PLOS ONE: microARN 135a Supprime métastase ganglionnaire par régulation négative de ROCK1 dans le cancer gastrique précoce

Résumé

microARN (miARN) jouent un rôle crucial dans la progression du cancer de l'estomac et les métastases. Cette étude a examiné le rôle des miRNA-135a dans le cancer gastrique précoce (EGC), y compris les ganglions lymphatiques (LN) métastase. Nous avons examiné la corrélation entre l'expression miRNA-135a et les résultats cliniques chez 59 patients ayant subi une chirurgie pour EGC. En utilisant des lignées cellulaires de cancer gastrique, nous avons effectué des analyses fonctionnelles et le gène cible. expression miRNA-135a a été régulée à la baisse dans 33,9% des patients. Ces patients présentaient un stade beaucoup plus avancé (TNM stage≥IB, 35,0% contre 12,8%, p = 0,045) et le taux de LN métastases (30,0% contre 5,1%, p = 0,014) plus élevés que ceux avec une régulation de expression miRNA-135a. Dans une analyse multivariée, la régulation des miRNA-135a était un facteur de risque indépendant de LN métastase (odds ratio ajusté, 8,04; intervalle de confiance à 95%, de 1,08 à 59,81, p = 0,042). Des analyses fonctionnelles en utilisant des lignées cellulaires de cancer gastrique ont montré que les miARN 135a supprime la viabilité des cellules, la transition épithélio-mésenchymateuse, l'invasion cellulaire et la migration. ROCK1 était une cible de miRNA-135a et son expression était inversement corrélée à celle de miRNA-135a. expression ROCK1 a été augmenté de façon significative chez les patients EGC avec LN métastases que chez ceux sans LN métastase. Nos résultats confirment le rôle de la tumeur-suppressive des miRNA-135a, et démontrent son rôle dans LN métastases dans EGC. miRNA-135a et son gène cible ROCK1
peuvent être des cibles thérapeutiques et pronostiques nouveaux pour EGC

Citation:. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) microARN 135a Supprime métastase ganglionnaire par régulation négative de ROCK1 dans le cancer gastrique précoce. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10.1371 /journal.pone.0085205

Editeur: Masaru Katoh, National Cancer Center, le Japon

Reçu le 28 Octobre 2013; Accepté le 23 Novembre 2013; Publié le 21 Janvier, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Shin et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été financé par la subvention 1110532-3 du national Cancer Center, en Corée. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:. HA est un PLOS ONE éditorial membre du conseil et cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs à tous les PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage.

introduction

le cancer gastrique reste encore la deuxième cause la plus fréquente de la mortalité par cancer dans le monde entier, malgré la baisse des taux d'incidence et de mortalité dans les pays développés [1 ].

Dans les régions, y compris la Corée et le Japon, où le dépistage du cancer de l'estomac est effectuée largement, la détection précoce est souvent possible. Parce qu'une augmentation du taux de détection précoce du cancer gastrique peut conduire à une amélioration du pronostic, des intérêts dans l'amélioration de la qualité de vie des patients et de l'utilisation des traitements minimalement invasives ont augmenté. Chez les patients atteints d'un cancer de l'estomac, les ganglions lymphatiques (LN) des métastases est l'un des facteurs pronostiques les plus importants, et l'incidence globale des métastases LN de cancer gastrique (EGC) est comprise entre 5 et 20% [2] - [4].

gastrectomie avec LN dissection est considéré comme le traitement standard pour le cancer de l'estomac; toutefois, 80 à 95% des patients atteints EGC ne nécessitent pas une dissection LN si le cancer gastrique est complètement excisé par des traitements moins invasifs tels que la résection endoscopique [5] - [7] ou chirurgie mini-invasive ( par exemple
, résection cunéiforme simple, ou la chirurgie de navigation sentinelle LN) [8] - [10]. Bien que les études de marqueurs pronostiques et prédictifs biologiques pour LN métastases dans EGC ont été menées, aucun des outils prédictifs existent pour métastases ganglionnaires de EGC réellement.

