PLOS Genetik: Mir-218 bremst Missiounen an Metastasen vun Gastric Cancer vun gezielt Robo1 Receptor

Wat VerfÜgung

MicroRNAs Leeschtung Schlëssel Rollen an entholl Metastasen. Hei, beschreiwen mir d'Regulatioun a Funktioun vum Mir-218 zu gastric Kriibs (GC) Metastasen. Mir-218 Ausdrock ass zesumme mat dem Ausdrock vun ee vun senge Provider Genen, Slit3 zu metastatic GC ofgeholl. Allerdéngs ass Robo1, eng vun e puer Sai kenne, negatif reegelen Mir-218, also eng negativ Réckkopplung Glück mise. Ofgeholl Mir-218 Niveauen Robo1 Repressioun eliminéiert, déi Sai-Robo1 Passerelle duerch d'Interaktioun tëscht Robo1 an Slit2, also ausléisen entholl Metastasen activéiert. Der Restauratioun vun Mir-218 Hien Ausdrock Robo1 an bremst entholl Zell Invasioun an Metastasen kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. Geholl zesummen, beschreiwen eis Resultater engem Sai-Mir-218-Robo1 reglementaresche Circuit hir Stéierungen ze GC Metastasen bäidroen kënnen. Mir-218 gezielt kënnen eng Strategie fir entholl Metastasen erauszesichen. VerfÜgung

Author Satz VerfÜgung

MicroRNAs als spillt eng wichteg Roll an entholl Metastasen identifizéiert ginn, mä hiren Impakt op GC Metastasen ass schlecht lant. Mir hunn entdeckt Mir-218, deen als suppressor vun entholl Metastasen Funktiounen an ass mat Medeziner Etapp, lymph Node Metastasen soll, an hätt am Patienten mat GC. Eis Resultater weisen, datt Mir-218 Deel vun engem reglementaresche Circuit ass Sai-Robo1 Passerelle sensibiliséieren. An metastatic entholl Zellen, gouf Mir-218 mat Slit3 opgeléist, ee vun senge Provider Genen. Mëttlerweil ass Robo1, eng vun e puer Sai kenne, an Äntwert op d'Ofsenkung Mir-218 upregulated, wat dann eng reaktiv upregulation vum Sai-Robo1 Passerelle duerch en Zesummespill mat Slit2 entschlof, also entholl Zell Wanderung an Invasioun Saachen. Wéi och déi net nëmmen nei Abléck an der metastatic Mechanismen GC awer och Beweiser fir eng Verfilmung miRNA-mediated reglementaresche Modus vun receptor sécher wats VerfÜgung

Fro:. Krawatt J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sonn S, et al. (2010) Mir-218 bremst Missiounen an Metastasen vun Gastric Cancer vun der Robo1 Receptor gezielt. PLoS Genet 6 (3): e1000879. Doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879 VerfÜgung

Redakter: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung

Arnaque: 15 Juli, 2009; Akzeptéiert: 10. Februar 2010; Publizéiert: 12. Mäerz 2010 VerfÜgung

Copyright: © 2010 Krawatt et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Etude gouf vun der National Natural Science Foundation of China (Nr 30670970, Nr 30873026, Nr 30672369, Nr 30530780) an der National Grondakommes Research plangen vu China (No.2010CB529300) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Schrett an diagnostic an therapeutesch Approche hu fir laangfristeg Iwwerliewe fir fréi gastric Kriibs (GC) excellent Erwaardungen gefouert. Allerdéngs bleift aarmséileg Iwwregens hätt fir fortgeschratt GC mat breeder Invasioun an Metastasen [1]. Fir, entholl Zellen ze metastasize muss eng Serie vu mi selektiven a Evenementer virum Goal, dorënner huele wëllt, Migratioun, lokal Invasioun, angiogenesis, intravasation, Iwwerliewe vun der circulatory System, extravasation, an regrowth zu verschidden Organer. An der metastatic CASCADE, Invasioun vun GC an der Géigend Otemschwieregkeeten ass e wichtege fréi Schrëtt [2] - [4]. Allerdéngs hunn d'Mechanisme vun Invasioun nach net vollstänneg opgekläert ginn. VerfÜgung

