tarpu PPN-10a imituoja gydymą padidino ankstyvųjų apoptozinių ląstelių procentas (28,4% į HGC -27 ir 27,7% visų MGC-803) (pav. 2d). Apibendrinant, mes padarė išvadą, kad Pasaulis-10a gali slopinti ląstelių išgyvenamumą GC ląstelių skatinančius ląstelių apoptozę.

Pasaulis-10a slopina ląstelių migracija ir invazija in vitro

toliau įvertino PPN-10a poveikį ląstelių migracijos ir invazija, kurie buvo pagrindiniai veiksniai piktybinės ligos progresavimo ir metastazių. Migracijos gebėjimas buvo įrodyta žaizdų gijimas /įbrėžimams testą HGC-27 ir MSV-803 ląstelių. Abu ląstelių linijų gydomiems Pasaulis-10a mimikos buvo savitai mažiau migracijos nei gydomi peštynės kontrolės ar negydytų ląstelių po 12, 24, ir 36 valandas po braižymo (pav 3a.). Be to, mes atlikome Matrigel ląstelių invazija tyrimą ir tamsintas su įsiveržė ląsteles matuoti krypties invazija gebėjimus ląstelių po ectopically išreikšti MIR-10a per du ląstelių linijų. Ląstelių transfektuotose Pasaulis-10a Mimic invazyvumas buvo smarkiai sumažėjo, palyginti su peštynės kontrolės ir negydytų ląstelių (pav. 3b). Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-10a suvaidino svarbų vaidmenį reguliuojant ląstelių migraciją ir invaziškumo GC ir pasiūlė, kad žemyn reguliavimas miR-10a galėtų prisidėti prie naviko metastazių skrandžio kancerogenezėje.

Pasaulis-10a tikslai HOXA1 į GC

miRNAs atlikti biologines funkcijas per neigiamai reguliuoti savo tikslinę genus. Ji buvo pastebėta, kad onkogeno HOXA1 yra tiesioginė tikslinė miR-10a į megakariocitopezės ir žmogaus kasos vėžio [17] - [19]. Kaip prognozavo PicTar, ten buvo papildo seka tarp turi-miR-10a ir HOXA1 3'UTR srities (pav. 4a). Tačiau kol kas nežinoma, ar Pasaulis-10a reguliuoja ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija į GC nukreipiant HOXA1. Paaiškinti savo reguliavimo santykį, mes pirmą kartą aptikta baltymų ir iRNR lygius HOXA1 į Pasaulis-10a mimikos-perkeltų HGC-27 ir MSV-803 ląstelių Imunoblotingo metodu ir RT-PGR. Mes pastebėti akivaizdų sumažėjimą HOXA1 baltymų lygio, dalyvaujant PPN-10a imituoja palyginti su peštynės kontrolės dviejų ląstelių (pav. 4b). MRNR lygis HOXA1 taip pat buvo žemyn reguliuojama HGC-27 ląstelių, o tai rodo, kad Pasaulis-10a slopina HOXA1 išraišką žeminantis mRNR iš HOXA1 į HGC-27 ląstelių. Tačiau buvo mažai pakeitimas į iRNR lygio HOXA1 į MSV-803 ląstelių, o tai rodo, kad Pasaulis-10a galėtų žemyn reguliuoti HOXA1 išraišką per pritaikymo represijų, bet ne iRNR skilimo į MSV-803 ląstelių (pav. 4c). Be to, mes išanalizavo baltymų lygius HOXA1 24 GC pacientams. Tarp šių mėginių, buvo 12 pacientai, kuriems Pasaulis-10a buvo žemyn reglamentuojami jų GC audinių ir 12 pacientų, kuriems Pasaulis-10a buvo iki-reguliuojami jų GC audinių (pav. 4d). HOXA1 buvo iki reguliuojama daugumoje pacientams, kuriems Pasaulis-10a buvo žemyn reguliuojamų jų GC audiniuose. Panašiai HOXA1 buvo žemyn reguliuojama dauguma pacientų, kuriems Pasaulis-10a buvo iki reguliuojamų jų GC audiniuose. Iš Pasaulis-10a lygių ir baltymingų lygių HOXA1 GC palyginimas atskleidė atvirkštinė koreliacija tarp miR-10a ir HOXA1 (R ^{2 = 0,1839, p = 0,0366) (pav. 4e). Apibendrinant, šios išvados suteikti tvirtą įrodymų, kad HOXA1 yra tiesioginė tikslinė miR-10a GC. Mes taip pat nustatė lygis mRNR HOXA1 šiems pacientams ir pastebėta, kad lygis mRNR HOXA1 keliose pacientams buvo nesuderinama su baltymų lygio, kuriame nurodyta, kad miR-10a reguliuoja savo planinio rodiklio, HOXA1 išraiška, per pritaikymo represijos, bet ne mRNR skaldymas šiems pacientams (pav. S1).}

