PLOS ONE: Atoh1 peut régler la tumorigénicité des cellules de cancer gastrique par induction de la différenciation des souches du cancer Cells

Résumé

souches du cancer des cellules (CCM) a été démontré que la médiation tumorigénicité, la chimio-résistance, radio-résistance et les métastases, ce qui suggère qu'ils être considéré comme cibles thérapeutiques. Parce que leurs cellules filles différenciées ne sont plus tumorigène, pour induire la différenciation des cellules souches cancéreuses peut être l'une des stratégies qui peuvent éradiquer la CSC. Ici, nous montrons que Atoh1 peut induire la différenciation des cellules gastriques souches cancéreuses (GCSCs). PCR en temps réel et l'analyse western blot a montré que Atoh1 a été induite pendant la différenciation des GCSCs. En outre, la surexpression induite par lentivirus de Atoh1 dans GCSCs et dans des lignées cellulaires de cancer gastrique induite de manière significative la différenciation, la prolifération et la formation de la sphère réduite, et réduit in vivo
la formation de tumeurs dans les modèles d'injection et des métastases hépatiques de xénogreffes sous-cutanées. Ces résultats suggèrent Atoh1 être pris en considération pour le développement d'une thérapie de différenciation pour le cancer gastrique

Citation:. Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) Atoh1 Puis Réguler la tumorigénicité du cancer gastrique les cellules en induisant la différenciation des cellules souches du cancer. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10.1371 /journal.pone.0126085

Academic Editor: Gianpaolo Papaccio, Université de Naples, ITALIE

Reçu: 3 Septembre 2014; Accepté 30 Mars 2015; Publié: 7 mai 2015

Droit d'auteur: © 2015 Han et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier, sauf les données de séquençage de l'ARN qui ont été déposés au dépôt public. (GEO Numéro d'accession: GSE46597)

financement: Ce travail a été soutenu par le Programme Bio et le développement de la technologie médicale (2012M3A9C6050213) et la recherche en sciences de base Fondation (2012R1A1A3010521) de la national Research Foundation (NRF), financé par le gouvernement coréen (MEST) et, une subvention de la national R & D Programme de lutte contre le cancer, Ministère de la Santé, des Affaires sociales et familiales, République de Corée (0920050) . Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Après que les cellules souches du cancer (CCM) ont d'abord été isolés à partir de patients atteints de leucémie, ils avaient été isolés à partir des types de cancer, y compris de nombreux cancers gastriques [1,2,3,4,5,6]. CSCs ont été proposés pour être une cible thérapeutique, car ils peuvent servir de médiateur tumorigénicité, la chimio-résistance, radio-résistance et les métastases [7,8,9]. la thérapie anti-cancer classiques principalement des cibles proliférantes non-CSCs, ce qui explique la récurrence fréquente de cancer [9]. Le mauvais pronostic des patients atteints d'une plus grande population du SCC, encourage également le développement de thérapies qui ciblent CSCs [10].

L'une des caractéristiques de CSCs est qu'ils peuvent se différencier en cellules filles qui ne sont plus tumorigène, par exemple , CSCs de cancers du côlon et de l'estomac ont été amenés à se différencier par le sérum [5,6]. Cela signifie que l'hypothèse SCC diffère fondamentalement de l'hypothèse classique d'expansion clonale. En outre, la relation hiérarchique entre les cellules souches cancéreuses et leurs cellules filles peut être expliqué par les mécanismes épigénétiques qui peuvent être appliqués aux cellules souches normales [11,12]. En outre, le microenvironnement peut affecter la différenciation des cellules souches cancéreuses [13], et ces caractéristiques peut être exploitée pour le développement de produits thérapeutiques
.

Par conséquent, l'induction de la différenciation est une stratégie qui peut être utilisée pour éradiquer CSCs. régulateurs épigénétiques ont été suggérés pour induire leur différenciation, par exemple, des histones désacétylases (HDAC) se sont avérés induire la différenciation des cellules souches cancéreuses dans la leucémie qui ont été provoquées par des protéines de fusion, tels que AML1-ETO et PML-RARa [14,15 ]. En outre, tous les trans-acide rétinoïque (ATRA) peut induire la différenciation des cellules souches cancéreuses dans la leucémie promyélocytaire aiguë (APL) par des facteurs C /EBP [16,17], sauvages facteurs de transcription de type, tels que, la différenciation C /EBPα, peut induite chez l'homme AML et dans les lignées cellulaires du cancer du poumon chez la souris et in vivo dans des modèles
[17,18,19,20]. Dans le cancer gastrique, la suramine a été montré pour induire la différenciation de lignées cellulaires de cancer gastrique humain [21].