Plusieurs études ont rapporté que la profondeur de l'invasion, la taille de la tumeur, et l'invasion lymphatique sont associée à des métastases LN EGC dans [4], [11]. Cependant, la plupart de ces facteurs ont été déterminés après examen final pathologique des tissus réséqués, ce qui est pas utile dans la détermination de la stratégie de traitement.

microARN (miARN) sont de petites protéines non-ARNs codant. Des études ont démontré que les altérations de l'expression des miRNAs contribue à la pathogenèse des cancers, y compris ceux d'origine gastro-intestinale [12] - [15].

miARN ont également été révélés être utiles pour différencier les tissus cancéreux et normaux [ ,,,0],16], [17]. En outre, les miARN sont exprimés de manière différentielle dans chaque étape de la carcinogenèse du cancer gastrique [18]. miRNA-27 [19] et la famille miRNA-200 ZEB1 réglementés [20] ont montré être liés à l'étape de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) dans le cancer gastrique. Par conséquent, les miARN peuvent être associés au processus de métastases LN dans EGC. Parmi les miARN, miRNA-135a a été montré pour être un suppresseur de tumeur miRNA, et son expression est régulée à la baisse dans plusieurs cancers, y compris le carcinome rénal à cellules [21] et le lymphome [22]. À son tour, la surexpression ou la restauration de miARN 135a favorise l'apoptose et supprime la prolifération des cellules tumorales à travers ses gènes cibles c-myc [21] et JAK2 [22], respectivement. Dans un in vitro
étude, miRNA-135a supprimé activités migratoires et invasives des cellules de cancer gastrique [23]. Cependant, le rôle de suppresseur de tumeur du miRNA-135a dans le cancer gastrique est peu claire.

Le but de cette étude était d'étudier la corrélation entre l'expression miRNA-135a et les résultats cliniques chez les patients EGC y compris LN métastases.

Matériel et méthodes

échantillons de tissus humains et les données cliniques

Cinquante-neuf patients adultes diagnostiqués avec EGC au national Cancer Center, la Corée, de Janvier 2011 à Avril 2013 ont été inclus dans cette étude. Ces patients ont été traités avec une gastrectomie ouverte ou assistée par laparoscopie avec D1 + ou plus LN dissection. L'étendue de la LN dissection a suivi les recommandations de l'Association japonaise du cancer gastrique [24]. L'étape après la chirurgie a été évaluée en fonction de la 7 ^{e édition du American Joint Committee on Cancer Classification TNM [25]. Les tissus humains, y compris à la fois le cancer gastrique et les tissus normaux appariés de chaque patient ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C. De l'examen des dossiers médicaux, les caractéristiques clinico y compris l'âge, le sexe, l'état, les caractéristiques de la tumeur, le stade et le statut de Helicobacter pylori de LN métastases ont été obtenues et analysées. le consentement écrit a été obtenu de tous les patients et l'étude a été approuvée par le conseil d'administration du Centre national du cancer, la Corée Institutional Review (NCCNCS-11-445).}

Culture cellulaire et transfection

Le lignée humaine normale gastrique des cellules épithéliales HFE145 [26], [27] était un don du Dr Hassan Ashktorab et Duane T. Smoot (Université Howard, Washington, États-Unis) et disponibles dans le commerce gastriques lignées cellulaires de cancer AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 et SNU719 ont été obtenus à partir de la cellule Corée Line Bank (KCLB, Séoul, Corée). Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% d'antibiotiques (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Parmi les lignées cellulaires de cancer gastrique, les lignées cellulaires MKN28 et SNU668 ont été choisis parce qu'ils expriment rarement miRNA-135a, et des lignées cellulaires YCC et KATOIII ont été choisis parce qu'ils ont une expression de base substantielle de miRNA-135a (figure 1A). Transfections avec imite miRNA-135a (imite MIRVANA ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, USA), un inhibiteur de miRNA-135a (inhibiteur MIRVANA ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, USA), et ROCK1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 '; UGBioneer, Séoul, Corée) en SNU668, YCC2, MKN28, et des lignées cellulaires KATOIII ont été effectuées en utilisant Lipofectamine RNAiMAX et Lipofectamine 2000 réactifs (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon les instructions du fabricant. MKN28, SNU668, YCC2 et KATOIII lignées cellulaires ont été récoltées deux jours après la transfection, et les différentes analyses ont été effectuées.

miARN l'extraction et la quantification de l'ARN

ARN total a été isolé à partir de 13 lignées cellulaires et 59 les tissus des patients atteints de cancer gastrique de, respectivement, en utilisant Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Les réactifs de mixage master kit TaqMan universel PCR (Applied Biosystems, Tokyo, Japon) a été utilisé. Amplification et la détection ont été effectuées en utilisant un système de détection de séquence 7900HT (Applied Biosystems, Tokyo, Japon) avec 40 cycles de dénaturation à 95 ° C (15 secondes) et hybridation /élongation à 60 ° C (60 secondes). Ceci a été précédé par une transcription inverse à 50 ° C pendant 30 minutes et une dénaturation à 95 ° C pendant 10 minutes. Pour quantifier les miARN matures, TaqMan microARN Assays kits (Applied Biosystems, Tokyo, Japon) ont été utilisés pour la détection de miARN-135a et un contrôle miRNA (RNU6B).

