PLOS ONE: intratumorale Hypoxie favorise la tolérance immunitaire par Induire T régulatrices des cellules via TGF-β1 dans le cancer gastrique

Résumé

Cellule de réglementation de T (Treg) médiée immunosuppression représente l'un des mécanismes d'évasion immunitaire tumorales cruciale et est un obstacle majeur pour l'immunothérapie tumorale réussie. Hypoxie, une caractéristique commune des tumeurs solides, a été associée à l'immunosuppression potentialisée, une diminution de la réponse thérapeutique, la progression maligne et l'invasion locale. Malheureusement, le lien entre l'hypoxie et la tolérance immunitaire à médiation Treg dans le cancer gastrique reste mal comprise. Dans notre étude, Tregs et de l'hypoxie inducible factor-1α se sont révélés être en corrélation positive avec l'autre et ont augmenté avec la progression de la tumeur. A in vitro
étude subséquente a indiqué que les surnageants provenant de cellules de cancer gastrique dans la condition hypoxique, peut induire l'expression de Foxp3 par le TGF-β1. Ces résultats ont confirmé le rôle crucial des Tregs comme cible thérapeutique dans le traitement du cancer gastrique et ont fourni des pensées utiles pour la conception de l'immunothérapie pour le cancer de l'estomac à l'avenir

Citation:. Deng B, Zhu JM, Wang Y, Liu TT, Ding YB, Xiao WM, et al. (2013) intratumorale Hypoxie favorise la tolérance immunitaire par Induire T régulatrices des cellules via TGF-β1 dans le cancer gastrique. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10.1371 /journal.pone.0063777

Editeur: Nupur Gangopadhyay, Université de Pittsburgh, États-Unis d'Amérique

Reçu: 10 Janvier 2013; Accepté 6 Avril 2013; Publié: 27 mai 2013

Droit d'auteur: © 2013 Deng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenu par la Commission de Shanghai science and Technology (10410709400, 10411950100), national Nature science Foundation de Chine (81000968, 81101540, 81101637 et 81172273) et la clinique clé Sujet spécial national de Chine. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique représente l'une des causes les plus fréquentes de décès liés au cancer dans le monde [1]. En dépit des progrès significatifs dans les approches diagnostiques et thérapeutiques au cours des dernières décennies, le pronostic du cancer gastrique reste mauvais en raison de sa forte récidive et de métastases [2]. Immunocytes sont reconnus depuis longtemps comme la croissance tumorale de facteur favorisant dans le microenvironnement de la tumeur [3], cependant, la base moléculaire sous-jacente reste largement énigmatique. Une meilleure compréhension des mécanismes dans le cancer gastrique sera bénéfique de développer des programmes thérapeutiques efficaces.

intratumorale hypoxie est une caractéristique commune des tumeurs solides, ce qui pourrait influer sur la progression des tumeurs en activant les voies biochimiques et cellulaires clés [4 ], [5], [6]. Des études ont également montré que l'hypoxie joue un rôle essentiel dans la suppression immunitaire induite par la tumeur, ce qui contribue à maintenir l'échappement immunitaire des tumeurs [7], [8]. Récemment, un lien confirmé entre l'hypoxie tumorale et la tolérance immunitaire par le recrutement de lymphocytes T régulateurs (Tregs) a été établi dans le cancer de l'ovaire [9]. Ainsi, une hypothèse a été présentée que l'hypoxie peut fournir des obstacles pour les interventions immunitaires thérapeutiques.

Augmentation de Tregs ont été rapportés dans les tissus de la circulation et de la tumeur des patients atteints de divers cancers, dont le cancer gastrique, le cancer colorectal, le carcinome hépatocellulaire et le cancer du pancréas [10]. Les données accumulées indiquent également que la présence de lymphocytes T régulateurs a donné lieu à un risque accru pour la progression du cancer [11], [12], [13]. En outre, l'immunosuppression induite par Treg est considéré comme l'un des mécanismes d'évasion immunitaire cruciaux dans la tumeur de sorte qu'elles sont capables de surmonter l'activité anti-tumorale des cellules T CD8 cytotoxiques, les cellules dendritiques et les cellules tueuses naturelles [14]. Ainsi, élucidation du mécanisme sous-jacent de l'enrichissement Treg dans le cancer gastrique sera utile pour le ciblage Tregs pour un résultat clinique bénéfique. Bien que les mécanismes ne sont pas bien compris, certaines études ont montré que le TGF-β1 est impliqué dans ce [15].

Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que le cancer gastrique peut acquérir un avantage sélectif par induction des Tregs sous hypoxie via la voie de signalisation TGF-β1 éludant ainsi la surveillance immunitaire. Pour démontrer notre hypothèse, nous avons analysé l'expression de l'hypoxie facteur 1α inductible (HIF-1α) et Foxp3 dans les tissus du cancer de l'estomac, a évalué l'effet de l'hypoxie sur la production de TGF-β1 dans les lignées cellulaires du cancer, et enfin élucidé le rôle de l'hypoxie médiatrice enrichissement Treg dans le cancer gastrique.

Matériel et méthodes

patients et Specimens

paraffine, coupes de tumeur fixés au formol ont été obtenus à partir de 99 patients atteints de cancer gastrique qui ont subi la chirurgie résection de Décembre 2006 à Février 2008 à la deuxième école de médecine clinique de l'Université de Yangzhou. Les données de suivi ont été résumés comme d'Octobre de 2012 avec un suivi médian de 53 mois (extrêmes 4-70 mois). La survie globale (OS) a été défini à partir du moment de la chirurgie pour durer le suivi ou le moment de la mort.

échantillons de sang périphérique ont été prélevés sur 20 patients atteints de cancer gastrique un jour avant et 10 jours après la chirurgie de Juillet 2012 à Octobre 2012. Les sérums ont été congelés à -80 ° C immédiatement après centrifugation pour une utilisation future. Des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) ont été isolées immédiatement par un gradient de densité de Ficoll.

Aucun des patients avaient reçu des médicaments immunosuppresseurs ou une chimiothérapie avant la résection chirurgicale. L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique (Comité d'éthique de la deuxième école de médecine clinique de l'Université de Yangzhou, Yangzhou), et par écrit le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants à l'étude.

immunohistochimique Coloration

sections de série (5 um) de spécimens enrobés de paraffine fixés au formol ont été faites. Les coupes ont été déparaffinées et réhydratées dans l'alcool gradué. La récupération d'antigène a été réalisée en traitant les lames dans du tampon EDTA dans un micro-ondes pendant 10 minutes. Lapin anticorps anti-humain HIF-1α primaire (Bioworld, États-Unis), la souris anti-anticorps humain TGF-β1 (Santa Cruz, USA) et de la souris anticorps Foxp3 anti-humain (Abcam, USA) ont été utilisés pour les anticorps primaires. Diaminobenzidine (DAB) a été utilisé pour le substrat suivant contre-coloration à l'hématoxyline pour la coloration unique. Double coloration a été réalisée avec 2 chromogènes différents:. Chromogène DAB (couleur marron) pour HIF-1α et chromogène rapide rouge (couleur rouge) pour le TGF-β1 ou Foxp3

immunoréactivité Scoring

HIF -1α noyau coloration a été évaluée selon la méthode décrite [16], le score de coloration = intensité de immunoréactivité des cellules colorées positivement (IR) × proportion de. intensité IR a été stratifié en quatre catégories: 0, pas d'IR; 1, faible IR; 2, IR modérément forte; et 3, forte IR. La proportion de cellules positives ont été classées en cinq groupes: 0, pas de coloration; 1, < 2% coloration; 2, 2-10% de coloration; 3, 11-29% de coloration; et 4, >. 30%

Un système de notation de coloration modifiée a été utilisée pour Foxp3 ^{+ cellules [17]. Dix champs ont été comptées à haute puissance pour Foxp3. Le nombre absolu de lymphocytes par champ à haute puissance (HPF 400) a été déterminée. Le nombre moyen de cellules colorées positives par des champs de forte puissance a été calculée.}