Eng grouss Zuel vu microribonucleic Saieren (microRNAs oder miRNAs) goufen zu Kriibs Metastasen kuerzem agebonne [5], dorënner Mir-10b, Mir-21, Mir-126, Mir-335, Mir-373, Mir-146, Mir-520c, a Mir-205 zu Broscht Kriibs [6] - [11]; Mir-224 an Mir-21 an Aarbecht Kriibs [12], [13]; Mir-29c zu ​​nasopharyngeal carcinomas [14]; Mir-10A, Mir-222, Mir-125b, Mir-7, a Mir-452 zu urothelial carcinomas [15]; Mir-182 zu melanoma [16]; Mir-92b an Mir-9/9 * am Gehir erhéijen [17]; an Mir-21 zu colorectal Kriibs [18]. Allerdéngs, ganz wéineg bekannt miRNAs am GC Metastasen ze ginn Équipe muss gemellt ginn. miRNAs sinn natierlech geschitt, kuerz, Net-coding RNS Molekülle déi negatif Gentherapie Ausdrock regléieren [19]. An Mamendéieren, sinn eeler miRNAs entsteet aus pri-miRNAs an Pré-miRNAs via mi Ofwécklung vun Drosha an Dicer a sinn zu vill Organismen fonnt. Si besteet aus 21-24 nucleotides, intégréieren an RNS-Pinguin silencing investéiert, an hien huet misse mat der untranslated Regiounen '3 (3'-UTR) vun spezifeschen Zil Messenger RNAs (mRNAs) Iwwersetzung ze oofgesinn oder ofgeschnidden vun der Zil- mRNAs induce [20 ]. Schwellen- Beweiser huet verroden, datt miRNAs Schlëssel Rollen an verschidde biologesch Prozesser Leeschtung, dorënner Zell dat, Prolifératioun, apoptosis, Stress Resistenz, Fett ukuerbelt, tumorigenesis, an Metastasen [21] - [23]. E bessere Verständnis vun de Changementer an miRNA Ausdrock während GC Invasioun kënnen zu engem bessere Verständnis vun GC Entwécklung, esou wéi och méiglech Verbesserungen an der Diagnos a Behandlung vun fortgeschratt GC Féierung. VerfÜgung

Am Moment studéieren, mir etabléierten héich (MKN28-M an SGC7901-M) an niddreg invasiv Zell sublines (MKN28-NM an SGC7901-NM) eng widderhuelen transwell assay benotzt kënschtlech VerfÜgung. Mir iwwerpréift dann d'global miRNA Ausdrock Profil vun all subline Zell engem miRNA microarray benotzt differentially ausgedréckt miRNAs ze identifizéieren ze Mënsch GC Invasioun dinn. Am Ganzen, goufen 45 miRNAs dës vs. Net-invasiv GC Zellen zu invasiv differentially ausgedréckt gin. Dorënner, Mir-218, eng bedeitend downregulated miRNA zu héich invasiv Zellen, huet dës Distanz ze enk mam GC tumorigenesis an Metastasen zu Patienten soll ginn. Méi kuerzem, ass eng Diminutioun an Mir-218 an e puer Zorte vu staark erhéijen gemellt ginn, dorënner Aarbecht Kriibs, GC, haett Kriibs, an cervical carcinoma [24] - [27], mä dëse Verloscht vun miRNA-218 einfach war schlëmm aus als ee vun de Dosende vu potentielle miRNAs vun Interessi vun der uewen beschriwwen Cancers ginn. Keng weider Studien gewiescht standing d'Bedeitung vum Mir-218 zu entholl Metastasen ze bewäerten. Hei, hu mer fonnt, datt Mir-218 Ausdrock ofgeholl huet soll mat fortgeschratt Medeziner Etapp, lymph Node Metastasen, an aarm hätt an Patienten, an du-Ausdrock vun Mir-218 zu metastatic Zellen gebass Migratioun zu inhibit, Invasioun, an Metastasen Équipe souwuel kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. Mat Hëllef vun engem Bioinformatik Sich fir Mir-218 Ziler, pinpointed mir de receptor Robo1 wéi funktionell Zil d'Mir-218, a mir confirméiert, datt d'Interaktioun tëscht Mir-218 an Robo1 zu GC Zell motility entscheedende war andeems dass et en ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëscht Mir -218 an Robo1 am GC Zell Linnen an och GC Patienten. Ausserdeem, entdeckt mir e spezielle negativen Feedback Glück sensibiliséieren Sai, Mir-218, an Robo1, an deem Mir-218 kann an der introns vun zwou verschidde Membere vun der Sai FAQ Famill matzen aus entweder vun zwee Genen ofgeleet ginn. Zousätzlech, Membere vun dëser Famill ginn ligands vun der Robo1 receptor. Mir bewisen datt Ausdrock vun den zwou miRNA Virleefer Genen (Mir-218-1 an Mir-218-2) soll mat Ausdrock vun de Provider Genen (Slit2 an Slit3, bzw.) an dass den alen Mir-218 haaptsächlech aus der Mir ofgeleet war -218-2 Virreideroll, mat engem concomitant Reduktioun vun Provider Slit3 awer net vun Slit2 zu metastatic GC Zellen. Sou, upregulation vun Robo1 an Äntwert op d'Ofsenkung Mir-218 entschlof eng reaktiv upregulation vum Sai-Robo1 Passerelle duerch seng Interaktioun mat Slit2, also entholl Zell Invasioun an Metastasen Saachen. Eis Conclusiounen just net déi nei Abléck an der metastatic Mechanismen GC, mä si verroden och eng Verfilmung reglementaresche Mechanismus vun receptor sécher. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Grënnung an characterization vun Zell sublines mat verschiddene invasiv an metastatic Potenzialer VerfÜgung