Knock-žemyn HOXA1 Nuslopinta skrandžio vėžio ląstelių augimą ir migracijos in vitro pervežimas pervežimas

Be to, mes paprašėme, ar HOXA1 suvaidino svarbų vaidmenys skrandžio vėžio ląsteles. Išnagrinėti HOXA1 GC vaidmenį, mes nuvertė endogeninio HOXA1 į HGC-27 ir MSV-803 ląstelių linijų aptikti apie ląstelių proliferaciją ir ląstelių migraciją poveikį. Mes pastebėjo, kad HOXA1 represijos slopino ląstelių proliferaciją ir migraciją HGC-27 ir MSV-803 ląstelių, atitinkamai (pav. 5a ir 5b). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-10a veikia kaip naviko slopintuvas GC ląsteles slopina HOXA1 išraišką.

Pasaulis-10a Epigenetically Silenced GC ląstelių linijų

Jei išsiaiškinti, ar mažo išraiška miR- 10a GC audinio buvo epigenetical pokyčių rezultatas, mes traktuojami HGC-27 MSV-803, SGC-7901 ir MKN-45 ląstelių DNR metilinimo inhibitorių 5-aza. Iš miR-10a išraiška buvo iki-reguliuojami HGC 27, SGC-7901 ir MKN-45 ląstelių, kai jie buvo gydomi AZA, tai rodo, kad miR-10a išraiška gali būti represuoti šių ląstelių DNR metilinimo (pav. 6a).

Jei studijuoti PPN-10a reguliavimą DNR metilinimo, mes ieškojau žmogaus genomo duomenų bazę, skirtą CpG salų visame miR-10a naudojant "CpG sala Searcher" programinę įrangą buvimą ir nustatė CPG salą, esančią 1638 BP prieš srovę, Pasaulis-10a
(Pav. 6b). Be to, mes nustatėme, kad DNR metilinimo statusą, naudojant qMSP ir JEP keturiose GC ląstelių linijų. CpG salos buvo hypermethylated visose keturiose GC ląstelių linijas, kurios buvo atitinka mažą išraiška miR-10a šiose GC ląstelių linijų. Kai GC ląstelių linijos buvo gydomi 5-aza-CdR, metilinimo lygis sumažėjo, palyginti su DMSO grupės (pav. 6c).

Žemyn reguliavimas miR-10a GC Pacientai buvo dėl jos CPG salos

Hypermethylation Mes toliau nagrinėjo metilinimo statusą CpG saloje GC audinio ir gretimuose normaliuose audiniuose 55 atsitiktinai parinktų atvejų per qMSP. Metilinimo lygis 55 GC audinių buvo didesnis nei, kad gretimų nevėžinės audinių (p < 0,01), kuris buvo atitinka mažą išraiška miR-10a GC audinių (Fig 6d.). Be to, mes atsitiktinai pasirinktas dvi poras pavyzdžių, kuriais būtų analizuoti DNR metilinimo lygis pagal bisulfatu sekos PGR (BSP), kad patvirtinti JEP tikslumą. Iš BSP rezultatai atitiko kad qMSP ir buvo papildytos kaip Fig. S2. Be to, metilinimo lygis miR-10a (m /m + U) šiose GC pacientams eksponuojami atvirkštinė koreliacija su miR-10a išraiškos (r ^{2 = 0,1956, p = 0,0006) (Fig. 6e). Mes taip pat nustatė metilinimo lygį miR-10a įprastomis skrandžio ląstelių ir skrandžio vėžio ląstelių linijų. Į qMSP rezultatai atskleidė, kad CpG sala buvo iš dalies metilo į GES ląstelių, bet labai hypermethylated dviejuose skrandžio vėžio ląstelių linijų HGC-27 ir MSV-803, kuris taip pat siūlė, kad CpG salos prieš srovę, Pasaulis-10a
buvo hypermethylated GC ląstelių (pav. 6F). Apibendrinant, šios išvados suteikti tvirtą įrodymų, kad miR-10a išraiška buvo reglamentuojama DNR metilinimo šiose GC pacientams. Žemyn reguliavimas miR-10a GC pacientų buvo dėl to, kad jos CpG salų hypermethylation.}