Atoh1 est une base hélice-boucle-hélice (bHLH) facteur de transcription homologue à la atonal chez la drosophile [22]. Il active E-box transcription dépendante en collaboration avec E47 [23]. HES1, une molécule dans la voie de signalisation Notch, peut inhiber l'expression [24]. Des études de souris knock-out ont montré que Atoh1 joue un rôle essentiel dans la génération des neurones cérébelleux de granulés, les cellules ciliées de l'oreille interne, les interneurones de la moelle épinière, les cellules de Merkel dans la peau et les cellules sécrétoires intestinales [25]. Il est intéressant de Atoh1 a été associé à divers types de cancers, y compris le cancer du côlon [25].

Pour le développement d'une nouvelle thérapie de différenciation dans le cancer gastrique, nous avons analysé les changements d'expression au niveau des taux d'ARNm au cours de la différenciation des souches du cancer gastrique des cellules (GCSCs). Il a été constaté qu'au cours de la différenciation des GCSCs, le niveau de Atoh1 d'expression, ce qui est important pour la différenciation des cellules épithéliales de l'intestin [26,27], était significativement augmentée. En outre, l'induction de Atoh1 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et dans GCSCs réduit considérablement leur pouvoir tumorigène dans des modèles de métastases hépatiques d'injection sous-cutanée et

Materials &.

cultures
cellulaires

tissus de cancer gastrique souches du cancer gastrique de méthodes ont été récupérés après avoir obtenu le consentement éclairé des patients qui ont subi une résection chirurgicale à l'hôpital de Pusan ​​National University (PNUH) et l'hôpital Yangsan Pusan ​​National University (PNUYH ). Le protocole d'étude a été approuvé par le Conseil de Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review (PNUH-IRB) et de révision Pusan ​​National University Hospital Yangsan-institutionnel (PNUYH-IRB). Les cellules souches du cancer gastrique ont été cultivées comme décrit précédemment [6], et ont été amenés à se différencier en ajoutant 5% de FCS aux médias au lieu des facteurs de croissance.

Culture de lignées cellulaires de cancer gastrique

Le cancer gastrique les cellules (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) ont été cultivées dans RPMI 1640 additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100
pg /ml de pénicilline /streptomycine à 37 ° C CO 5% _{2 incubateur humidifié. Ces lignées cellulaires ont été obtenus auprès de la Banque coréenne cellulaire Line (Séoul, Corée).}

Culture de 293FT lignée cellulaire

293FT cellules ont été maintenues dans du DMEM additionné de 10% de sérum de veau fœtal et mM MEM 0,1 non-acides aminés essentiels (NEAA), pyruvate de sodium mM MEM 1 (tous deux de SIGMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM de L-glutamine (Life Technologies, grand Island, NY, USA), et 1% Pen-Strep dans un CO 5% _{2 incubateur humidifié.}

séquençage de l'ARN et l'analyse des données

Bibliothèque a été préparé en utilisant le kit de préparation échantillon IlluminaTruSeq ARN et séquences en utilisant le Illumina Genome Analyzer IIx (San Diego, CA, USA) pour générer 76 pb fin appariés lit. Séquencée lectures ont été alignées sur un génome humain de référence 19 en utilisant Tophat 2 [id pubmed 19289445]. expression de l'ARNm a été mesurée comme RPKM (Reads Per Kilobase par million mappé lit) à partir de mappée unique se lit en utilisant un modèle de RefSeq de hg19 et le paquet de HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). fichiers de lit ont été produites en utilisant Tophat 2. Toutes les données de séquençage de l'ARN ont été déposés au dépôt public (GEO Numéro d'accession: GSE46597)

PCR en temps réel

Extraction de l'ARN et PCR en temps réel ont été effectuées. à l'aide d'une puissance SYBR Green PCR master Mix et un 7500 détecteur de séquence ABI Prism (tous deux de Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), comme décrit précédemment [28]. Les séquences d'amorces utilisées (avant et arrière, respectivement) sont les suivants: des marqueurs de différenciation; CA1, 5'TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG-3 'et 5'CCT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G-3'; SSTR2, 5'CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG-3 'et 5'CAG TGT GAC ATC TTT GCT TTT GCC C-3'; CVGA, 5'GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C-3 'et 5'TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT-3'; PGC2, 5'TGG CCT ACC CTG CTC TGT GCC -3 'et 5'ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG -3'; MUC5AC, 5'TCA CAC GGT CCT GCC CAC AGA G-3 'et 5'ACC CCT GCA TCT CAG AGC CCC -3'; ATP4B, 5'GAA AGC CCA GCC CCA CTA CAG C-3 'et 5'TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3'; marqueurs stemness; CD44, 5'GCC TGG GGA CTC TGC CTC GT-3 'et 5'AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3'; LGR5, 5'GAG CTG CCT TCC AAC CTC AG -3 'et 5'CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC -3'; BMI1, 5'TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG 3 'et 5' AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG-3 '; et c-Myc, 5'ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA -3 'et 5'-CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3'; Atoh1, 5'CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG -3 'et 5'-ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC-3'; GAPDH 5'GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC-3 'et 5'-ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC -3'. GAPDH a été utilisée pour normaliser les niveaux d'entrée d'ADNc

