PLoS ONE: Deregulacija između Mir-29b /c i DNMT3A je povezana s Epigenetske utišavanje od CDH1 gena, koji utječu na mobitel migraciju i invaziju u želučanom Cancer

Sažetak pregled

deregulacijom Mir-29 obitelji i DNA metiltransferaza 3A (DNMT3A) povezana s karcinomom želuca (GC). Dok porast dokaza ukazuje Mir-29B /C može regulirati DNA metilacije ciljajući DNMT3A, to je trenutno poznato je li epigenetičko utišavanje od Mir-29b /c preko promotor Hipermetilacija u GC je uzrokovana poremećajem izražavanja DNMT3A. Dakle, cilj nam je procijeniti da li postoji propis cross-talk između Mir-29b /c i DNMT3A i da li je povezana s malignom fenotipu u GC. Prvo, zacjeljivanje rana i Transwell ispitivanja pokazala da miR-29b /c potiskuje tumorskih metastaza u GC. Luciferaze reporter Analiza je pokazala da DNMT3A je izravna meta Mir-29b /c. Koristili smo bisulfita genomske slijeda za analizu stanja DNA metilacije Mir-29b /c. Postotak metilnog CpGs značajno smanjena u DNMT3A iscrpljena stanica u odnosu na kontrole. Nadalje, uključivanje DNMT3A u promicanju migracije GC stanica bila povezana s promotorom metilacije posredovane represiji CDH1. U 50 uparenih uzoraka kliničkih GC tkiva, smanjuje Mir-29b /c je značajno koreliraju sa stupnjem diferencijacije i invazije stanica te je u negativnoj korelaciji s DNMT3A izražavanja. Zajedno, naši preliminarni rezultati ukazuju da sljedeći proces može biti uključen u GC nastanku tumora. Mir-29b /c potiskuje nizvodno gena DNMT3A, a zauzvrat, Mir-29b /c je potisnut od strane DNMT3A u metilacije način ovisan o DNA. De-regulacija oba Mir-29b /c i DNMT3A dovodi do epigenetičke odsutnost CDH1 i doprinosi metastaza fenotipa u GC. Ovo otkriće pokazuje da metilacije DNA povezane utišavanje Mir-29b /c je kritično za razvoj GC i na taj način može biti terapijski cilj pregled

Izvor:. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Deregulacija između Mir-29b /c i DNMT3A je povezana s Epigenetske utišavanje od CDH1 gena, koji utječu na mobitel migraciju i invaziju na rak želuca. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10,1371 /journal.pone.0123926 pregled

Akademska Urednik: Rajeev Samant, Sveučilište Alabama u Birminghamu, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 4. rujna 2014; Prihvaćeno: 9 ožujak 2015; Objavljeno: 15. travanj 2015 pregled

Copyright: © 2015 Cui i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (Grant br 81171915, broj 91229107 i broj 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je drugi najveći smrtonosna maligna bolest u svijetu. To čini ukupno oko milijun novih slučajeva i 0,7 milijuna smrtnih slučajeva godišnje, od čega je više od 70% javlja se u zemljama u razvoju, posebno u istočno-azijskih zemalja [1]. Iako je izlječiv ako se otkrije rano, većina pacijenata GC su s krajem bolesti pozornice dijagnoze. U bolesnika s djelatnom bolesti, kirurškog zahvata i kombinacija kemoterapije naznačeno. Međutim, ukupna stopa preživljavanja pet godina GC pacijenata je manje od 30% [1, 2]. Naime, GC je često popraćena peritonejskom širenje i metastaze u regionalne limfne čvorove i udaljene organe putem limfnih i venskih žila [3]. Dakle, identificiranje molekularne aberacije u GC može poboljšati naše razumijevanje želučane karcinogeneze i pomoći nam podijeliti pacijenata u biološki i klinički relevantnim skupinama, kao i razvoj novih terapeutskih strategija.