de GC Metastasen Modeller ze etabléieren, hunn mir invasiv an Net-invasiv Zell sublines vun der mënschlecher GC Zell Linnen SGC7901 an MKN28 der widderholl transwell Approche benotzt (Dorënner 1A, spontan a Methode gesinn). Kuerz, war e widderhuelen Invasioun assay gesuergt, an deenen Zellen, datt d'Schläimhait an Zellen ze violéieren gescheitert, datt d'Fäegkeet hat duerch d'collagen-Beschichtete Membran an all Auswiel woren zu opgeholl getrennt. No zéng Ronne vun Auswiel, dèi mir invasiv (MKN28-M an SGC7901-M) an Net-invasiv Zell sublines (MKN28-NM an SGC7901-NM). D'metastatic Eegeschafte vun vunenee subline sech dann charakteriséiert kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. Als zu Dorënner 1B an 1c gewisen, war Migratioun Fähegkeet vun MKN28-M Zellen ongeféier 4-fantastesch grouss wéi déi vun MKN28-NM Zellen. Anerersäits, war d'invasiv Potential ronn 5-fantastesch grouss fir MKN28-M Zellen als Verglach zu MKN28-NM Zellen. An der zu VIVO VerfÜgung Studie, war entholl Zell Metastasen an Sauna Mais observéiert. Als zu Dorënner 1D an 1E gewisen, bal keen metastatic GC Zellen sech an de Longen oder livers vun Sauna Mais op 10 Wochen no Sprëtz vun MKN28-NM Zellen fonnt, hierkommen heijen meescht vun de Mais mat MKN28-M Zellen kloer haett oder Liewer ugewisen Investitiounen. Ähnlech Resultater ware fir SGC7901-M an SGC7901-NM Zellen observéiert (Donnéeën net gewisen). Keng Differenze zu Zell Prolifératioun oder Zell-Zyklus Verdeelung ënnert dës Zell sublines observéiert goufen (Text S1, Sauerdall S1 an S2). VerfÜgung

Umeldung vun Metastasen-Zesummenhang miRNAs déi lackeleg-baséiert hybridization VerfÜgung

fir miRNAs potenziell Équipe an GC Invasioun identifizéieren, mir global miRNA Ausdrock vun vunenee subline mat der microRNA vill (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Dänemark) iwwerpréift, déi fir eeler Mënsch miRNAs vun 847 knipsen Ämter besteet. D'microarray Resultater bekannt, datt de Begrëff vun 124 miRNAs bedeitend tëscht dem héichste invasiv Variant MKN28-M an der Net-invasiv Zell subline MKN28-NM ënnerscheet. Vun deenen, goufen 83 upregulated an 41 downregulated goufen. Verglach mat SGC7901-NM, goufen 62 miRNAs differentially an der SGC7901-M Zell subline ausgedréckt, dorënner 47 downregulated an 15 upregulated miRNAs. Am Ganzen, goufen 11 miRNAs fonnt Souwuel MKN28-M an SGC7901-M Zellen am Verglach mat deene vun de jeeweilegen Net-invasiv sublines (Table S1). VerfÜgung

Vun der 45 gin upregulated an 34 miRNAs sech differentially downregulated regulariséiert miRNAs, gouf Mir-218 eent vun deenen, déi vill Ausdrock Ënnerscheed ugewisen. Mir-218 huet gemellt ginn an cervical Kriibs [25], GC [26], haett Kriibs [27] an Aarbecht Kriibs [28], déi besot méiglech Abannung vun béiden oncogenic Transformatioun an entholl Metastasen downregulated gin. Allerdéngs war miRNA-218 nëmmen eent vun de ville Potential miRNAs vun Interessi Cancers. An dësem Wierk, gouf zu vill méi Detail Mir-218 propagéieren. Fir d'microarray Resultater confirméieren, mir évaluéieren Mir-218 Ausdrock vun der GC Zell sublines z'investéieren an zu der onstierwlechen gastric epithelial Zell Linn GES benotzt qRT-Hinnen alleguer [29]. Mir-218 Ausdrock war ofgeholl bedeitend an MKN28-M an SGC7901-M Zellen an niddreg an all véier GC Zell sublines Verglach zu sengem Mënsch gastric epithelial GES Zellen (Dorënner 2A). Ausserdeem, am Verglach mir Mir-218 Ausdrock an der Primärschoul GC entholl vs. der metastatic lymph Wirbelen a 10 Patiente mat Etapp III /IV GC qRT-Hinnen alleguer benotzt. Als zu Dorënner 2B gewisen, eeler Mir-218 Niveau vun 7 vun 10 metastatic lymph Wirbelen vill ofgeholl huet, wat beweist, datt Mir-218 engem causal Roll am GC Metastasen spille kann. VerfÜgung

Ofgeholl Mir-218 Ausdrock am GC verbonne war mat fortgeschratt Medeziner Etapp, lymph Node Metastasen, an aarm Patient hätt VerfÜgung