Culture cellulaire et hypoxie Induction

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine, AGS et BGC823, ont été obtenus à partir de l'Institut de Shanghai de Cell Biologie, Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Toutes les cellules ont été propagées dans 5% de CO _{2 à 37 ° C dans du milieu DMEM ou RPMI 1640 (Hyclone Tianjin, Chine) supplémenté avec 10% de FBS (Gibco, Australie), 100 U /ml de pénicilline et 100 mg /ml de streptomycine ( HyClone Tianjin, Chine). Pour les expériences de l'hypoxie, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, lavées deux fois avec du PBS lorsqu'elles ont atteint 60-80% de confluence, maintenue dans un milieu sans sérum AIMV (Invitrogen, USA) pour une incubation pendant une nuit, puis placée dans un système modulaire chambre de l'incubateur (Ruskinn Works, YK) pendant 24 h sous hypoxique (1,0% O 2) ou normoxique (21% O 2) les conditions, à la fois avec 5% de CO 2 à 37 ° C. Les surnageants ont été recueillis et stockés à -80 ° C pour la détermination ultérieure des concentrations de TGF-β1 pour le dosage et co-culture. Tous les in vitro
expériences de validation ont été effectuées au moins trois fois.}

immunofluorescence

Les cellules (1 x 10 ^{5 /puits) ont été plaquées sur des lamelles dans un plaque de 24 puits pour une culture de 24 h. Par la suite, elles ont été fixées dans du methanol froid pendant 30 min à perméabilisées avec 0,5% de Triton X-100 pendant 30 min. Les cellules ont été lavées trois fois, bloqué par 10% de sérum de chèvre dans du PBS pendant 30 min et mises en incubation avec un anticorps de TGF-β1 anti-humain (Santa Cruz, USA) et de l'anticorps HIF-1α anti-humain (Epitomics, États-Unis) dans un congélateur à 4 ° C jusqu'au lendemain. L'anticorps primaire a été détectée par l'intermédiaire respectivement Alexa488 conjugué second anticorps (Invitrogen, USA) et Alexa Fluor second anticorps 594-conjugué (Invitrogen, USA). Les lamelles ont été examinées sous OLYMPUS florescence microscopie.}

Extraction ARN et quantitative PCR en temps réel (qPCR)

Chacune des deux lignées cellulaires décrites ci-dessus a été cultivée dans des puits en triple dans normoxique ou conditions hypoxiques , comme décrit ci-dessus. L'ARN total a été immédiatement isolé à partir de cellules normoxiques ou hypoxiques à la fin de l'expérience, en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, USA). L'ARN total (5 ng) a été transcrit de manière inverse en utilisant des kits d'ADNc après transcription inverse (Takara, Dalian, Chine), selon les instructions du fabricant. qPCR a été menée dans un SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Dalian, Chine). Pliez les changements dans l'expression de chaque TGF-β1 ARNm par rapport à GAPDH ont été calculés en fonction du cycle seuil (Ct) que 2 ^{-Δ (ACt), où ACt = Ct _{target - Ct GAPDH et Δ (ACt) = ACt hypoxie - ACt normoxie. Les amorces TGF-ß1 étaient: avant, 5'-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 '; inverse, 5'AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC-3 ', et les amorces GAPDH étaient: avant, 5'GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3'; inverse, 5'-GGTGT CGCTG TT GAAGT CAGAG-3 '. qPCR a été réalisée en triple.}}

immuno-enzymatique (ELISA)

La concentration de TGF-β1 dans les surnageants de culture et de sérums a été déterminée en utilisant un kit ELISA (eBioscience, San Diego, CA) selon les instructions du fabricant.