Analyse par Western blot

analyse Western blot ont été réalisées comme décrit précédemment [24], en utilisant les anticorps suivants:. Atoh1 (LSBio, Seattle, WA, États-Unis ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); c-Myc, caspase-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); caspase-3 clivée, caspase-9, clivé caspase-9 (Cell Signaling Technology, MA, USA); p21, anticorps β-actine (Abcam, Cambridge, MA, USA) et de l'anticorps secondaire conjugué à HRP (Jackson Immuno Laboratories, West Grove, PA, USA).

constructions lentiviraux et la génération de virus actif

Pour créer un clone d'expression, la séquence vérifiée virale ORF Clones (Atoh1, IOH34744; Life Technologies, grand Island, NY) en entrée des vecteurs de la passerelle ont été transférés dans pLenti7.3-DEST vecteur (pLenti7.3/V5 DEST Gateway Kit de Vector, Life technologies, grand Island, NY, USA) en utilisant une réaction LR de recombinaison (enzyme mix LR Clonase II, Life technologies, grand Island, NY, USA). Pour la transformation, One Shot Stbl3 compétente E. coli (Life Technologies) a été utilisé. Après cotransfection du clone d'expression et l'emballage ViraPower Mix (Life Technologies) dans le 293FT Cell Line (Life Technologies) pour produire lentivirus, surnageants lentiviraux ont été récoltés. Ces stocks lentiviraux ont été utilisés pour transduire GCSCs et des lignées cellulaires de cancer gastrique.

collecte et à la propagation de virus ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant (Life Technologies). Le virus de contrôle a été généré en parallèle sans l'inclusion de Atoh1.

Construction de lignées cellulaires RASSF4-rapporteurs et dosage de la luciférase

Le Gluc-ON Promoteur Reporter Clones, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) ont été utilisés pour construire des lignées cellulaires rapporteurs RASSF4-luciférase (NCI-N87 et SNU216 cellules) et puromycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été utilisé pour la sélection. Le lentivirus décrit ci-dessus a été utilisé pour induire Atoh1. activités luciférase ont été mesurées en utilisant Secrete-Pair Gaussia Assay Kit luciférase (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) selon les instructions du fabricant à 72 h post-transduction.

xénogreffe test

Les cellules ont été diluées à une dose d'injection approprié (1x10 ^{6 cellules), mélangé avec BD Matrigel (BD Biosciences, CA, USA) à un rapport de 1: 1, et injection sous-cutanée sur la face dorsale de chaque flanc de déficit immunitaire combiné sévère (SCID) (n = 5 /groupe). Pour réduire au minimum la variabilité expérimentale en raison des différences individuelles dans les souris receveuses, des populations de cellules qui devaient être comparées ont été injectées sur les flancs opposés de ces mêmes animaux. Les tumeurs ont été récoltées au bout de 4 semaines et les poids des tumeurs ont été mesurés. Pour le modèle de métastases hépatiques, des souris SCID ont été anesthésiés par une injection intra-péritonéale de combinaison de kétamine /xylazine. Ensuite, les souris ont été incisés environ 10 mm sur le sous-costale gauche, la rate a été confirmée dans le péritoine, le péritoine a été ouverte pour environ 8 mm et la rate a été exposée sur le péritoine. Les cellules (5x10 4 cellules /100 ul
) ont été lentement injecté dans la rate de souris par l'intermédiaire d'une aiguille de calibre 27 (n = 5 /groupe), puis la rate a été retourné à la cavité abdominale le péritoine et la plaie a été suturée. 4 semaines après l'inoculation des cellules, les souris ont été sacrifiées [37]. Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par l'Institut national de la santé. Pusan ​​National University-Institutional Animal Care et utilisation Comité (PNU-IACUC) a approuvé toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux.}

La prolifération cellulaire test

Cinq jours après transduction avec lentivirus, 10 ul
de pré-mélangé soluble dans l'eau -tétrazolium-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) a été ajouté dans les puits. Ces cellules ont ensuite été incubées pendant deux heures et la viabilité cellulaire a été déterminée en mesurant l'absorbance à 450 nm en utilisant un lecteur ELISA (Tecan Männedorf, Suisse).