fir d'Potential clinicopathological Implikatioune vun verännert mir-218 Ausdrock bestëmmen, ze propagéieren mir den Ausdrock Niveau vun mir-218 zu 40 GC Stoffer (T) an Net-entholl mucosa (N) vun qRT-Hinnen alleguer. De Begrëff -ΔCt benotzt gouf den Ausdrock Niveau vum Mir-218 ze beschreiwen. Konsequent mat der uewe Donnéeën, Fra d'Resultater, déi d'Mir-218 Ausdrock Niveau vun GC (-13.81 ± 0,15, mengen ± SE) Stoffer wéi déi wesentlech méi niddreg war an Net-neoplastic mucosa (-11.62 ± 0,15, mengen ± SE) ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,0001, t = 10,62, vläit t VerfÜgung Azeton) (Dorënner 3A). Kennenzeléieren tëscht der Mir-218 Ausdrock Niveau an clinicopathologic Charakteristiken vun GC sinn an Table 1. statistesch relevant Associatiounen tëscht der Mir-218 Ausdrock Niveau a Krankheete Etapp an tëscht de Bord-218 Ausdrock Niveau an GC Metastasen zesummegefaasst huet an dëser Etude observéiert. D'Steiren Ausdrock vu Mir-218 huet -14,25 ± 0,17 an der 22 Fäll mat fortgeschratt Etapp (Etapp III a IV) Krankheet, wobäi d'Steiren Ausdrock -13,27 ± 0.20 ( war P VerfÜgung = 0,0010, Mann-Whitney Test) an der 18 Fäll mat fréi-Etapp (Etappen sin an II Krankheet). An der 29 Fäll vun GC mat lymph Node Metastasen, war d'Steiren Ausdrock vu Mir-218 -14.09 ± 0,16, déi vill méi niddereg wéi den Steiren Ausdrock war (-13.07 ± 0.24) an der 11 Net-metastatic GC Fäll ( P VerfÜgung = 0.0036). Den Ausdrock vun Mir-218 am GC Patienten gemaach vergläichen net mam Alter, Geschlecht, entholl Gréisst, oder Zell dat. Desweideren, iwwerpréift mir ob den Niveau vum Mir-218 Ausdrock mat Iwwerliewe vun Patienten mat GC verbonne war. Patienten goufen duerno nees niddereg Ausdrock ënnerdeelt (n = 20) an héich Ausdrock Gruppen (n = 20) baséiert op Mir-218 Niveau méi oder manner wéi déi heeschen (-13.81) (Dorënner 3B). Kaplan-Meier Iwwerliewe Analysë verroden dass Patienten hir primär erhéijen ugewisen niddereg Ausdrock vu Mir-218 eng kuerz Steiren Iwwerliewe Zäit haten. Déi dräi-Joer Iwwerliewe Taux vu Patienten mat niddereg Mir-218 Ausdrock 30 war%, wat bei Patienten mat héije Bord-218 Ausdrock (65% däitlech méi niddreg wéi d'Iwwerliewe Taux war; P VerfÜgung = 0,0012, log- attributer Test;. Dorënner 3C) VerfÜgung

Ectopic Ausdrock vu Mir-218 inhibited entholl Zell Invasioun an Metastasen kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO

fir ze studéieren d'Roll vum Mir-218 am GC Metastasen, goufen MKN28-M Zellen transfected mat pGenesil-1-Mir-218 oder eng Kontroll Vecteure engem nonspecific miRNA, CEL-Mir-67, mat Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Karlsbad CA, USA ausdrécken ). D'Zellen sech dann mat 400 mg /L G418 ausgewielt MKN28-M-Mir-218 an MKN28-M-Mir-Kontroll stabil Zellen ze generéieren. Mir hu fonnt, datt ectopic Ausdrock vu Mir-218 duerchgesat an eng ronn dräi-fantastesch Reduktioun vun Wanderung an invasiveness. Fir festzestellen, ob de Verloscht vun Mir-218 géif der Migratioun oder Invasioun vu Kriibs Zellen förderen, mir entsat Mir-218 mat enger antisense oligonucleotide inhibitor an der MKN28-NM Zell Linn, déi zu engem three- bis véier-fantastesch Erhéijung vun Zell Migratioun an invasiveness (Dorënner 4A an 4B). Fir Test wann inhibition vun entholl Invasioun vum Mir-218 vun impairing der invasiv Fähegkeet vun entholl Zellen ëmmer ass, ausgeschloss mir den Effet vum Mir-218 op der Verbreedung an Zell Zyklus Verdeelung vun gastric Kriibs Zellen. Iwwer-Ausdrock vun Mir-218 huet net d'Prolifératioun Afloss an der Zell Zyklus Verdeelung vun MKN28-M Zellen kënschtlech VerfÜgung (Dorënner S5A an S5D). Fir weider d'inhibition vun ermëttelen an VIVO VerfÜgung entholl Metastasen vum Mir-218, mir implanted MKN28-M-Mir-218 Zellen datt stably Mir-218 oder Kontroll Zellen an Sauna Mais duerch d'lateral Schwäif äusseren sech auszedrécken. Lung a Liewer Metastasen vun GC war zu Mais heijen mat MKN28-M-Mir-Kontroll Zellen offensichtlech. Am Géigesaz, waren puer metastatic erhéijen an Mais festgestallt heijen mat MKN28-M-Mir-218 Zellen (Dorënner 4C). Ausserdeem, observéiert mir gläichzäiteg de Wuesstum vun der Primärschoul erhéijen an der Heefegkeet vu fernen Metastasen an der Sauna Mais subcutaneously mat MKN28-M-Mir-218 Zellen oder Kontroll Zellen heijen. D'Resultater zougedréckt haett oder Liewer Metastasen an 3 vun 10 Mais visuell war heijen mat MKN28-M-Mir-Kontroll Zellen; an doen Géigesaz, huet kee Metastasen zu Mais mat MKN28-M-Mir-218 Zellen (Dorënner S5E) heijen fonnt. Des Resultater sinn konsequent mat Daten aus Schwäif verfeelt assays kritt, datt Kriibs Metastasen bewäerten a weisen, datt Mir-218 d'Fähegkeet Metastasen ze oofgesinn huet ouni Zell Prolifératioun betrëfft. VerfÜgung