Isolement et culture de cellules T

PBMC provenant de donneurs ont été indirectement marqués avec de la biotine-anticorps bocktail et microbilles anti-biotine. CD4 cellules ^{+ T ont été séparés par une sélection négative selon les instructions du fabricant (Miltenyi Biotec, Allemagne). CD4 + cellules T ont été directement marqué avec CD25 micro-billes et CD4 + CD25 - les cellules T ont été isolées par sélection négative selon les instructions du fabricant (de pureté > 95%; Miltenyi Biotec, Allemagne) . Les surnageants collectés à partir de cellules AGS cultivées sous normoxique ou conditions hypoxiques ont été dilués avec du milieu frais AIMV (01h03), appelé milieu normoxique et hypoxique moyen, respectivement. Un total de 1,0 x 10 6 /ml de CD4 + CD25 - les lymphocytes T ont été stimulés par un anti-CD3 /perles de CD28 revêtues (1:05; Invitrogen, Etats-Unis) ± IL-2 (200 U /ml; PEPROTECH) pour 72 h dans AIM-V (milieu de commande sans sérum), le milieu normoxique ou hypoxique moyen. Dans certaines expériences, le TGF-β1 humaine recombinante (2 ng /ml; R & D Systems, USA) et inhibiteur de la kinase du récepteur de TGF-β1 LY-364947. (5 uM, Merck, Allemagne) ont été ajoutés aux cultures}

cytométrie de flux

analyse phénotypique des Tregs a été réalisée avec un BD FACS AriaII cytomètre de flux (BD, USA). En bref, les cellules ont été marquées avec FITC et CD4-PE Foxp3 (eBioscience, San Diego, CA) selon le protocole du fabricant. Pour analyser la prévalence des Tregs, CD4 ^{+ Foxp3 + cellules T ont été évalués après fenêtrage CD4 + cellules T et ont été exprimés en pourcentage du total CD4 + cellules T.}

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées sur SPSS 17.0 pour Windows. Les différences entre les groupes ont été analysées à l'aide d'une ANOVA à une voie, Mann-Whitney U test ou de χ ^{2 test, le cas échéant. La corrélation a été examinée par une corrélation de Pearson. temps de survie cumulé a été calculé par l'intermédiaire de Kaplan-Meier et analysé par le test du log-rank. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± SEM. La signification statistique a été fixé à P
<. 0.05}

Résultats

HIF-1α et Foxp3 expression dans le cancer gastrique Tissues

Après confirmation histologique de l'estomac cancer (Fig. 1A, en haut à gauche et en bas à gauche), nous avons étudié l'expression de HIF-1α et Foxp3 par immunohistochimie dans 99 patients. HIF-1α avec une faible expression (Fig. 1A, en haut) et une forte expression (Fig. 1A, vers le bas) a été trouvée principalement dans le cytoplasme et le noyau des cellules cancéreuses à la marge de la tumeur, et que la coloration de HIF-1α nucléaire a été marqué. Il est intéressant de noter que, dans certains cas, les lymphocytes ont également montré une forte expression de HIF-1α. Foxp3 avec une faible expression (Fig. 1A, à droite en haut) et une expression élevée (Fig. 1A, en bas à droite) a été observée dans le noyau des lymphocytes, dont la plupart étaient situés à la marge de la tumeur.

Suivant les expressions de HIF-1α et Foxp3 dans les tissus tumoraux ont été comparés chez des patients souffrant non métastatique (n = 52) ou métastatique (n = 47), le cancer gastrique. Tant le score moyen de HIF-1α et le nombre de Foxp3 Les cellules ^{+ chez les patients métastatiques était plus élevé que chez les patients non métastatiques (HIF-1α, 7,69 ± 0,45 vs 5,41 ± 0,40, P
< 0,001 , la figure 1B, à gauche;. Foxp3, 14,61 ± 1,01 vs 8,07 ± 0,95, P
< 0,001, figure 1B, droite)}

relation entre OS et HIF-1α ou Foxp3.. dans le cancer gastrique Tissues

au dernier suivi, 50 des 99 (50,5%) patients étaient en vie, avec un suivi médian de 64 mois (extrêmes 57-70), alors que 49 sont morts de la maladie , avec un temps médian jusqu'à la mort de 28 mois (extrêmes 4-64). Pour élucider la relation entre l'expression de HIF-1α ou Foxp3 et OS, HIF-1α a été classé comme négatif (n = 34; scores ≤4) ou positif (n = 65; scores > 4), tandis que Foxp3 a été classé comme faible (n = 51F) ou élevée (n = 48) en utilisant le nombre moyen (8,6 cellules /HPF) que la fréquence de coupure. Dans notre étude, OS Foxp3-bas groupe était significativement plus élevée que dans Foxp3 haut groupe ( P
= 0,017, Fig. 1C, à gauche), tandis que le groupe HIF-1α négatif était significativement plus élevé que le HIF -1α positif groupe ( P
= 0,009, Fig.1C, droite).