mikroRNA (miRNAs) su klasa endogena, mali, nekodirajuće regulatorne RNA od oko 20-25 nukleotida koji negativno reguliraju ekspresiju gena inhibirajući prijevod ili izazivanje degradaciju mRNA putem sparivanja baza s 3 'netranslatirane regiji (3'UTR) ciljne messenger RNA (mRNA) [4]. Promijenjena razina ekspresije miRNAs zabilježeni su u mnogim raka i dovesti u ekspresiji ciljanih gena koji utječu na zloćudne, kao što su proliferacija, otpornost na apoptozu i metastaza [5-7]. Povećanje dokazi pokazuju da deregulirano miRNAs (npr Mir-17, Mir-129, Mir-148a i Mir-378) pridonose želučane karcinogeneze [8-10], što ukazuje na to da miRNAs bi se mogla koristiti kao dijagnostički i prognostički biomarkera u GC . pregled

Mir-29 obitelj (Mir-29) je sačuvana obitelj miRNAs koji uključuje Mir-29a /b /c. Smanjena ekspresija Mir-29 što je opisano u više vrsta raka, uključujući i GC [11-14]. Prethodne studije pokazuju da Mir-29 igraju dominantnu ulogu u GC staničnu proliferaciju, napredovanja staničnog ciklusa, apoptoze i pokretljivost stanica [14, 15]. Potencijalni ciljevi Mir-29 koji pridonose maligni GC fenotipom su Cdc42, CCND2 i MMP2 [14, 15]. Osim toga, neke studije su identificirani Mir-29s kao suradnika na regulaciji DNA metilacije ciljajući DNMT3s kod raka pluća [13]. Nadalje, nekoliko ciljnih gena, poput TCL-1, CDK6, laminin-1, i MCL-1, također su zabilježene u drugim raka [16]. Naime, unatoč dokazima koji pokazuju Mirna-29 može funkcionirati kao tumor-supresorski geni, jedna ključna pitanja koja se odnose na izrazu Mirna-29 i dalje djelomično neriješena. Koji su mehanizmi kontrole ekspresije Mirna-29 u GC stanicama? To je izvijestio da je c-myc je uključen u Mir-29a /b represije [17]. Identificiranje dodatnih mehanizama gašenje je od interesa. Pregled

Poznato je da su transkripcijski utišavanje tumorskih supresorskih gena (TSGs) s CpG otok Hipermetilacija je čest znak karcinogeneze. Zanimljivo, slična TSGs za kodiranje proteina, znatan broj miRNAs su regulirani promotor metilacije [18-20]. Zapravo, bilo je sve veći broj studija koje pokazuju da tumor supresorski miRNAs, kao Mir-34b, Mir-129, i Mir-124, često ušutkao metilacije DNA u GC [21-23]. Na temelju analize programa CpG Otok Searcher, naša predviđanja pokazala su da Mirna-29b /c sadrži CpG otoke u svojim pretpostavljenim regije promotora. Međutim, to još uvijek nije jasno da li je nenormalna DNK Hipermetilacija račune za poremećene regulacije Mir-29b /c. Osim toga, to je nepoznato da li postoji propis povratne informacije između Mir-29b /c i DNMT3s. U stvari, nema ranija istraživanja koja ispituju stanje metilacije Mir-29b /C u GC stanicama, a nitko nije istražio odnos između metilacije Mir-29b /c i razina izražavanja DNMT3s. U ovom istraživanju, otkrili smo da Mir-29b /c potisnuti izraz DNMT3A ciljajući svoju 3'UTR, što je doprinijelo inhibira migraciju GC stanica i invaziju. S druge strane, DNMT3A podregulirani miR-29b /c preko aberantni Hipermetilacija promotora. Dakle, potencijalni petlja povratne veze postoji između Mir-29b /c i DNMT3A, u kojem je dolje regulacija Mir-29b /c ukida suzbijanje DNMT3A. U međuvremenu, up-regulacija DNMT3A utječe na ekspresiju Mir-29b /C promotora metilacije. Ovi rezultati ukazuju na preklapanje između Mir-29b /c i DNMT3A. Njihova neravnoteža i deregulacija je uzrok strane epigenetičke mehanizam koji mogu biti uključeni u GC stanicama migraciju i invaziju karakteristikama.