war Robo1 engem direkten funktionell Zil vum Mir-218 am GC Metastasen VerfÜgung

fir bewäerten wéi engem niddregen Niveau vum mir-218 Ausdrock un d'Invasioun an Metastasen vun GC dréit, gesichte mir fir d'Potential reglementaresche Ziler vum mir-218 Cepheid Tools benotzen, dorënner Miranda, PicTar, an TargetScan. Obwuel honnerte vu verschidden Ziler virausgesot huet, déi Genen Équipe an Migratioun oder Invasioun kann den zoustännege Ziler mat Respekt un der biologescher Funktiounen vum Mir-218 gin. Mir standing dann eng funktionell Klassifikatioun vun de virausgesot Ziler vum DAVID Programm benotzt (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Vun dësen Genen, ass Robo1 als proto-oncogene an Häfe Migratioun-Spur Aktivitéit erauskoum [30] - [35]. Mertsch et al. VerfÜgung bewisen, dass Robo1 glioma Zell Migratioun bechter vun Slit2 mediated [36]. Schmid et al. VerfÜgung fonnt dass Broscht entholl Zell Wanderung duerch d'Slit2-Robo1 Interaktioun entschlof ass kënschtlech VerfÜgung [37]. Dës Conclusiounen hindeit datt Robo1 eng Zilscheif fir Mir-218 kann. Fir weider eis Hypothes Test, analyséiert mir den Ausdrock vun Mir-218 an Robo1 zu GES a vun Net-invasiv (MKN28-NM an SGC7901-NM) an invasiv (MKN28-M an SGC7901-M) GC Zellen. D'Resultater weisen eng negativ Korrelatioun tëscht dem Niveau vum Mir-218 an Robo1 mRNA vun deenen Zellen (Dorënner S3A). Ausserdeem, observéiert mir dass Robo1 mRNA (Dorënner S3B) an FAQ (Dorënner 5B2) Niveau ofgeholl huet wéi Mir-218 vun pGenesil-1-Mir-218 zu MKN28-M Zellen (Dorënner 5B1) ausgedréckt huet. De Géigendeel war fir Robo1 Ausdrock observéiert wann Mir-218 war am MKN28-NM Zellen (Dorënner 5C1 an Dorënner 5C2) Uewerschenkel. D'ëmgedréit, et gesäit Relatioun tëscht Mir-218 an Robo1 Ausdrock gouf weider vun immunohistochemistry (Text S1) an 40 Fäll vu Kriibs gastric bestätegt, an ë.a. bascht normal Stoffer, datt och zu clinicopathological Studien gebraucht goufen, an zu 29 reagéiert Investitiounen. D'Resultater weisen, datt Robo1 am GC upregulated war, virun allem am metastatic GC (Dorënner S4), an deem Mir-218 mat engem relativ niddregen Ausdrock huet. VerfÜgung

weider direkte Beweis ze kréien, datt Robo1 eng Zilscheif vum Mir-218 ass mir der bindend Site vum mir-218 zu der 3'-UTR vun Robo1 mRNA (Dorënner 5A) propagéieren. Mir gebaut engem luciferase reporter (Luc-Robo1) an deem d'nucleotides vun der Robo1 3'-UTR ergänzen ze Mir-218 (NG 971-978) an der pMIR-Dobäi miRNA Ausdrock reporter Vecteure hin sech [38]. Weltwäit, mir zwee och e Mann- reporter (Luc-Robo1-Mu) entsteet, an déi éischt sechs nucleotides vun der Raumstatioun-218 Som-Regioun ergänzen Siten geläscht huet, an eng Kontroll Rapporteur, deem engem Net-Zesummenhang Brochstéck vun cDNA enthale (Luc-Ctrl). Mir-218-Ausdrock plasmids sech Co-transfected mam Luc-Robo1, Luc-Robo1-Mu, oder Luc-Ctrl an MKN28-M Zellen. D'assays gewisen, datt d'luciferase Aktivitéit an der Luc-Robo1-transfected Zellen war vill zu der luciferase Aktivitéit am Mann- an negativ Kontroll Zellen Verglach ofgeholl ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) suggeréiert datt Mir-218 Uschlossgoal luciferase Aktivitéit vun Luc-Robo1 mee hu keen Effekt op Luc-Robo1-Mu (Dorënner 5D). Dofir, ofgeschloss mir datt de hin Brochstéck vun Robo1 (NG 971 - VerfÜgung 978). War d'Zil vum Mir-218 VerfÜgung