Western blot analyse

Protein était extrait de 13 lignées cellulaires et 59 échantillons de tissus "patients EGC en utilisant un tampon RIPA (Biosesang, Séoul, Corée) comprenant un cocktail d'inhibiteurs de la protéase (Sigma, St. Louis, MO, USA) selon le protocole du fabricant. Ensuite, Western blot a été réalisée en utilisant anti-ROCK1 et anti-β-actine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) anticorps. Les signaux ont été détectés avec un kit ECL prime (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) selon les instructions du fabricant.

tests de prolifération cellulaire

La prolifération cellulaire a été mesurée en utilisant un test MTT. Les cellules ont été étalées dans des plaques de culture 96 puits (3 x 10 ^{3 cellules par puits) et transfectées avec mimétiques miARN-135a après deux jours d'incubation. Par la suite, 200 pi de MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) ont été ajoutés à chaque puits. Après quatre heures d'incubation supplémentaires, des solutions de MTT ont été rejetées, 200 pi de DMSO (Amresco, Solon, OH, USA) ont été ajoutés à chaque puits, et la plaque a été secoué doucement. L'absorbance a été mesurée sur un lecteur ELISA (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) à une longueur d'onde d'essai de 570 nm.}

Cycle cellulaire analyse

Les cellules ont été étalées dans des plaques de culture 60π et transfectées avec miRNA -135a imite ou un mime contrôle négatif miRNA (imite-NC). Ces cellules ont été récoltées par trypsinisation et fixées dans 70% d'éthanol pendant au moins deux heures à -20 ° C. Les culots cellulaires ont été lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate froid et incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans PI /RNase Coloration Buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Après coloration, les échantillons ont été analysés avec un cytomètre de flux FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) et 10.000 événements ont été collectés par échantillon. Les données de cytométrie de flux ont été analysés en utilisant le logiciel Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

migration Trans-filtre et l'invasion des essais

Les cellules ont été transfectées avec imite miRNA-135a , les inhibiteurs de miRNA-135a, ROCK1 siRNA et ROCK1 siRNA contrôle négatif (scRNA) pendant une journée, puis transféré à la chambre supérieure de la plaque transwell revêtu de 0,5 mg /ml de collagène de type I (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) et une dilution 1h15 de Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, USA). RPMI 1640 avec 10% de FBS et 1% d'antibiotiques (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) a été ajouté à la chambre inférieure et la plaque était incubation pendant 20 heures. cellules Migration et d'invasion ont été quantifiées à l'aide de l'hématoxyline et éosine.

Les constructions plasmidiques luciférase rapporteurs

Le type sauvage 3 'UTR de ROCK1 contenant des sites de liaison pour miRNA-135a a été amplifié en utilisant ADNg de SNU668 cellules en tant que matrice. Les constructions mutantes corrélées ont été créés en faisant muter les régions de germes des sites de liaison des miARN-135. À la fois de type sauvage et mutant 3 'UTR ont été clonés en aval du gène de la luciférase dans un vecteur témoin pGL3. Les constructions ont été vérifiées par séquençage.

dosage de Luciférase

dosages de luciférase ont été réalisées dans des cellules et SNU668 YCC2. cellules SNU668 et YCC2 ont été transfectées avec chacun des plasmides (vecteur vide [MOCK], ROCK1 3 'UTR de type sauvage [WT], et ROCK1 3' UTR mutant [MUT], comme un site de liaison miRNA-135a) avec miRNA- 135a imite, les inhibiteurs de miRNA-135a, et l'ARN de contrôle négatif dans des plaques à 24 puits. Deux jours après la transfection, les cellules ont été récoltées et lysées. les dosages de luciférase ont été réalisées sur des lysats en utilisant un kit de dosage de luciférase (Promega, Madison, WI, USA). L'activité luciférase a été normalisée à la ß-galactosidase.