Materijali i metode

stanična kultura pregled

GC stanične linije, uključujući AGS i BGC-823, dobiveni su iz stanične banke kineskog akademije znanosti i održavane u RPMI-1640 mediju s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 u /ml penicilina i 100 mg /ml streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), u vlažnom inkubatoru s CO 5% _{2 atmosfere na 37 ° C. pregled}

uzorci tkiva pregled

50 pari GC tkiva i njihovo susjedstvu non-kancerogen uzorci tkiva su prikupljeni između 2011. i 2013. s Jiangning bolnici u Nanjingu. Klinički podaci o bolesnicima s GC prikazana je u tablici S1. Istraživanje je odobreno od strane Odbora za Etičko pregled istraživanja na Jiangning bolnice u Nanjingu u Kini, a pacijenti potpisali informirani pristanak oblike. Svi uzorci tkiva dobiveni su od bolesnika s GC. Su prikupljeni tijekom operacije i odmah nakon toga brzinski zamrznute u tekućem dušiku do RNA i proteina ekstrakcije. Pregled

reakcije reverzne transkripcije i kvantitativne PCR u realnom vremenu (qPCR) pregled

Ukupna RNA je ekstrahirana iz stanica i tkiva dobivenih pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema uputama proizvođača. pregled

kako prepoznati izraz Mirna, matična petlje RT-PCR kao što je prethodno opisano [24], i U6 male RNA bila upotrijebljen kao internom kontrolom. qPCR je provedena pomoću SYBR premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Relativna ekspresija je procijenjena komparativne CT metode. Sekvencijama svakog gena prikazani su u tablici S2. Pregled

Western blot pregled

Western blot su provedena pomoću anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, Velika Britanija), anti-vimentin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) i anti- β pregled aktin antitijela (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), a za otkrivanje je izvedena uz Super signala kemiluminiscencijskim podloge (Pierce, Rockford, IL, USA). pregled

TRANSFICIRANJE pregled

mir-29b /c oponaša /inhibitori i negativne molekule Control (kontrola otimati oponašaju i inhibitora) su sintetizirani i pročišćeni uz GenePharma Društvo (Shanghai, Kina). Sekvence su prikazani u tablici S2. Su transfektirani u stanice u konačnoj koncentraciji od 50 nM, koristeći Lipofectamine-2000 transfekcijskog reagensa (Invitrogen, Carlsbad, USA) prema protokolu proizvođača. Medij je promijenjen nakon 6 sati. Stanice su uzgajane 48 sati, a prikupljene za analizu. Učinkovitost posto Transfekcija je određen procjenu razine Mir-29b /c izražavanja ili obaranje slijedi transfekcija (S1A i S1B sl). Protokol za utvrđivanje DNMT3A stabilnih obaranje stanice je opisana u našem prethodnom radu [25]. Izraz DNMT3A drastično se smanjio u BGC-shDNTM3A i AGS-shDNTM3A stanica (S1C sl) u odnosu na kontrolne stanice. Pregled

zacjeljivanje rana, migraciju i invaziju testovi pregled

Mobilnost stanica je bio podvrgnut rana zarastanja analize kao što je opisano [26]. Ogrebotina rana je generiran pomoću pipete 200 ul na staničnom sloju konfluentnih u šest jažica. Stanice su zatim isprane sa svježim medijem za uklanjanje plutajuće stanice i širenje zatvaranje rane uočeno je nakon 48 sati i fotografirane pod mikroskopom. Potencijal za migracije i invazije Stanice su ocijenjeni pomoću transjažična testom. Stanice su rasle do 70% -tne konfluencije i transfektirana 24 sata s miR-29b /c oponaša ili kontrolnih oponaša i inhibitor miR-29b /c inhibitora ili kontrole. U testu migracije stanice su uzgajane u 200 ml medija sa 1% fetalnog goveđeg seruma u gornju komoru koja nije obložena transjažična umetka. U donjoj komori, 600 ml medija s 10% fetalnog goveđeg seruma je korišten kao kemoatraktant potaknuti migraciju stanica. U testu invazije, gornja komora Transwell umecima su obložene s 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel i stanice su stavljene u gornje komore Matrigelom obloženu transjažična umetka (Millipore, USA). Nakon 24-satne inkubacije, ne-migrirajući, bilo ne-napada stanice nježno se uklanjaju pamučnom krpom. Svi odjeljci su obojeni pomoću 0,1% kristalno ljubičastog bojenje i broje na 5 polja u invertiranog mikroskopa. Nezavisni Eksperimenti su ponovljeni tri puta. Pregled