Robo1 iwwer-ausgedréckt an Kriibs Zellen gewise gouf gin an ass bekannt ze entholl angiogenesis an Metastasen via en normaalt Gespréich mat Sai [39], [40] förderen. Ze testen ob Robo1 System vum Mir-218 gereegelt ass, generéiert mir eng Robo1 Ausdrock bauen nëmmen e Brochstéck vun der virausgesot Mir-218 bindend Site an Robo1 Mann- Ausdrock Vecteure mat ganz subtil d'3'-UTR. Mir hunn och de Robo1 siRNA. MKN28-M-Mir-218 Zellen, déi stably ectopically Mir-218 ausgedréckt, sech mat der Robo1 transiently transfected bauen oder d'Mann- bauen (mat kee Mir-218 bindend Site), an MKN28-M Zellen sech mat Robo1 siRNA oder engem transfected negativ Kontroll siRNA. MKN28-M-Mir-218 Zellen mat der Mann- bauen Robo1 transfected zougedréckt enger 3,8-fantastesch Erhéijung vun Invasioun Fähegkeet Verglach zu Zellen mat der Robo1 bauen transfected. Dës Resultater weisen, datt Aféierung vun Mann- Robo1 cDNA datt de Bord-218 bindend Site an der Mir-218-overexpressing Zellen gefeelt réckgängeg den Effet vum Mir-218-mediated Ennerdréckung vun Zell Invasioun. Allerdéngs war duerch Mir-218 an der Präsenz vun der Robo1 3'-UTR wouvun der Mir-218 bindend Siten den Effet vun Robo1 repressed. Knockdown vun Robo1 vun siRNA zu MKN28-M Zellen Zell Invasioun inhibited, wat fir Niveauen gläicht deenen der transfection mat der Raumstatioun-218-ausdrécken Vecteure (Dorënner 5E an 5F) observéiert gefall. Dës Observatioune hindeit datt Mir-218 Hien direkt Robo1-mediated Zell Invasioun. VerfÜgung

Slit2, mä net Slit3, ka mat Robo1 zesummekomm, beräichert duerch d'Feele vu Mir-218, ze GC Invasioun Promotioun VerfÜgung

zwou Zorte vun miRNAs existéieren: intergenic an intronic. De fréiere sinn an Net-coding Regiounen tëscht Genen läit, an hire jeeweilegen pri-miRNAs sinn aus hiren eegene Promoteuren vun RNS polymerase II allgemeng annescht. Der Pai am introns vum Provider Genen läit, an hir biogenesis ass vum Provider Gentherapie Promoteuren [41], [42] kontrolléiert haten. Mir-218 ass eng intronic miRNA. Zwee Genen Code fir eeler Mir-218, Mir-218-1 an Mir-218-2, déi bannent intron 15 vun Slit2 etabléiert sinn an intron 14 vun Slit3, bzw. (Dorënner 6A). D'intronic Standuert vun den zwou Mir-218 Genen Suite eis ze froen, ob Mir-218-1 an Mir-218-2 sinn ausserdeem zesumme mat hirem Provider Gentherapie mRNAs. Fir dëst Hypothes Test, mir qRT-Hinnen alleguer benotzt den Ausdrock vun der Raumstatioun-218-1 Virleefer ënnersicht, de Mir-218-2 Virreideroll, eeler Mir-218, Slit2 mRNA, an Slit3 mRNA am GC Stoffer an d'Iwwerliewe benotzt Analyse. Statistesch Analyse vun der Korrelatioun souguer gemaach ginn vun de qRT-Hinnen alleguer Resultater réischt eng wichteg positiv Korrelatioun tëschent den Niveau vun Slit2 mRNA an Mir-218-1 an tëscht de Niveau vun Slit3 mRNA an Mir-218-2 (Dorënner 6B an 6C). Dës Resultater weisen, datt de Bord-218 Genen coding, Mir-218-1 an Mir-218-2, sinn ausserdeem zesumme mat hirem Provider Genen, Slit2 an Slit3, bzw.. Eng bedeitend positive Korrelatioun tëschent den Niveau vum Mir-218 an Mir-218-2 (Dorënner 6D) war am GC gesinn; awer, war keng esou Korrelatioun tëschent den Niveau vum Mir-218 an Mir-218-1 (Dorënner 6E) gesinn. Dës Resultater weisen, datt downregulation vum Mir-218 am GC ass duerch eng Ofsenkung Mir-218-2 Opstig, mä net an Mir-218-1. Konsequent mat dëser Conclusioun, war Slit3 Ausdrock vill an GC reduzéiert (-22.43 ± 0,21, mengen ± SE) am Verglach zu normalen gastric Otemschwieregkeeten (-20.79 ± 0,23, mengen ± SE), ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,0001, t = 7,67, vläit t VerfÜgung Azeton) (Dorënner 6F), wobäi Slit2 Ausdrock net vill anescht war ( P VerfÜgung = 0,0772, vläit t VerfÜgung Azeton) ( Figur 6G). Am Resumé, proposéiere eis Experimenter déi bedeitendst upregulation vun der Robo1 Gentherapie an Äntwert ze Entféierung vum Mir-218 kënnen eng zousätzlech upregulation vum Sai-Robo1 Passerelle duerch seng Interaktioun mat Slit2 induce, entholl Zell Wanderung an Invasioun Saachen. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

