PLOS ONE: ZIC1 promoteur hyperméthylation dans l'ADN Plasma est un biomarqueur potentiel pour le cancer gastrique et néoplasie intraépithéliale

Résumé

Le cancer gastrique (GC) reste l'un des cancers digestifs les plus communs dans le monde entier; cependant, la plupart des patients présentent à un stade avancé au moment du diagnostic initial. ZIC1
est un gène suppresseur de tumeur candidat roman qui est épigénétique taire en GC. Dans cette étude, nous avons étudié promoteur de la méthylation de l'ADN ZIC1 plasmatique comme marqueur moléculaire roman pour le diagnostic précoce et le suivi du GC. la réaction en chaîne par polymérase (MSP) de test spécifique à la méthylation a été effectuée pour détecter promoteur de la méthylation de l'ADN dans ZIC1 de plasma provenant de 20 sujets sains, 50 patients gastriques néoplasies intraépithéliales et 104 patients atteints de GC. Le ZIC1 de taux de méthylation de promoteur dans les échantillons de plasma du groupe témoin sain était de 0%, mais elle a atteint 54,0% dans le groupe de néoplasie intraépithéliale et 60,6% dans le groupe GC. Les deux dernières valeurs sont significativement plus élevée que celle observée dans le groupe témoin en bonne santé (p < 0,05), avec une spécificité de 100% pour le diagnostic des néoplasies intraépithéliales et GC. La valeur prédictive positive de plasma promoteur de la méthylation de ZIC1 pour le diagnostic de néoplasie intraépithéliale et GC était de 100%. état de méthylation du groupe CG n'a pas été significativement associée à la taille de la tumeur, la différenciation de la tumeur, les métastases des ganglions lymphatiques, la classification TNM, ou l'invasion tumorale (p > 0,05). Évaluation de l'importance de la détection de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA) niveau et ZIC1 de taux de méthylation du promoteur pour le diagnostic de GC a révélé que la sensibilité de promoteur de la méthylation de ZIC1 était significativement plus élevée que celle de le niveau CEA comme un marqueur et que la mesure combinée de ces deux indices (test en parallèle) une sensibilité améliorée. Pris ensemble, nos résultats suggèrent que la ZIC1 de taux de méthylation de promoteur dans l'ADN dérivé du plasma est d'une grande importance pour le dépistage précoce du GC et le suivi de la tumorigenèse. promoteur de la méthylation de ZIC1 peut servir de biomarqueur de plasma non-invasive nouvelle pour la détection précoce du GC et pour l'évaluation des risques dans les populations à risque élevé. La mesure combinée de la ZIC1
taux de méthylation du promoteur et le niveau CEA (test parallèle) peut améliorer les lignes directrices actuelles pour le diagnostic précoce du GC

Citation:. Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015) Promoteur hyperméthylation de ZIC1 dans l'ADN plasma est un biomarqueur potentiel pour le cancer gastrique et néoplasie intraépithéliale. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10.1371 /journal.pone.0133906

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, JAPON

reçues: 10 Avril 2015; Accepté 2 Juillet 2015; Publié le 24 Juillet, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Chen et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été financé par la national science Foundation naturel de Chine (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang médical provincial et le plan de la santé générale de la recherche (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang Département provincial de plan de recherche Education (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), et clé équipe innovation scientifique et technologique province du Zhejiang (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Le bailleur de fonds Shujie Chen pensé et conçu des expériences pour ce manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Le cancer gastrique (GC) est l'un des cancers digestifs les plus communs et la troisième principale cause de décès liés au cancer dans le monde [1]. La majorité des patients du GC présents à un stade avancé au moment du diagnostic initial. À l'échelle mondiale, GC représente près de 952 000 nouveaux cas par an selon l'Globocan 2012 [2]. Au Japon, le taux de survie à 5 ans pour le début de GC (EGC) est de 86% par rapport à 32% pour GC avancé, tel que rapporté par le programme américain SEER [3].

Aberrant méthylation de l'ADN est une épigénétique importante le changement et un événement précoce dans la carcinogenèse [4]. Récemment, plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs (STG), y compris FAM5C
, Mylk
, p16
et E-cadhérine
, ont été signalés à être méthylé dans le sérum /plasma de patients du GC [5-7]. En outre, l'hyperméthylation de TSG a tendance à être amélioré avec la progression des lésions pré-cancéreuses [8-9]. Par conséquent, la détection de l'ADN méthylé dans le sérum /plasma peut être une approche prometteuse pour le diagnostic précoce de la CG. néoplasie intraépithéliale (IN) est une lésion potentiellement précancéreuse qui confère un risque élevé de GC; ainsi, le dépistage des patients IN est crucial pour le diagnostic et la prédiction de GC. Peu de rapports d'ADN hyperméthylé analyses des échantillons de sang provenant de néoplasie intraépithéliale gastriques (GIN) patients sont disponibles à ce jour.

L'évidence croissante indique que ZIC1
( Zic
membre de la famille 1 , impair apparié Drosophila homolog) participe à la progression de plusieurs types de cancers [10-13]. Nous avons déjà découvert que ZIC1
, un roman TSG, est réduit au silence par l'intermédiaire promoteur hyperméthylation dans les deux cellules et les tissus [14] GC. Nous avons également démontré que ZIC1
est impliqué dans l'inhibition de la survie des cellules de GC et une altération de la migration cellulaire [15].