Diskusijos

Šiame tyrime nustatėme, kad Pasaulis-10a buvo žemyn reguliuojama žmogaus skrandžio vėžys iš dalies dėl savo DNR promotoriaus hypermethylation. Tolesni tyrimai parodė, kad padidėjusi miR-10a slopino ląstelių proliferaciją, migraciją ir invaziškumo į GC ląstelių linijų HGC-27 ir MSV-803, galbūt nukreipti onkogenas HOXA1.

Buvo pranešta miRNAs reguliuoti įvairius raidos ir korinio procesai, ir yra susijęs daugelyje žmogaus ligų, ypač vėžio. MiRNAs slopinti genų ekspresiją nukreipiant mRNR per privalomas jų 3 "UTRs. Šie miRNAs eksponuoti reguliavimo vaidmenį vėžio patogenezės ir dalyvauja ląstelių proliferacijos, diferenciacijos, apoptozės, metastazių ir atsparumo [4], [20]. MiR-10a vaidina svarbų vaidmenį keliose vėžio, įskaitant kepenų ląstelių vėžio [9], kasos vėžio [17], ūminės mieloidinės leukemijos [21] ir lėtinės mieloidinės leukemijos [10]. Nenormalus išraiška miR-10a greičiausiai vaidina lemiamą vaidmenį piktybinę transformaciją ir, palyginti su audinių ypatumus. Jo decentralizacija gali prisidėti prie skrandžio navikų vystymosi.

iš PPN-10a klinikinių mėginių išraiškos patvirtinimas rodo, kad Pasaulis-10a buvo žemyn reguliuojama 58 (58/100 58%) GC audinių palyginti su gretimų audinių. Tačiau Weidong Chen , et al.,
Tyrė PPN-10a išraišką 33 GC atvejais ir pastebėjo, kad Pasaulis-10a išraiška buvo didesnis GC audinių negu gretimuose audiniuose [22]. Nesuderinamumas gali būti skirtingo kiekio klinikinius mėginius ir Nebūdingos PPN-10a pokyčių GC audinių rezultatas. Mūsų duomenys turėtų būti daugiau biologiškai Tipinis dėl didesnių skaičių klinikiniuose mėginiuose. Tik didesnė dalis, bet ne visi GC pacientai turi žemyn reguliavimą PPN-10a į savo GC audiniuose, nors rezultatai Pasaulis-10a veikia kaip naviko slopintuvas skrandžio vėžio ląsteles. Tai gali būti dėl atskirą mechanizmas leidimo GC genezės skirtingų asmenų. Gali būti keletas kitų svarbių genų ar veiksniai, atsakingi už tumorigenezei GC pacientams, kurių GC audiniai Pasaulis-10a nepakito arba iki reguliuojama. Be to, Mir-10a išraiška eksponuojami nesusietas su klinikos ypatybes, išskyrus TNM etape, nurodant, kad Pasaulis-10a galėtų atlikti dalinį vaidmenį Tumorigenesis ypač ankstyvosiose stadijose.

Daugelis miRNAs buvo pranešta, kad jie koreliuoja su tumorigenesis, tačiau pagrindinė molekulinės mechanizmas neaiškus. Mūsų ataskaita, funkcinė analizė miR-10a, įskaitant ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija tyrimus, padėjo mums geriau suprasti PPN-10a indėlį į skrandžio kancerogenezėje. Transfekcijq miR-10a imituoti smarkiai slopino ląstelių proliferaciją, migraciją ir invaziškumo GC ląsteles, nurodant, kad miR-10a represijos gali skatinti navikų progresavimą skrandžio kancerogenezėje. Ateities tyrimai siekiant išsiaiškinti šį mechanizmą.