Association entre HIF-1α ou Foxp3 et caractéristiques clinicopathologiques

La corrélation entre les caractéristiques clinico et l'expression de HIF-1α ou Foxp3 a ensuite été évaluée (Tableau 1). Aucune corrélation n'a été trouvée entre HIF-1α ou l'expression de Foxp3 et l'âge ou le sexe des patients, ainsi que la taille de la tumeur. Cependant, il y avait une augmentation du taux positif de HIF-1α avec la profondeur de l'invasion tumorale ( P = 0,013
). Une tendance similaire a été observée entre l'expression de HIF-1α ( P
< 0,001) ou Foxp3 ( P
= 0,008) et le stade de la tumeur. En outre, une corrélation significative a été trouvée entre les métastases des ganglions lymphatiques et l'expression de HIF-1α ( P
= 0,029) ou Foxp3 ( P
< 0,001)

. relation entre HIF-1α et Foxp3 ou TGF-β1 dans le cancer gastrique Tissues

le résultat immunohistochimique mentionné ci-dessus indique que les cellules du nombre de Foxp3 ^{+ était d'une forte corrélation positive avec le score de HIF-1α chez les patients présentant des métastases (r = 0,772
, P
< 0,001;. la figure 2A, à gauche), mais pas chez les patients sans métastase ( r = 0,461
, P
= 0,001;. la figure 2A, à droite). Nous avons ensuite procédé à double coloration immunohistochimique pour évaluer la présence d'une co-expression de HIF-1α entre et Foxp3 ou de TGF-β1. Les résultats montrent que Foxp3 + cellules se rassemblent principalement dans les sites proches de la région de la tumeur hypoxique à l'expression de HIF-1α haute (Fig. 2B). En outre, la plupart des cellules tumorales de HIF-1α élevés étaient une expression élevée de TGF-β1 (Fig. 2C).}

Circulating Tregs et TGF-β1 Pré-chirurgie et post-chirurgie patients

Pour les cellules d'élucider la relation entre les lymphocytes T régulateurs et la concentration de TGF-β1 dans le sérum, le CD4 ^{+ Foxp3 + T ont été analysés chez des patients atteints d'un cancer gastrique par cytométrie en flux (Fig. 3A). La fréquence des Tregs avant la chirurgie était plus élevé que celui après la chirurgie (9,84 ± 0,40% vs 8,47 ± 0,33%, P
< 0,001, figure 3B.). Les concentrations de TGF-ß1 après la chirurgie ont diminué de façon significative par rapport à ceux d'avant la chirurgie (6431,95 ± 629.24 vs 7581,56 ± 556.45 pg /ml, P
= 0,005, Fig. 3C). Une corrélation positive entre la fréquence Treg et la concentration de TGF-β1 a été trouvé dans le sérum avant l'opération ( r
= 0,454, P
= 0,044, Fig. 3D).}

TGF -β1 est hautement régulée positivement dans des lignées cellulaires de cancer gastrique sous hypoxie de

Pour déterminer si l'hypoxie induit la sécrétion de TGF-β1 dans les cellules de cancer gastrique, les niveaux de TGF-ß1 ont été étudiés dans deux lignées cellulaires de cancer gastrique, AGS et BGC823, dans des conditions hypoxiques ou normoxiques. L'expression de l'ARNm de TGF-β1 en hypoxie a été augmentée par rapport aux conditions normoxiques (Fig. 4A). Conformément à qPCR, les niveaux de TGF-ß1 dans le surnageant de culture ont montré des résultats similaires (Fig. 4B). En outre, l'expression du TGF-β1 et HIF-1α ont également été détectées par immunofluorescence, et les résultats ont montré TGF-β1 et l'expression de HIF-1α augmenté dans des conditions hypoxiques par rapport à celle des conditions normoxiques (fig. 4, C).