bisulfita genomske sekvenciranje (BGS) pregled

Genomska DNA bila je ekstrahirana iz stanica korištenjem metode fenol-kloroform. Bisulfit obrada je izvedena od CpGenome Universal DNA modifikacije Kit (Millipore, USA) prema uputama proizvođača. PCR produkti za bisulfita sekvenciranje pročišćene su na gelu, i subkloniraju u pMD19-T vektor sustavu (Takara, Dalian, Kina). Najmanje deset kolonija je sekvencirano procijeniti stupanj metilacije na svakom CpG lokaciji. Primeri su navedeni u tablici S2. Pregled

luciferaze Test pregled

protokol za ispitivanje luciferaze reporter je prethodno opisano [14]. 3'UTR ljudskog DNMT3A bila PCR amplifikaciju i kloniran između mjestima ne I i Xba od PGL-3 (Promega, USA). BGC-823 stanice bile su nacijepljene pri gustoći od 5 × 10 ^{5 po jažici u 12 jažica prije transfekcije. Stanice su transficirane s PGL-3 luciferaze krijesnice reportera (1 ug po jažici), pRL-TK (50 ng po jažici) i miR-29 imitira /inhibitora (50 nM) i negativne kontrolne oponaša /inhibitora (50 nM) pomoću Lipofectamine- 2000 transfekcijski reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) prema protokolu proizvođača. Aktivnost luciferaze ispitana je 48 sati nakon transfekcije pomoću Dual-Luciferase Assay System aktivnosti (Promega, SAD). Svi pokusi su izvedeni kao tri nezavisne ponavljanja. Pregled}

Statistička analiza pregled

Nezavisni Studentov t pregled -test je korišten za usporedbu rezultata, koji su izraženi kao srednja vrijednost ± sd između bilo koje dvije prethodno odabrano skupine. Da bi odredili korelacije između varijabli, je izračunata Pearson pregled je koeficijent korelacije. P pregled-vrijednost manja od 0,05 smatrala se statistički značajnom. Pregled

Rezultati

Mir-29b /c je potrebna i dovoljna za migracije GC stanica Netlogu

Prethodna istraživanja upućuju na to da mir-29b /c je kritična za invaziju GC stanica. Kako bi se dodatno procijeniti da li Mir-29b /c je odgovoran za migracije GC stanica, In vitro pregled ogrebotine zavoji za liječenje test i Transwell® test izvodi se. Nakon prolazno transfekciju Mir-29B /C oponaša ili negativnu kontrolu u BGC-823 stanica, zacjeljivanje rana testa su pokazali da su stanice s prisilnom izražavanja Mir-29b /c prikazana je posebno sporiji oporavak u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 1A). Slično tome, transjažice migracija ispitivanje pokazalo da je prekomjerna ekspresija miR-29b /C bio je povezan sa značajno manje migracijom od kontrole ( P pregled i 0,05, slika 1B). Osim toga, u skladu s drugim podacima u HGC-207 i MGC-803 GC stanicama [14], Mir-29b /c Prekomjerna ekspresija stanice su također pokazali značajno smanjenje invazivnih sposobnosti u testu invaziju u Matrigel ( P izvoznici <0,05, slika 1C). Ovi rezultati ukazuju da miR-29b /c nije važan samo zbog narušavanja GC stanice, ali također za stanične migracije. Da dodatno potvrđuju Supresivni učinci miR-29b /C na migraciju GC stanice i invaziju, BGC-823 stanice su transfecirane sa inhibitorima miR-29b /c ili negativna kontrola. Brisanje Mir-29b /C znatno povećao selica i invazivne sposobnosti GC stanica, koje se procjenjuje zacjeljivanje rana (Slika 1D) i prerastanja testu ( P izvoznici < 0.05, Slika 1E i sl 1F). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da Mir-29b /c učinkovito ukida migraciju GC stanica i invaziju, koji, dakle, važne pretpostavke za rani fazama malignog progresijom GC. Pregled