coloration immunohistochimique

immunohistochimique (IHC) coloration a été réalisée pour 20 cas représentatifs de Rock1 groupes d'expression basse et haute. Antigène extraction a été réalisée avec un traitement thermique pendant 30 min dans pH 8,0 tampon Tris-EDTA (CC1, Système Ventana Medical, Tucson, AZ, USA) à 95 ° C. lames de tissu ont été incubées à 42 ° C pendant 30 min avec anti-ROCK1 mAb (ab134181, clone EPR638Y, lapin monoclonal, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Des témoins négatifs ont été utilisés de manière identique avec une IgG de lapin non immunisé. Les résultats ont été interprétés par un pathologiste expérimenté (MC Kook).

L'analyse statistique

Les données à échelle sont donnés en moyenne ± écart-type (SD). Chi-carré ou test exact de Fisher et le test de Mann-Whitney U ont été utilisés pour comparer les variables catégorielles et variables continues, respectivement. Le coefficient de corrélation de Pearson a été utilisé pour comparer le profil d'expression génique entre miRNA-135a et ROCK1. Un modèle de régression logistique multivariée a été utilisée pour déterminer les facteurs indépendants associés à LN métastase. Covariables qui étaient significatifs en utilisant chi-carré ou test exact de Fisher ( P
< 0,05) ont été entrés dans le modèle de régression logistique. Toutes les données ont été analysées en utilisant STATA 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, USA). A P
valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

niveaux d'expression miRNA-135a de sont associés à la progression et LN métastases dans EGC

Une étude antérieure a montré que l'expression miRNA-135a est régulée à la baisse dans des lignées cellulaires de cancer gastrique [23]. En utilisant qRT-PCR, nous avons également constaté que l'expression miRNA-135a est régulée à la baisse dans diverses lignées cellulaires de cancer gastrique par rapport à celle d'une ligne épithéliale gastrique normale de la cellule (figure 1A).

Cependant, la corrélation entre expression miRNA-135a et les résultats cliniques dans le cancer gastrique n'a pas été étudié. Par conséquent, nous avons mesuré les niveaux d'expression de miARN-135a dans le cancer gastrique primaire et leurs niveaux correspondants dans les tissus normaux de 59 patients ayant une EGC. Down- et la régulation des gènes dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux ont été définis comme étant le rapport de la tumeur à des niveaux d'expression des gènes des tissus normaux de < 1,0 et >. 1.0, respectivement

A l'inverse du résultat de in vitro
expérience, seulement 20 (33,9%) des 59 patients atteints de EGC exposé down-régulation de l'expression miRNA-135a. Cependant, ces patients ont montré de manière significative un stade plus avancé (TNM stage≥IB, 35,0% contre 12,8%, p = 0,045; brut odd ratio [OR], 2.11; 95% intervalle de confiance [IC], 1,08 à 4,10) et un taux plus élevé de métastases LN (30,0% contre 5,1%, p = 0,014; brut OR, 2,73; IC 95%, 1,50 à 4,98) que ceux avec la régulation de l'expression miRNA-135a (tableau S1). La sensibilité et la spécificité de miARN 135a statut d'expression pour la prédiction des métastases LN ont été 75,0% et 72,5%, respectivement. En outre, les patients présentant plus de stade avancé (figure 1B) ou des métastases LN (figure 1C) ont montré un taux significativement plus faible de la tumeur à des niveaux d'expression de miARN 135a normales que celles à l'étage IA ou sans métastases LN. Une analyse de régression logistique multivariée a également montré que miRNA-135a régulation à la baisse était indépendamment associée à LN métastases (OR ajusté, 8,04; IC 95%, 1,08 à 59,81, p = 0,042; tableau 1). Collectivement, ces résultats suggèrent que la régulation de l'expression miRNA-135a peut être associée à la progression du cancer gastrique, y compris LN métastase.