Sphère essai de formation

sphères ont été dissociées en cellules isolées et plaquées dans des plaques à 96 puits dans 0,2 ml volumes de médias. Chaque puits de la plaque de 96 puits contenait moins de 10 cellules. Les cellules ont ensuite été cultivées et surveillées pendant 5-7 jours. Sphères de plus de 25 um ont été comptées en utilisant le microscope inversé et l'efficacité de la formation de la sphère a été comparée.

L'analyse des données

Le Mann-Whitney U-test non paramétrique ou test t de Student (apparié la comparaison) ont été utilisées pour déterminer les significations des différences entre les valeurs moyennes des deux groupes, et une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie de comparaisons multiples de Tukey a été utilisé pour déterminer les significations des différences entre les valeurs moyennes de trois ou plusieurs groupes . * Indique une valeur de P < 0,05, qui a été considéré le critère de signification. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel SPSS, version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Les résultats sont présentés comme des moyens SDs ±.

Résultats

Induction de Atoh1 au cours de la différenciation des GCSCs

La différenciation des GCSCs par le sérum a été démontré précédemment [6]. Identifier les facteurs associés à la différenciation, nous avons comparé les profils d'expression de l'ARNm des cellules souches et des cellules dans des états de cellules différenciées par séquençage de l'ARN. De nombreux gènes suppresseurs de tumeur ont été induits au cours de la différenciation (données non présentées). Il est intéressant de Atoh1, un facteur critique pour la différenciation des cellules épithéliales de l'intestin de la transcription, a également été induite. Pour confirmer cette induction de Atoh1 lors de la différenciation, nous avons examiné les changements dans le niveau d'expression de Atoh1 par PCR en temps réel et analyse par transfert de Western. Nous avons trouvé que GCSCs approchèrent stade terminal de différenciation, l'expression de Atoh1 augmenté (figure 1).

surexpression de Atoh1 induit la différenciation des GCSCs

Pour déterminer les rôles de Atoh1 lors de la différenciation GCSC, nous avons surexprimé dans GCSCs en utilisant des lentivirus. Pour vérifier les états de différenciation, nous avons examiné les niveaux de différents marqueurs de différenciation ou stemness expression. Notamment, la surexpression de Atoh1 en GCSCs a augmenté le niveau de différents marqueurs de différenciation d'expression, mais a diminué les niveaux de différents marqueurs stemness (Fig 2) d'expression.

Ensuite, nous avons étudié si Atoh1 pouvait réguler la prolifération ou de la formation de la sphère. Fait intéressant, la surexpression de Atoh1 diminué de manière significative la prolifération de divers types de lignées cellulaires de cancer gastrique et la formation de la sphère par GCSCs (figure 3).

Atoh1 réduit la surexpression tumorigénicité in vivo

pour déterminer si Atoh1 peut régler la in vivo
tumorigène des cellules de cancer gastrique, nous avons utilisé un modèle de métastases hépatiques produit par l'injection de cellules de cancer gastrique dans la rate (cellules par la suite migré vers le foie). En particulier, la surexpression de Atoh1 réduit significativement la formation de tumeurs dans le foie par GCSCs et par les cellules cancéreuses gastriques NCI-N87 (figure 4). De plus, lorsque nous avons fait des xénogreffes sous-cutanées, des résultats similaires ont été observés (figure 4).

Atoh1 augmentation de l'activité de promoteur RASSF4

Pour confirmer si la différenciation des GCSCs par Atoh1 est médiée par son activité transcriptionnelle
, nous avons examiné l'activité de promoteur d'un gène cible Atoh1 (RASSF4) en utilisant des dosages de luciférase [29]. Après que le promoteur RASSF4, qui est couplé avec le gène lucifease, a été introduit de manière stable dans les lignées cellulaires de cancer gastrique (NCI-N87 et les cellules SNU216), nous avons examiné les effets de Atoh1 sur l'activité de la luciférase. Transduction avec Atoh1 a augmenté de manière significative l'activité de luciférase du promoteur RASSF4. (Figure 5).