DNMT3A je izravna transkripcije meta Mir-29b /c u GC pregled

Da bismo razumjeli mehanizam u pozadini učinak Mir-29b /c na migraciju stanica i invazije, istražili smo ciljeve Mir-29b /c. DNMT3A 3'UTR je komplementarna Mir-29b /c, a izravna meta gen Mir-29b /c, tako smo proveli jedan reporterski test u BGC-823 stanicama. DNMT3A mRNA 3'UTR je umetnut u donji regiju reporterskog gena iz PGL-3 vektor (naime DNMT3A 3'UTR-Luc). Konstrukti su zatim transfektirano s PRL-TK i Mir-29b /c oponaša ili negativne kontrole oponaša u BGC-823 stanicama. Kao što je prikazano na slici 2A, relativna aktivnost luciferaze je značajno smanjena u PGL-3 vektora s DNMT3A 3'UTR ( P pregled i 0.05). Međutim, konstrukti kotransficiranim s inhibitorom /c miR-29b ne utječe na aktivnost luciferaze od PGL-3 vektora s DNMT3A 3'UTR usporedbi s konstruktima transfektirano s inhibitorom negativne kontrole (Slika 2B). Kako bi se dodatno potvrditi ovu Mirna-ciljnu interakciju, kvantitativna RT-PCR (QRT-PCR) i zapadne mrlje su provedena kako bi potvrdili regulaciju DNMT3A po Mir-29b /c. Mi brzo transfektirane Mir-29B /C oponaša ili negativne oponaša kontrolu u BGC-823 stanicama. Povećana Mir-29b /c smanjuje ekspresiju DNMT3A na mRNA (slika 2c) i na razini proteina (Slika 2e, lane1-3). Obrnuto, miR-29b /c podregulaciji njegove inhibitora povećava ekspresiju DNMT3A na mRNA (Slika 2D), i na razini proteina (Slika 2e lane4-6). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da DNMT3A je direktni transkripcije meta Mir-29b /c, a negativno povezana s Mir-29b /c izražavanja u GC stanicama. Pregled

Mir-29b /c je potisnut od strane DNMT3A u DNA metilacije način ovisan o pregled

S obzirom da je nenormalna Hipermetilacija je kritična za Mirna dolje regulacije, možemo nagađa da postoji negativna povratna veza između mir-29b /c i DNMT3A. Da bi testirali tu hipotezu, prisutnost CpG otoku metilacije u području promotora Mir-29b /c je ocijenjena od strane BGS analize u stanicama DNMT3A-obaranje. Kao što je prikazano na slici 3A, 7 pojedinačnih CpG mjesta unutar CpG područja otoka (5 kb uzvodno od Mir-29b /c) su sekvencionirani identificirati metilirani citozina ostataka. Učestalost miR-29b /c promotora metiliranjem u DNMT3A-obaranje stanicama bila je 34,2%, što je znatno manji od kontrolne stanice (58,6%; Slika 3B). Ovaj rezultat pokazuje da je transkripcijski utišavanje Mir-29b /C u GC stanicama povezana s prisutnošću CpG otoku Hipermetilacija, što je potvrdio mjerenjem zrele Mir-29B /C QRT-PCR. Tu je značajno povećao ekspresiju Mir-29b /c u AGS-shDNMT3A i BGC-shDNMT3A stanica u usporedbi s njihovim kontrolama (Slika 3c). Ovi rezultati ukazuju na značajnu molekularne osnove miR29-b /c dolje regulacije, te podupiru hipotezu da postoji interferencija između Mir-29b /c i DNMT3A. Pregled

DNMT3A potiče migraciju GC stanica pregled

molekularna veza između mir-29b /c i DNMT3A postavio pitanje DNMT3A uključivanja u migraciji GC stanica. Mi i dalje primjenjuje in vitro
testovima za određivanje funkcionalne promjene u ponašanju stanica sljedeće promijenjena ekspresija DNMT3A. Test zavoji za liječenje pokazali su značajno sporiji oporavak u BGC-shDNMT3A stanica u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 4A, Top), ali samo skroman oporavak u AGS-shDNMT3A stanica u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 4A, dolje). Ovi rezultati pokazuju da DNMT3A važna za pokretljivost stanica. S obzirom da je za staničnu adheziju molekule važne za motilitet stanice, ekspresija CDH1 i vimentin ispitana su QRT-PCR i Western blot. Obaranje DNMT3A izražavanja znatno povećao ekspresiju CDH1 na oba mRNA i proteina razinama, ali nisu imali znatan učinak na ekspresiju vimentin (slika 4b i 4c), što upućuje da CDH1 može biti meta DNMT3A posredovanog regulacijom stanice pokretljivost. Osim toga, proveli smo BGS testa na genu CDH1 u stanicama DNMT3A-obaranje. Kao što je prikazano na slici 4D, postotak metilnog CpGs nalaze unutar CDH1 je bilo niže u stanicama DNMT3A iscrpljena nego u kontrolnim stanicama (35.8% naspram 94.1%). Ovi rezultati pokazuju da je nenormalan izraz DNMT3A dovodi do epigenetičke odsutnost CDH1. Pregled