miRNA-135a supprime la viabilité des cellules de cancer de l'estomac, EMT, la migration et l'invasion

pour étudier plus l'association entre miRNA-135a et les résultats cliniques, nous avons effectué des tests fonctionnels pour la viabilité cellulaire, cycle cellulaire, EMT, la migration et l'invasion dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. La surexpression de miARN 135a par mimétiques miARN 135a supprimée de façon significative la viabilité des cellules (figure 2A) et une augmentation de la fraction subdiploid de SNU668 cellules d'une lignée cellulaire qui exprime rarement miARN 135a (figure 2B), ce qui suggère l'apoptose accrue des cellules cancéreuses gastriques. Cependant, la suppression de miARN 135a par des inhibiteurs de miARN induite 135a ni une augmentation de la viabilité cellulaire ni une diminution de la fraction subdiploid dans YCC2 cellules d'une lignée cellulaire qui exprime miARN substantielle 135a (figure 2A et 2B). Nous avons également étudié l'association entre l'expression miRNA-135a et EMT dans les cellules de cancer gastrique, parce miRNA-135a régulation à la baisse a été un facteur de risque indépendant de LN métastases chez les patients EGC (tableau 1). Une expression accrue de miARN-135a a été associée à la suppression de l'EMT et a montré une augmentation de l'expression de la E-cadhérine et la suppression des deux N-cadhérine et Slug dans les cellules SNU688. En revanche, l'inhibition de l'expression du miARN-135a a donné lieu à l'activation de l'EMT, y compris la suppression de l'expression E-cadhérine et la régulation positive des deux N-cadhérine et d'expression slug dans YCC2 cellules (figure 2C). Dans l'évaluation des conséquences fonctionnelles, la surexpression de miRNA-135a par imite miRNA-135a supprimé de manière significative les capacités de migration et l'invasion de SNU668 cellules de cancer gastrique (Figure 2D). A l'inverse, le blocage des miRNA-135a par les inhibiteurs de miRNA-135a a augmenté de manière significative la migration et l'invasion de YCC2 cellules de cancer gastrique (Figure 2E). Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que miRNA-135a est un régulateur de suppresseur de tumeur pour la prolifération du cancer gastrique et la métastase.

ROCK1 est un gène cible de miRNA-135a dans le cancer gastrique

Pour élucider les mécanismes sous-jacents les effets des miARN-135a sur les résultats cliniques, nous avons cherché des cibles putatifs en utilisant la base de données TargetScan 6.2. De 718 cibles conservées, nous avons sélectionné des cibles avec plus de points dont la régulation pourrait entraîner une augmentation de la prolifération des cellules cancéreuses, la migration et l'invasion. Nous avons constaté que ROCK1 pourrait être un gène cible de miARN 135a, car l'inhibition ou la suppression de ROCK1 a été rapportée pour favoriser l'apoptose et pour supprimer la migration, l'invasion et la prolifération des cellules cancéreuses, y compris ceux du cancer gastrique [28] - [30]. Analyse TargetScan a révélé que la séquence 3'UTR de ROCK1 a un site de liaison possible pour les miARN 135a (figure 3A). Pour confirmer si ROCK1 est une cible de miARN 135a, un dosage de la luciférase a été effectuée. Les constructions 3'UTR luciférase décrits dans la section des méthodes ont été co-transfectés dans SNU688 cellules avec imite miRNA-135a et dans les cellules YCC2 avec des inhibiteurs de miRNA-135a. Nous avons également construit ROCK1 3'UTR MUT par mutation ponctuelle C → G dans le site de liaison possible (figure 3A). L'activité luciférase relative du WT ROCK1 3'UTR a été significativement augmentée en présence d'inhibiteurs de miARN 135a (figure 3B). A l'inverse, cette activité a diminué de manière significative en présence d'mimétiques miARN 135a (figure 3C). Dans les lignées cellulaires de cancer gastrique, miRNA-135a et ROCK1 ont montré un profil d'expression adverse. analyse par Western blot a montré que l'expression ROCK1 a été régulée à la baisse en présence d'imite miRNA-135a, et régulés à la hausse en présence d'inhibiteurs de miRNA-135a (Figure 3D et 3E). Pris ensemble, ces résultats indiquent que miRNA-135a supprime l'expression ROCK1 en ciblant directement son 3'UTR.

Expression de ROCK1 est inversement corrélée à celle de miRNA-135a chez les patients avec EGC

Analyse des 59 patients ayant une EGC a montré que les niveaux d'expression ROCK1 avaient une corrélation négative significative avec ceux de miARN 135a (r = -0,697, p < 0,001; figure 4A). En outre, les patients atteints de la régulation de l'expression miRNA-135a avaient des niveaux significativement plus faibles de ROCK1 expression de protéines que celles avec la régulation des miRNA-135a (moyenne tumeur ratio normal, 0,81 vs 1,55, p < 0,001; la figure 4B) .