žmogaus genomo Pasaulis-10a
yra prieš srovę HOXB4
. , MIR-10b
, kita Mir-10 šeimos narys, yra prieš srovę, HOXD4
. Šie du nariai yra skiriasi viena nuo kitos tik vienas bazės ir eksponuoti identiškas sėklų sekas, o tai rodo jų panašias funkcijas. Kwoneel Kim [12] pranešė, kad Pasaulis-10b vaidina svarbų vaidmenį GC kaip naviko slopintuvas. Mūsų tyrime, mes įrodyta, kad miR-10a raiškos slopinamas naviko proliferaciją, migraciją ir invaziškumo, kuris buvo panašus į miR-10b GC funkcija. HOX genai yra labai užkonservuoti transkripcijos faktorius, kurie yra lemiamas už teisingą priekinės-užpakalinės raštas kūno ašį [23]. HOXA1 buvo patvirtintas kaip tiesioginis tikslas PPN-10a žmonijos kasos vėžiu [17] ir megakariocitopezės [18]. Mes taip pat pastebėjo, kad miR-10a raiškos sumažėjo HOXA1 baltymų lygiai dviem GC ląstelių linijų, tai rodo, kad HOXA1 yra tiesioginis taikinys miR-10a skrandžio vėžio.

Epigenetiniai modifikacijos buvo įrodyta, kad būti pagrindiniai tarpininkai grindžiama žemyn reguliavimą Mirna žodžio ir eksponuoti griežtą koreliaciją su kancerogeninio poveikio [12], [13], [24]. Mūsų duomenys parodė, kad CpG salos prieš srovę nuo Pasaulis-10a
hypermethylation lėmė žemyn reguliavimo PPN-10a GC ląstelių linijų ir GC pacientams. Be to, AZA gydymas padidėjo MIR-10a GC ląstelių linijų. Remiantis mūsų duomenimis, metilinimo statusas miR-10a, gali būti naudojamas kaip potencialus biologinis į GC.

Apibendrinant, šis tyrimas praneša, kad Pasaulis-10a veikia kaip naviko slopintuvas GC ląstelių ir yra iš dalies žemyn -regulated DNR hypermethylation. Priverstinis išraiška miR-10a slopina ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazyvumas in vitro
. Metilinimo statusą ir išraiška lygis miR-10a gali tarnauti kaip galimą biologinių žymeklių GC, o Pasaulis-10a gali turėti potencialų terapinį vertę vėžio gydymo. Tolesni tyrimai dėl epigenetinio reguliavimo Mirna išraiška yra būtini, o Mirna raiškos reguliavimas epigenetinių vaistai gali teikti naujoviškas gydymo strategiją skrandžio ir kitų žmogaus vėžio.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle. Viesbutis The iRNR lygis HOXA1 per 24 GC pacientų buvo aptikta KRL-PGR
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF)
S2 pav.
BSP analizė metilinimo būklės dviejų GC pacientams. Užpildyta ir atviros apskritimai atstovauja denatūruotą ir nedenatūruotą CpG svetainės atitinkamai
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
lentelė S1. Bendrovės gruntai naudojami šiame straipsnyje
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
lentelė S2.
asociacija tarp PPN-10a su klinikos funkcijų išraiškos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Padėka

autoriai dėkoja Hualu Zhao nuo IBMS (instituto pagrindinės medicinos mokslų), PUMC (Pekinas Sąjunga medicinos koledžo) už techninę pagalbą ir dr Hongkai Zhang iš Jiuxianqiao ligoninėje dėl savo pagalbą imunohistocheminiu.

• PLoS ONE: Darbo išteklių naudojimo endoskopinių Skrandžio vėžio atrankinės patikros Japonijos pirminės priežiūros aplinką: darbo Atranka Study
• PLoS ONE: Genų Polimorfizmas apie mikro RNR Helicobacter pylori sukeltos Didelės rizikos Atrophic gastritu ir skrandžio Cancer