Mir-29b /c sudjeluje u suzbijanju CDH1 Netlogu

Kako bi se dodatno istraži djelovanje promijenjen miR- 29b /c izraz CDH1, mi brzo transfektirane Mir-29b /c oponaša ili negativna kontrola oponašati u BGC-823 stanicama. U usporedbi s kontrolama, prisilno ekspresijom Mir-29b /C značajno povećava ekspresiju CDH1 na razini mRNA i proteina (Slika 4e i 4f). Nakon toga, pod metilacijskom status promotorske regije CDH1 ispitana pomoću BGS test u Mir-29b /c oponaša ili negativna kontrola oponašaju transficiraju BGC-823 stanica. Rezultati su pokazali da je učestalost CDH1 promotora metilacije u Mir-29b /c Prekomjerna ekspresija stanica bio je 5,2% ili 12,9%, što je znatno niže od razine izmjerene u kontrolnim stanicama (88.2%; Sl 4G). Ovi podaci su u skladu s rezultatom da DNMT3A obaranje posreduje regulaciji CDH1 i pokazuje da je de-regulacije Mir-29b /c i DNMT3A su uključeni u migraciji GC stanice i invaziju. Pregled

smanjena ekspresija Mir-29b i Mir-29c u GC tkiva pregled

izraz Mir-29b /C u 50 GC tumora i upareni ne-tumorskim tkivima ispitana je QRT-PCR. U usporedbi s uparenim ne-tumorskih tkiva, učestalost Mir-29b i Mir-29c-dolje reguliranje (definirano kao više od dva puta manja) bio je 66% (33/50) i 60% (30/50), odnosno (slika 5A i 5B). Prosječna promjena puta od Mir-29b i Mir-29c bila je značajno niža u tumorskim tkivima nego u ne-tumorskih tkiva ( P izvoznici < 0.01, slika 5C i 5D). Kako bi istražili kliničkopatološkim značaj Mir-29b i Mir-29C izraz uzoraka u GC tumorigenezi, analizirani su klinička obilježja GC pacijenata. Sve 43 bolesnika analizirani su svrstane u dvije skupine prema Mir-29b i razinama ekspresije Mir-29C. Smanjena Mir-29b snažno korelira sa stupnjem tumorskih stanica diferencijacije i invazije, dok je smanjena Mir-29C samo u korelaciji s invazijom tumora (tablica 1). Osim toga, odnos između Mir-29b /c izražavanja i DNMT3A izražavanja je ispitan u 33 GC slučajevima. Jedna studija pokazala je da udruga DNMT3A izraz negativno povezana sa Mir-29b ( R pregled = -0,640, P izvoznici < 0,01, slika 5E) i Mir-29c ( R
= -0,349, P izvoznici < 0.05, Slika 5F). Zajedno, ovi podaci pokazuju da je Mir-29b /c može igrati važnu ulogu u progresiji želučane karcinogeneze. Pregled