ROCK1 est associée à LN métastases dans EGC et est impliqué dans la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion réprimée par miRNA-135a

Pour mieux évaluer l'association entre l'expression ROCK1 et les résultats cliniques en EGC, nous avons analysé les profils d'expression ROCK1 en référence à l'état de métastases LN des patients inclus. Les patients atteints de métastases LN avaient une expression significativement plus élevée de protéines ROCK1 que ceux sans métastases LN (moyenne tumeur ratio normal, 1,86 vs 0,93, p = 0,007; la figure 5A). En outre, les niveaux de ROCK1 coloration IHC étaient semblables à ceux d'expression ROCK1 dans l'analyse western blot ( ie
, les patients sans métastases LN avaient faibles motifs de coloration IHC [Figure 5B], mais ceux avec LN métastase avait une forte coloration IHC positif [Figure 5C]).

Enfin, pour déterminer si les capacités de migration et d'invasion supprimés conférés par le miRNA-135a régulation à la hausse observée dans les lignées cellulaires de cancer gastrique ont été le résultat de ROCK1 régulation à la hausse, nous avons effectué la migration et des essais d'invasion en utilisant des lignées cellulaires de cancer gastrique transfectées avec l'ARNsi spécifique ROCK1. ROCK1 siRNA supprimé activités migratoires et invasives dans SNU668 cellules (Figure 5D). Dans les cellules YCC2 co-transfectées avec des inhibiteurs de miRNA-135a et ROCK1 siRNA (Figure 5E), la migration et l'invasion des essais ont montré que l'inhibition de ROCK1 par siRNA significativement atténué les améliorant les effets migratoires et invasives de miRNA-135a régulation vers le bas par les inhibiteurs de miRNA-135a (figure 5F).

Collectivement, ces résultats suggèrent que ROCK1 est associée à des métastases LN chez les patients présentant EGC, et que cela résulte de l'augmentation de l'expression de ROCK1 dans le cadre de miARN 135a régulation à la baisse. Par conséquent, ROCK1 peut être impliqué dans miRNA-135a-suppression des métastases du cancer gastrique.

Discussion

Dans la présente étude, nous avons constaté que miRNA-135a avait une tumeur des rôles suppressives dans le cancer gastrique. Chez les patients avec EGC, la régulation des miRNA-135a était un facteur de risque indépendant de LN métastase. Dans les cellules du cancer de l'estomac, régulée à la hausse miARN 135a supprime la carcinogenèse gastrique en supprimant la prolifération des cellules, EMT, et les métastases. En outre, nous avons également identifié un nouveau gène cible de miRNA-135a, ROCK1, qui a été associée à des métastases LN dans le cancer gastrique.

Dans les patients avec EGC, l'évaluation de LN métastases avant le traitement est une étape importante dans la détermination des stratégies de traitement. des traitements moins invasifs tels que la résection endoscopique [5] - [7] ou une intervention chirurgicale de navigation sentinelle LN [9], [10] peut être possible chez les patients présentant des métastases LN sans EGC. Ces approches thérapeutiques ont amélioré la qualité de vie des patients en ce qui concerne les complications tardives associées à des traitements chirurgicaux standard, y compris le syndrome de dumping, la perte de poids, et les symptômes associés au reflux [31]. Par conséquent, les biomarqueurs plus sensibles et spécifiques sont nécessaires pour prédire l'état de LN métastases chez les patients atteints de EGC. Dans la présente étude, miRNA-135a régulation à la baisse a été un facteur indépendant pour LN métastase, et la valeur de prédiction de miRNA-135a statut d'expression était relativement élevée avec une sensibilité de 75% et une spécificité de 73%. Bien que d'autres études de validation sont nécessaires, ces résultats ont montré que la mesure des niveaux miRNA-135a avant de déterminer le plan de traitement pour les patients EGC pourrait être un test utile pour prédire l'état de LN.