hypoxie augmente la capacité de Induire Tregs via TGF-β1 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique

pour tester l'hypothèse que induite par l'hypoxie TGF-β1 contribue à l'augmentation des Treg, circulant CD4 ^{+ CD25 - cellules T provenant d'individus en bonne santé ont été traités avec des surnageants provenant de cellules dans des conditions différentes. Les tracés de points ont montré différents médias induisant l'expression de Foxp3 dans CD4 Les cellules + T (Fig. 5A). L'expression Foxp3 des lymphocytes T dans un milieu normoxique, le milieu hypoxique et moyen recombinant TGF-β1 humain ont tous augmenté par rapport au milieu témoin ( P
< 0,001). En outre, l'expression Foxp3 dans le milieu hypoxique était significativement plus élevé que dans le milieu normoxique (13,04 ± 0,74% vs 6,76 ± 0,35%, P
< 0,001, figure 5B.). En outre, comme on a ajouté LY-364947 à chaque type de support, l'expression Foxp3 diminué ouvertement ( P
. ≪ 0,001, figure 5C).}

Discussion

Plus la dernière décennie, les preuves émergentes a suggéré que les Tregs contribuent à la mise en place des tumeurs en altérant la réponse immunitaire antitumorale, ou même de stimuler les métastases directement [18], [19]. Les preuves obtenues au cours des dernières années a démontré des fréquences de Tregs intratumoral a augmenté dans le cancer gastrique, qui ont été liés à des caractéristiques clinico défavorables et un mauvais pronostic [20], [21], [22]. Conformément à ces résultats rapportés précédemment, notre étude a fourni des preuves que la fréquence des Tregs de tumeur infiltrant augmente avec l'avancement des étapes de la tumeur. En outre, Tregs a également fourni un facteur de pronostic pour post-chirurgie du cancer gastrique. En outre, nous avons confirmé que le nombre de Tregs dans le cancer gastrique métastatique sont significativement plus élevés que dans le cancer gastrique non métastatique. Les résultats ci-dessus appuient l'idée que Tregs peut contribuer à la progression tumorale et peut être une cible thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique. Nous avons donc tenté prochaine pour explorer le mécanisme sous-jacent de médiation d'enrichissement Treg dans le cancer gastrique.

Tumeur hypoxie est bien reconnu comme un facteur clé entraînant une résistance au traitement et de mauvais pronostic pour le cancer gastrique [6], [16], [ ,,,0],23]. HIF-1α, comme la signature moléculaire principale de l'hypoxie, est le principal régulateur en aval de la réponse hypoxique dans les cellules tumorales [24]. Les résultats de notre étude ont démontré que HIF-1α en corrélation avec une catégorie de comportement malin, y compris la profondeur de l'invasion, métastase ganglionnaire et de faire progresser le stade tumoral. Il est frappant, les patients atteints de cancer gastrique avec une grande HIF-1α avaient une moins bonne survie que ceux à faible HIF-1α, qui a renforcé davantage notre proposition que HIF-1α, ou plutôt l'hypoxie, est liée à la progression du cancer gastrique.

il est depuis longtemps reconnu que les cellules tumorales sont protégées contre les endommagements immunitaire chez microenvironnements tumorales hypoxiques; Cependant, les mécanismes sous-jacents restent encore sous contrôle [25]. A partir de maintenant, on sait peu de savoir s'il y a un lien entre l'hypoxie et l'immunosuppression Treg médiation dans les tumeurs. Plusieurs études récentes ont étudié la réglementation hypoxique des Tregs, avec des résultats contradictoires. Ben-Shoshan et al.
[26] ont rapporté que l'hypoxie augmente le nombre et les propriétés suppressives de Tregs pour dicter un programme anti-inflammatoire. Wei et al.
[7] a également confirmé que l'hypoxie augmente la capacité du glioblastome à induire Tregs, et joue donc un rôle clé dans la suppression immunitaire tumeur médiée. Cependant, Dang et al. [27] ont constaté que HIF-1α inhibe la différenciation Treg en ciblant la protéine Foxp3 pour la dégradation. Dans notre étude, nous avons présenté une corrélation fortement positive entre le nombre Tregs et l'expression de HIF-1α, ce qui suggère que l'hypoxie peut contribuer à Tregs infiltration dans le cancer gastrique. Il est intéressant de noter que, dans nos études, la plupart des Tregs étaient situées dans la région près de cellules cancéreuses exprimant HIF-1α. Ainsi, de plus amples éclaircissements si les molécules d'hypoxie associée libérés par les cellules cancéreuses contribuent à l'enrichissement de Tregs dans le cancer gastrique est nécessaire.