Rasprava pregled

očuvan Mir-29 obitelji, uključujući i Mir-29a, miR- 29b i 29c miR-, umješan je u nekoliko podrum procesima, kao što je proliferacija, diferencijacija, apoptozu i metastaza, što ih dobro analizirani obitelj miRNAs u tumorogenezi [16]. Prethodna istraživanja su pokazala da povećana ekspresija Mir-29a povezan s boljim ukupnim postotkom preživljavanja u fazi II raka debelog crijeva pacijenata [27] i niže razine Mir-29b može promovirati raka prostate metastaza regulira prijelaz signalnih putova epitelne-mezenhimalne [28] , Osim toga, miR-29C djeluje kao supresor metastaza koji inhibira adheziju stanica raka pluća s ekstracelularnog matriksa i migracije in vitro
i in vivo pregled [29]. U GC, znatno smanjene razine Mir-29b i Mir-29c, a osobito su promatrane u odnosu na Mir-29a [14], što upućuje da je Mir-29b /c može igrati važniju ulogu. Tako, miR-29b /c je izabran za analizu u ovoj studiji. U ovom istraživanju, pokazali smo povećan Mir-29b /c potiskuje migraciju i invaziju BGC-823 stanicama koristeći zacjeljivanje rana testa i testa bunara. Ovi rezultati su u skladu s drugim prijavljenim podacima dobivenim iz SGC-7901, HGC-27 i MGC-803 GC stanicama [14, 15]. S obzirom da je Mir-29b /c također igraju ulogu u proliferaciji i apoptozi u GC, procjenjuje sposobnost rasta stanica i razine staničnog apoptoze u BGC-823 stanicama. Rezultati su pokazali da nema razlike u proliferaciji na 48 sati za Mir-29b /c oponaša ili inhibitori transficiranih stanica u usporedbi s negativnim kontrolnim stanicama ( P izvoznici > 0,05, S2A i S2B sl). Nadalje, Annexin V-bojenje nije pokazala značajan porast razine apoptoze u miR-29b /c oponaša-transficiranim stanicama nakon 48 sati inkubacije (S2C sl). Osim toga, analiza staničnog ciklusa ne pokazuje značajne razlike u G1, S, G2 /M faze nakon tretmana sa Mir-29b /C oponaša ili negativnih oponaša kontrole za 48 sati ( P izvoznici > 0,05, S2D Slika). Ovi podaci ukazuju na to da Mir-29b /c usporava zacjeljivanje oporavak područja u 48 sati, uglavnom zbog smanjene sposobnosti pokretljivost stanica.

miRNAs vrše svoje funkcije uglavnom ciljaju 3'UTR različitih gena. Međutim, detaljni molekularnih mehanizama Mir-29b /c koji se odnose na maligni razvoj GC slabo razumio. Naime, Mir-29b /c dijeli isti komplementarnost s mjesta u 3'UTR DNMT3A, koji je bio predviđen ciljnih predviđanja programa, uključujući TargetScan, Miranda i miRBase. Još uvijek nije poznato da li Mir-29b /c regulira nenormalan metilacije gena povezanih s metastazama interakcijom s DNMT3A tijekom razvoja GC. Dakle, Izvršili smo luciferaze test i otkrili da je visoka DNMT3A ekspresija je povezana s niskim Mir-29b /c izražavanja u GC stanicama, što ukazuje DNMT3A je izravna transkripcije meta Mir-29b /c. Međutim, molekularna osnova koja dovodi do neravnoteže Mir-29b /c na GC ostaje nepoznat. Mir-29 proksimalnih promotori su vezna mjesta za nekoliko transkripcijskih faktora, kao što su c-myc i CEBPA koje doprinose deregulacije Mir-29 [30, 31]. Međutim, istraživanja na epigenetičke regulaciju Mirna-29 nije bio prijavljen. Pregled

U eukariotskim stanicama, postoje tri enzimski aktivni DNA methyltransferases (DNMTs), DNMT1, DNMT3A i DNMT3B. Ekspresija DNMT3A u GC je značajno veći od onoga DNMT3B [32, 33]. Štoviše, samo povećana ekspresija DNMT3A značajno je povezana s kraćim bez bolesti razdoblja preživljenja u GC [34], što ukazuje DNMT3A ima više važnu ulogu u želučanom karcinogeneze. Dakle, željeli smo istražiti je li postoje negativni feedback propisi između Mir-29b /c i DNMT3A. U ovom istraživanju koristili smo BGS test za analizu stanja DNA metilacije Mir-29b /C u DNMT3A RNAi GC stanicama. Doista, smanjena Mir-29b /c je dijelom i zbog DNMT3A posredovanog Hipermetilacija. Nadalje, utvrdili smo da DNMT3A sudjeluje u promicanju migracije GC stanica putem dolje reguliraju CDH1. U međuvremenu, mi također pokazali da Mir-29b /c sudjeluje u suzbijanju CDH1. Glavna značajka metastaza raka je gubitak CDH1 ekspresije [35] i Hipermetilacija unutar promotorske regije CDH1 je opaženo kod GC [36]. Dakle, naši rezultati pokazuju da su i Mir-29b /c i DNMT3A su povezane s CDH1 dolje regulacije kroz DNMT3A posredovane promotora Hipermetilacija. Uloga drugih DMNTs, na primjer DNMT3B, u reguliranju Mir-29B /C treba ispitati u budućim istraživanjima. Pregled