Fait intéressant, miRNA-135a a été rapporté être suppressif de tumeurs et oncogène. La surexpression de miRNA-135a a été associée à la suppression de la prolifération de la tumeur et la croissance dans le carcinome à cellules rénales [21] et une apoptose accrue et une meilleure survie sans maladie dans le lymphome [22]. En revanche, les miARN-135a a été impliqué dans la progression du cancer colorectal [32] et une augmentation de la migration des cellules du sein et de l'invasion [33]. Dans la présente étude, miRNA-135a a été montré comme un suppresseur de tumeur miARN, qui est en accord avec le résultat d'une étude précédente [23]. Spécialement, l'expression élevée de miRNA-135a supprimé plusieurs étapes de la cancérogenèse gastrique, y compris la prolifération, la migration et l'invasion. En outre, nous avons également constaté que miRNA-135a pourrait supprimer EMT, qui a signalé à être associée à l'initiation du processus en plusieurs étapes de la cancérogenèse et la promotion des métastases [34], [35]. Avant la présente étude, l'association entre miRNA-135a et EMT n'a pas été étudié, bien que des études antérieures ont montré que les miARN tels que miRNA-27 [19], la famille miRNA-200 [20], miRNA-7 [36] et miARN-1228 [37] suppress EMT par leurs propres gènes cibles dans le cancer gastrique. Pris ensemble, miRNA-135a est un suppresseur de tumeur miARN dans le cancer gastrique.

Une étude précédente analyse 353 tissus de cancer gastrique humains a montré que les profils d'expression des miARN sont diverses et que certains miARN ont été associés à la progression et le pronostic dans l'estomac le cancer [14]. Dans l'étude, miRNA-135a a été classé comme un miARN oncogènes dans le cancer gastrique sur la base des résultats des analyses d'ADN microarray. Cependant, dans un récent [23] et notre étude, miRNA-135a a agi comme un suppresseur de tumeur malgré le taux élevé de patients avec miRNA-135a-régulation. Bien que de nombreux patients (66%) avaient une régulation des miRNA-135a similaire à la suite d'une étude précédente [14], ces patients ont montré un stade beaucoup moins avancé et un taux inférieur de LN métastase. En outre, in vitro
études supplémentaires ont également montré qu'une expression plus élevée de miRNA-135a a été associée à la suppression de la cancérogenèse gastrique. Ces résultats suggèrent que les profils d'expression des miARN pourraient être différents des résultats cliniques, et donc, pour confirmer les rôles exacts de miARN spécifiques, d'autres études sont nécessaires.

ROCK1 est un membre de la sérine /thréonine Rho-associé famille des kinases, qui fonctionne comme un régulateur central de l'organisation du cytosquelette d'actine et de la dynamique [23], [38]. ROCK1 dispose d'une gamme variée de fonctions dans la tumorigenèse, y compris la migration, l'invasion et les métastases [28]. ROCK1 est une cible de plusieurs miARN dans divers cancers, y compris miRNA-584 dans le carcinome à cellules rénales [39], miRNA-335 dans le neuroblastome [40], et miRNA-146a dans le cancer de la prostate [41]. Dans le cancer gastrique, ROCK1 a été corrélée positivement avec LN métastases et le stade TNM [42], et est impliqué dans la suppression miRNA-148a induite par la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion [30]. En outre, un inhibiteur ROCK1 promu l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques [29]. Dans la présente étude, nous avons constaté que ROCK1 est une cible de miRNA-135a dans le cancer gastrique et son expression est positivement associée à la LN métastases chez les patients EGC. in vitro
expériences ont également montré que ROCK1 est impliqué dans la motilité gastrique, des cellules cancéreuses et l'invasion. Ces résultats suggèrent que ROCK1 peut être une nouvelle cible thérapeutique avec la capacité d'inhiber les métastases du cancer de l'estomac.

En conclusion, nous avons identifié miARN-135a en tant que nouveau biomarqueur pronostique pour LN métastases chez les patients atteints EGC et démontré que miARN 135a supprimée carcinogenèse gastrique ( ie
, la prolifération, EMT, et des métastases dans des lignées cellulaires de cancer gastrique) en ciblant ROCK1. Bien que ces résultats doivent être validés dans d'autres groupes de patients indépendants, ils suggèrent que miRNA-135a et son ROCK1 du gène cible peut être un nouveau biomarqueur et cible thérapeutique pour le cancer gastrique avec métastases LN.

Informations complémentaires
Tableau S1 .
caractéristiques clinicopathologiques des patients atteints de cancer gastrique selon miRNA-135a statut d'expression
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

• PLOS ONE: Association entre polymorphismes dans XRCC1 Gene and Outcomes traitement des patients atteints du cancer avancé de l'estomac: Une revue systématique et méta-Analysis
• PLOS ONE: Ciblage cadhérine-17 Ras inactive /Raf /MEK /ERK Signalisation et Inhibe la prolifération cellulaire dans gastrique Cancer