L'implication de l'apoptose et le cycle cellulaire des voies dans les effets de Atoh1

Les rapports précédents ont signalé l'apoptose et le cycle cellulaire des voies sont impliqués dans les effets de Atoh1 sur les tumeurs de la rétine [30] et du côlon [25]. Donc, nous avons examiné si les protéines apparentées sont également impliqués dans les effets de Atoh1 sur la prolifération (figure 3A) et la formation de la sphère (figure 3B) dans la présente étude. Le changement dans la prolifération et la formation de la sphère pourrait être due à un cycle plus lent de la cellule, soit un taux apoptotique accrue, ou les deux.

Nous avons trouvé que la transduction avec Atoh1 a augmenté le taux de clivage caspase-3 et de caspase-9 dans GCSCs et des lignées cellulaires de cancer gastrique (figure 6), ce qui suggère que la voie de l'apoptose intrinsèque peut être impliquée. De plus, nous avons également constaté une régulation de p21 sur Atoh1 surexpression (figure 6).

Discussion

Dans la présente étude, nous montrons que Atoh1, un facteur de transcription HLH, peut induire la différenciation de GCSCs, ce qui conduit à une perte de tumorigénicité. Atoh1 surexpression a été montré précédemment pour induire la différenciation des cellules souches intestinales dans des cellules sécrétoires [24] et chez des souris nulles pour Atoh1, les cellules sécrétoires sont pas générés dans l'intestin [26]. Cet effet sur la différenciation de Atoh1 a également été observée dans les cellules cancéreuses colorectales, dans laquelle elle a agi comme un suppresseur de tumeur. En outre, dans environ 70% des cancers colorectaux, son expression a été rapportée être diminuée par des mécanismes génétiques et épigénétiques [25,31]. Dans les cellules du cancer colorectal, Atoh1 surexpression réduit la prolifération et la croissance dans la gélose molle et xénogreffes [31], et la suppression de la tumorigénicité Atoh1 améliorée chez la souris [25]. Ces résultats indiquent collectivement que Atoh1 peut être utilisé comme thérapie de différenciation pour les cancers gastro-intestinaux.

Contrairement à son effet sur la différenciation, Atoh1 peut également favoriser la prolifération des cellules souches et la formation de tumeurs. Au cours du développement du cervelet de souris, Atoh1 a été trouvé pour lancer le programme de différenciation des précurseurs du cervelet granule de neurones à un stade précoce (P0). Cependant, à un stade ultérieur (P5), il a encouragé la prolifération des précurseurs [32,33,34]. Atoh1 délétion au P0, fortement inhibée la différenciation, mais sa suppression à un stade ultérieur a donné lieu à la sortie du cycle cellulaire et la différenciation [35]. Ces différents rôles de Atoh1 à différents stades peuvent être expliqués par différents targetomes [35]. Atoh1 promu la formation de médulloblastome ainsi que la signalisation Hedgehog voie Shh [36,37]. En outre, son expression a été jugée significativement élevée dans adénocarcinome mucineux, le carcinome chevalière, et les tumeurs neuroendocrines intestinales [38]. Par conséquent, pour être en mesure d'utiliser Atoh1 pour la thérapie de différenciation, ses cibles directes qui induisent la différenciation doivent être identifiés.

Bien que les statuts expressionnelles de Atoh1 ont été rapportés dans la muqueuse gastrique normale et dans le cancer gastrique, ses rôles sont mal caractérisé. Atoh1 est exprimée dans les cellules humaines gastriques épithéliales normales à des niveaux faibles [39,40], mais son expression n'a pas été observée dans les cellules epitheliales gastriques normales dans l'estomac de la souris [26]. En outre, la souris et la muqueuse gastrique métaplasique humaine a montré l'expression de Atoh1 [41], mais son expression n'a pas été observée dans les lignées cellulaires de cancer gastrique, y compris MKN74, MKN45, KATOIII et HSC58 [40]. Chez certains patients atteints de cancer gastrique, il est surexprimée [39]. Ses rôles physiopathologiques ont jamais été explorées dans le cancer gastrique. Dans la présente étude, nous avons découvert que l'induction de l'expression de Atoh1 peut réduire la prolifération, l'invasion et la tumorigénicité des cellules cancéreuses gastriques. Nous avons également constaté l'implication possible de p21 et la voie de l'apoptose dans les effets de Atoh1.

Nos observations suggèrent la possibilité que le gène Atoh1 doit être considérée comme cible de traitement potentiel du cancer gastrique. Les petites molécules qui induisent l'expression ou la thérapie génique utilisant des cellules souches virales ou pourraient être développés. En particulier, Atoh1 a été trouvée pour induire la différenciation des cellules souches du cancer gastrique et, par conséquent, la thérapeutique ciblant Atoh1 pourraient être capables d'éradiquer les cellules souches cancéreuses.

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