U GC primjeraka, ispitali smo izraz uzorak Mir-29b /C u 50 parova GC tkiva. Smanjena Mir-29b /c (sjedeća promjena granična: 2,0) je značajno povezana s diferencijacijom i invazije stupanj u GC, što sugerira da je Mir-29b /c igra ključnu ulogu u GC malignih održavanje i neposredno pokazuje klinički značaj MIR -29b /C u GC napredovanje. Ukratko, naša studija pokazuje da postoji svibanj biti cross-talk između Mir-29b /c i DNMT3A. Neravnoteža tih čimbenika može biti uključeni u GC migraciju i invaziju fenotipova. Ova neravnoteža može uključivati ​​izraz niske razine Mir-29b /c mogla ukinuti potiskivanje DNMT3A i visoke razine DNMT3A dodatno utječe na ekspresiju Mir-29b /C epigenetičku mehanizam. Ovi rezultati mogu biti koristan za razvoj novih mogućnosti liječenja za GC koji ciljaju Mir-29B /C, a njegov nizvodno gena DNMT3A. Pregled

popratne podatke pregled S1 slici. Učinkovitost postotak Transfekcija je određeno vrednovanje razine Mir-29b /c ili DNMT3A. Pregled (A i B) QRT-PCR za otkrivanje relativnog izraz Mir-29b /C u BGC-823 stanica sa oponaša (A) ili inhibitori (B) nakon 48 sati transfekcije. (C) RT-PCR i Western mrlje su kako bi se otkrio učinkovitost DNMT3A obaranje na BGC i AGS stanica. β-aktin pregled je korišten kao kontrola za punjenje pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s001 pregled (TIF) pregled S2 Sl. Uloga Mir-29b /c na proliferacije BGC-823 stanice, apoptoze i staničnog ciklusa. Pregled (a) stope rasta stanica Mir-29b /c prekomjerne ekspresije su detektirani CCK-8 proliferacije testu. Mir-29b /c prekomjerna ekspresija nije pokazao izuzetnu razliku u 48 sati u usporedbi s negativnim kontrolnim stanicama ( P izvoznici > 0,05). (B) Na rast stanica Mir-29b /c inhibicije su detektirani CCK-8 testom proliferacije. Suzbijanje Mir-29b /c ne pokazuje značajne promjene u 48 sati u usporedbi s negativnim kontrolnim stanicama ( P izvoznici > 0,05). (C) Test apoptoze ne pokazuju dramatičnu indukciju apoptoze miR-29b /c prekomjernom ekspresijom na 48 sati u usporedbi s negativnim kontrolnim stanicama. Biparametric Histogram prikazuje stanicu u ranoj (donjem desnom kvadrantu) i kasno apoptoze stanja (gornji desni kvadrant). (D) Test staničnog ciklusa izvedena je protočnom citometrijom na BGC-823 stanica nakon miR-29b /c oponaša i negativne kontrole imitira tretmana 48 sati. Postoci stanica Mir-29b /c Prekomjerna ekspresija i kontrole u G1, S i G2 /M prikazani su u bar chart kao srednja vrijednost ± s.d. tri neovisna pokusa. U usporedbi s kontrolnim stanicama, nije bilo značajnog učinka na stanični ciklus nakon Mir-29b /c prekomjernom ekspresijom pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s002 pregled (TIF) pregled S1 Način. stanični rast i apoptozu Test pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s003 pregled (DOC) pregled S2 metoda. . Staničnog ciklusa Test pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s004 pregled (DOC) pregled S1 stol. Klinička obilježja bolesnika s karcinomom želuca pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s005 pregled (DOC) pregled S2 stol. . Mirna oponašaju i inhibitora sekvenci i primera koji se koriste u ovom istraživanju pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006 pregled (DOC) pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo dr Gang Chen iz Nanjing Jiangning bolnica za prikupljanje uzoraka. Zahvaljujemo prof Sheng Zhong s medicinskog sveučilišta kapitala za pomoć mijenjati rukopis. Pregled

• PLoS ONE: Chrysin Koči tumorske Promoter izazvan MMP-9 izraza blokiranjem AP-1 preko suzbijanje ERK i JNK ciklusa u želudac stanica raka
• PLoS ONE: Utjecaj iskorjenjivanje Helicobacter pylori na ekspresiju razinama FHIT, IL-8 i P73 u sluznici želuca iz prvog stupnja u rak želuca bolesnika