eng Krankheet ze studéieren, ass et wichteg eng ideal Modell ze bauen. Am Moment studéieren, isoléiert mir invasiv an Net-invasiv Zell subpopulations vun etabléierten Mënsch GC Zell Linnen d'widderholl transwell Approche benotzen, déi op ville Studien enquêtéiert entholl Metastasen [43] erfollegräich applizéiert gouf - [48]. D'Resultater vun metastatic Ënnersichung kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung gewisen, datt déi etabléiert Zell sublines z'ënnerscheedde invasiv an metastatic Capacitéiten haten. Hei, opgefouert mir net nëmmen Zell sublines ofgeleet vum GC Zell Linnen mat héije-invasiv Potential, mä och déi mat niddereg-invasiv Potential. Mat der Ausnam vun hire metastatic Fähegkeeten, waren der gewielter Zell sublines souwuel ganz ähnlech, well se d'selwecht genetesch Hannergrond deelen. Zanter de groussen Ënnerscheed tëschent den zwou Zorte vun sublines metastatic Méiglechen stoussen ass, de Genen déi tëscht hinnen ënnerscheeden solle mat Metastasen vergläichen gutt. Desweideren, eiser Method ass méiglech Invasioun Etappen aus Metastasen ze z'ënnerscheeden an erméiglecht der Etude vun spezifesch Schrëtt an Metastasen, déi kënnen net an d'liewen-Déier Modell harmoniséiert ginn. VerfÜgung

Viru Kuerzem, goufen miRNAs Rapport ze förderen [49] , [50] oder oofgesinn [51] - [54] entholl Metastasen, enger neier Siicht op d'metastatic Prozess ëmzesetzen. Trotzdeem ass, ass d'Roll vun miRNAs am GC Metastasen subtil. An dësem Rapport, lant an mir fir d'éischte Kéier 45 Metastasen-Zesummenhang miRNAs am GC baséiert op e gutt etabléiert Metastasen Zell Modell kritt. Déi fannen dass Mir-218 war am metastatic GC downregulated ass spezielle, wéi Mir-218 Niveau ofgeholl hunn an e puer Zorte vu staark erhéijen gemellt ginn [24] - [27], [55], wat beweist, datt de Verloscht vun Mir-218 vläicht eng gemeinsam Manifestatioun zu tumorigenesis ginn. Am Moment studéieren, do hu mer op der Wierkung vun Mir-218 op GC Metastasen a bewisen, dass Mir-218 Akten als entholl suppressor am GC Metastasen. Restauratioun vum Mir-218 reduzéiert Zell Wanderung an Invasioun kënschtlech VerfÜgung an entholl Metastasen zu VIVO VerfÜgung. Ze kréien stabil Zell Linnen déi iwwer-ausgedréckt Mir-218, mir MKN28-M Zellen mat Mir-218 plasmids an opgefouert vun G418 transfected. Mir ausgewielt zwielef Zell Kolonien an d'Mir-218-transfected Grupp an hunn 10 vun 12 Kolonien Schatzkummer bemierkenswäert Uniform, stabil an héich-Niveau Ausdrock vu Mir-218. Ausserdeem, Schatzkummer dräi per Zoufall ausgewielt monoclonal Zell Linnen ähnlech Reduktioun vun invasiv ablility. Allerdéngs Resultat Strategien plasmid transfection oft am ënneschten Integratioun Effizienz Verglach zu Haren Ausdrock un d'Méiglechkeet vun stochastic Auswiel vu rare System heterogen Varianten vun der initialen normaler Bevëlkerung Haaptfiguren. Dofir d'Zukunft Benotzung vun Haren Ausdrock Systemer sollen eng méi unbiased ab Populatioun schafen eis Hypothes ze testen. VerfÜgung

Als Deel vun eiser Fuerschung op wéi de Verloscht vum Mir-218 schellt Metastasen GC, hien huet mir dat Robo1 enger kritescher war afgerappt Zil vum Mir-218. Et ass bekannt, datt den Elysée plënnert eng axon Orientatioun receptor fir Sai ass an ass an Déieren rangéiert vun Uebst flies zu Mamendéieren conserved. An Mamendéieren, dräi Sai (Slit1-3) a véier Elysée plënnert (Robo1-4) Genen hunn beschriwwe ginn [56], [57]. Sai-Elysée plënnert Interaktioune wäschen Signaler repulsive léich op axons a Wuesstem verluer während Mä Entwécklung an un T Zell an monocyte chemotaxis mediating [58] - [64]. Wéi fir aner Entwécklungsphase Édouard aberrant Ausdrock vun der Sai - [68] - VerfÜgung Elysée plënnert Genen gouf zu enger Rei vu entholl Zorte [65] observéiert. Zum Beispill, an Echantillon Broscht carcinoma Otemschwieregkeeten, gouf Robo1 dës Regioun-ausgedréckt gin, an et bewisen ass Wanderung vun Broscht Kriibs Zell Linnen [37] zu induce. Slit2-Robo1 sécher maaachen [36] Migratioun glioma Zell an ass zu angiogenesis Équipe vun microvessel Dicht an entholl Mass zu engem entholl xenograft Modell waarden [30]. Wang et al. VerfÜgung bewisen, datt d'Regioun-Ausdrock vun Robo1 an nei Blutt Offshore zu erhéijen Kriibs neovascularization a Wuesstem via eng Interaktioun tëscht Robo1 a seng ligand, Slit2 induces. Si och phosphoinositide-3-kinase (PI-3K) als afgerappt effector vun Slit2 /Robo1 sécher identifizéiert. Dëst deit drophin, datt et existéiert eng Sai-Robo1-PI-3K CASCADE datt zu der Generatioun vun phosphoinositol-3,4,5-Adenosintriphosphat an der nächster Aktivéierungscode vu klenge GTPases dass Beweegung an Remodeling vun der actin cytoskeleton Mediate Zell Féierung kéint [30] , [35]. Am Géigesaz, hunn aner Studien argumentéiert, datt d'downregulation vun Robo1 déitlech geläscht oder epigenetic Ännere kann eng Roll an entholl Werdegang [69] Leeschtung - [73]. Mir proposéieren, eng Otemschwieregkeeten-spezifesch Ausdrock Muster vum Sai-Elysée plënnert Genen existéiert. VerfÜgung