Alors que les mécanismes impliqués dans l'enrichissement des Tregs dans les tumeurs ne sont pas encore bien compris, nous et d'autres chercheurs ont récemment démontré que les cellules tumorales peuvent servir de source de TGF-β1, ce qui est nécessaire pour l'induction et le maintien des Treg in vitro et

in vivo [28], [29], [30]. Dans l'étude actuelle, la fréquence des lymphocytes T régulateurs et de TGF-β1 dans la circulation avant l'intervention chirurgicale était supérieure à celle après la chirurgie, et les deux paramètres a montré une corrélation positive, ce qui suggère que la tumeur TGF-β1 susceptibles de contribuer à l'augmentation des Treg dans l'estomac cancer.

hypoxie, une caractéristique commune des cancers, peut induire les cellules cancéreuses à des cytokines immunosuppressives secrètes dont TGF-β1 [7], [31]. Les résultats de notre étude ont démontré la plupart des cellules de haute TGF-ß1 étaient des cellules cancéreuses exprimant HIF-1α dans les tumeurs. Une balise in vitro
étude a démontré l'expression du TGF-β1 a augmenté dans une plus large mesure dans les cellules du cancer de l'estomac en culture hypoxique, ce qui est cohérent avec les études mentionnées ci-dessus. Sur la base de nos résultats, nous avons émis l'hypothèse que les cellules cancéreuses sécrètent TGF-β1 pour induire la production de Tregs dans le cancer gastrique. Pour tester notre hypothèse, isolé CD4 ^{+ CD25 - cellules d'individus sains T ont été cultivées dans des surnageants dilués de cellules tumorales dans différentes conditions de culture. Les résultats ont montré que l'expression de Foxp3 des lymphocytes T cultivés en milieu hypoxique a été significativement supérieure à celle des cellules cultivées dans un milieu normoxique. En outre, l'addition de TGF-β1 humaine recombinante supplémentaire augmente significativement l'expression de Foxp3, alors que l'ajout de l'expression de Foxp3 LY-364947, un inhibiteur du récepteur du TGF-β1, réduite. Ainsi, ces résultats établissent un lien direct entre l'hypoxie, le TGF-β1 et Tregs dans le cancer gastrique.}

Cependant, notre étude préliminaire a également montré que le TGF-β1 n'a pas été modifiée par stabilisant HIF-1α, le chlorure de cobalt (CoCl _{2), HIF-1α ou d'un inhibiteur, le 2-méthoxyestradiol (2ME2) ​​en AGS et BGC823, bien que l'HIF-1α a été augmentée par l'hypoxie (données non présentées). Ces résultats suggèrent que HIF-1α peut être non associée à l'induction de TGF-β1 dans les cellules cancéreuses gastriques sous hypoxie, ce qui est cohérent avec l'étude précédente [32]. En outre, la production de lymphocytes T régulateurs ne pouvait pas être complètement soumis à une ablation par le blocage du TGF-β1, ce qui indique que d'autres cytokines ou les voies peuvent également être impliqués. En outre, les cellules cancéreuses ne sont pas la seule source de cytokines au sein du micro-environnement de la tumeur. Ainsi, d'autres études sont nécessaires pour confirmer le mécanisme sous-jacent de l'accumulation Treg dans le cancer gastrique.}

En conclusion, la présente étude a démontré que l'hypoxie potentialise la capacité du cancer gastrique pour échapper à la surveillance immunitaire par up-régulation de l'expression des TGF-β1, induisant ainsi Tregs dans les tumeurs. En outre, nos données ont également fourni des preuves de l'existence de la diaphonie intercellulaire entre les cellules tumorales et Tregs, ce qui pourrait réguler les réponses immunitaires anti-tumorales.

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