An der aktueller Etude, mir fonnt, datt Robo1 oft bei héijen Niveau an invasiv Zellen ausgedréckt huet a bei nidderegen Niveau vun Net-invasiv Zellen hierkommen Mir-218 de Géigendeel Ausdrock Muster ugewisen. Wa mir de Bord-218-Ausdrock Vecteure an inhibiting oligonucleotides an MKN28-M an MKN28-NM Zellen transfected, respektiv, war en ëmgedréit, et gesäit Ausdrock Muster, tëscht Mir-218 an Robo1 observéiert dat ass, wann Mir-218 Ausdrock héich war, Robo1 Ausdrock war niddereg a vice versa. Dëst Resultat ass weider zu Medeziner Echantillonen an luciferase Aktivitéit assays confirméiert. Mir gemierkt och dass Aféierungs- vun Ausdrock vun Robo1 vun der Robo1 Mann- bauen ouni de Bord-218 bindend Site kéinten Mir-218-mediated Ennerdréckung vun entholl Zell Invasioun ëmgedréint. Am Géigesaz, knockdown vun Ausdrock Robo1 Gentherapie vun RNAi haten en Effekt op entholl Zell Invasioun gläicht deem vun der Renovatioun vum Mir-218 reduzéieren, obwuel dësen Robo1 knockdown eng schwaach Effekt bewisen. Dëst kéint ginn well Robo1 net dat eenzegt Ziel vun Mir-218 ass datt bis entholl Metastasen relevant ass. Dës Conclusiounen weg datt d'Invasioun Ennerdréckung Effet vum Mir-218 ass op d'mannst zum Deel duerch e Verloscht vun Robo1 Ausdrock mediated. Dëst ass och déi éischt studéieren ze weisen, datt de entholl-verbonne Gentherapie Robo1 negatif vum Mir-218 via engem spezifeschen Zil Site (NG 971-978) bannent der 3'-UTR reglementéiert ass. D'Robo1 receptor ass wichteg fir d'Äntwert ze extracellular Signaler a bewosst phenotypic Ännerungen; dofir, knapper Regulatioun vun der Robo1 receptor vum Mir-218 vläicht méi sécherlech Signal transduction vereinfachen. Anti-Robo1 monoclonal antibody huet gemellt gouf eng efficace Behandlung fir Robo1-ausdrécken Cancers ginn [30], [33]. Am Moment studéieren, hunn mir eng nei inhibitor vun Robo1, Mir-218, déi potenziell benotzt gin kann e puer Zorte vu Kriibs unzegesin. VerfÜgung

Als verwisen, Slit1, Slit2, an Slit3 Kader vum Sai Famill vun Proteinen. Obwuel d'Genen iwwerlageren, sinn hir Ausdrock Musteren an Funktiounen nokoumen. Déi fréier zwou Proteinen sinn bekannt an axon Orientatioun an Zell Migratioun Équipe ze ginn [37], [74], während Slit3 ass an der Entwécklung vun der Uergel an Uergel Systemer, dorënner d'Blend an d'Nier [75] Équipe. Am Accord mat dësen Daten, fonnt mir dass Slit2, mä net Slit3, mat Robo1 Experten GC Invasioun ze förderen. VerfÜgung

Zousätzlech, hien huet mir datt de Bord-218 coding Genen an ausserdeem zesumme mat Sai Genen etabléiert sech , déi also Robo1 ligands, huet en negativen Feedback Glück schafen déi Sai /Robo1 sécher reguléieren. Sailen Barik bewisen, dass en intronic miRNA, Mir-338, Genen entsat dass System verschiddene sinn op hir Provider Gentherapie Produit, also e positive Feedback Glück schafen, datt an der Fro gestallt Roll vun de Provider Gentherapie hëlleft [76].

• PLOS NËMMEN: wiere CXCR4 Expression - eng Verfilmung Antiangiogenic Target zu Gastric Cancer
• PLOS NËMMEN: Silencing vun Claudin-11 Ass mat Geklomm Invasiveness vun Gastric Cancer Cells