Dans la présente étude, nous avons déterminé les potentiels de diagnostic et prédictifs précoces de ZIC1 de l'hyperméthylation dans le plasma des patients atteints de GC. Nous avons mesuré l'état de méthylation du promoteur ZIC1
dans le plasma de patients avec GC ou GIN et contrôle normal (NC) sujets. L'association de promoteur de la méthylation de ZIC1 avec des paramètres clinicopathologiques a également été évaluée. En outre, nous avons classé haute qualité IN et T1 GC comme EGC et placé les GC et GIN patients dans un GC ainsi que dans le groupe (GPI). Ensuite, nous avons analysé la Les taux d'hyperméthylation de ZIC1 à la fois l'EGC et les groupes GPI. En outre, l'évaluation combinée de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA) niveau et promoteur de la méthylation de ZIC1 pour le diagnostic de GC a été évaluée en utilisant le plasma des GC et GIN patients.

Matériel et méthodes

échantillons cliniques

des échantillons de plasma ont été obtenus en préopératoire à Sir Run Run Shaw Hôpital, Hangzhou, Zhejiang, en Chine, à partir de Novembre 2012 Avril 2015. Tous les patients inclus dans notre étude ont subi gastroendoscopy et ont été regroupées selon le diagnostic histopathologique. Des échantillons de plasma ont été prélevés sur GC et GIN patients qui étaient naïfs aux traitements curatifs, tels que la chimiothérapie, la radiothérapie et la résection chirurgicale. Les critères d'exclusion comprenaient les maladies gastro-intestinales avec d'autres causes et maladies dans d'autres organes. Les patients présentant des métastases gastriques d'autres tumeurs ont également été exclus.

Nous numéroté les échantillons selon l'ordre dans lequel elles ont été recueillies et ensuite effectuées réaction en chaîne par polymérase spécifique de la méthylation (MSP) pour évaluer les échantillons dans l'ordre numérique. Les échantillons ont ensuite été regroupés en fonction des résultats de pathologie. Les échantillons de plasma ont été prélevés sur 104 patients du GC avec un âge moyen de 59,8 ans, qui ont été diagnostiqués selon les critères de l'Organisation mondiale de la santé [16]. Cinquante patients GIN avec un âge moyen de 58,0 ans ont été diagnostiqués par gastroscopie. Des échantillons de sang ont également été recueillies auprès de 20 volontaires sains dans le groupe CN avec un âge moyen de 38,5 ans.

Éthique déclaration

Notre projet a reçu l'approbation du comité d'éthique de la recherche clinique de l'Institut de gastroentérologie de l'Université de Zhejiang. Un consentement éclairé écrit a été obtenu auprès de chaque patient avant le prélèvement de l'échantillon. Les personnes qui ont participé à cette étude ont donné un consentement éclairé écrit (comme indiqué dans le PLOS
formulaire de consentement) de publier ces détails de cas.

isolement de l'ADN et de bisulfite modification

ADN a été extrait des échantillons de plasma de sang en utilisant un kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne). Les concentrations d'ADN ont été mesurés par spectroscopie à une longueur d'onde de 260 nm. ADN a été traité au bisulfite avec un kit ADN Zymo Modification (Zymo Research, Orange, CA, USA). L'ADN modifié a été stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.

tests MSP

promoteur de la méthylation de ZIC1 a été examiné par effectuer des dosages MSP utilisant mentionnés ci-dessus bisulfite modifié gratuitement ADN plasmatique comme matrice. MSP a été réalisée pendant 40 cycles à une température d'hybridation de 56 ° C comme décrit précédemment [14]. Les amorces spécifiques de méthylation étaient ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) et ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), et les amorces non méthylés spécifiques étaient ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) et ZIC1-UR (5' CCCATTAACCACATTAAACA). Le protocole de PCR comprenait une première dénaturation à 95 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, annelage à 56 ° C pendant 40 s, extension d'amorce à 72 ° C pendant 40 s et extension finale à 72 ° C pendant 7 min. Les produits de PCR ont été soumis à une électrophorèse sur 1,5% de gels d'agarose, colorés avec Gel Rouge, et visualisés par illumination UV.

Sérum CEA test

Les échantillons de sérum ont été envoyés au laboratoire clinique de Sir Run Run Hôpital Shaw pour les tests, et une concentration de CEA > 5 ng /mL a été considérée comme anormale.

Analyses statistiques

Les fréquences de méthylation et les niveaux du CEA dans les échantillons de plasma ont été comparés en utilisant le test exact de Fisher. L'association entre les caractéristiques clinicopathologiques et l'ADN hypermethylation a été analysée en utilisant le test du chi carré. La valeur diagnostique de la combinaison de promoteur de la méthylation de ZIC1 et le niveau du CEA de plasma a été évaluée en fonction de l'aire sous la courbe ROC (AUC). La sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives pour le diagnostic pathologique ont été calculés avec des intervalles de confiance à 95% pour promoteur de la méthylation de ZIC1 ou méthylation du promoteur
ZIC1 combiné avec le niveau du CEA. rapports de vraisemblance positifs et négatifs ont également été calculés. Pour tous les tests, une valeur de p <cut-off; 0,05 a été appliqué pour déterminer la signification statistique. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS 19.0 logiciel (SPSS Inc., Chicago, IL).

Résultats

état de méthylation dans le plasma

Pour évaluer les modifications dans promoteur de la méthylation de ZIC1 en GC, nous avons d'abord détecté l'état de méthylation de ce promoteur dans 104 patients avec GC, 50 avec GIN, 31 avec EGC et 20 CN et effectué des comparaisons entre les groupes. Les taux de la ZIC1 de promoteur dans les échantillons de plasma étaient 0% dans le groupe NC (0%), passant à 54,0% dans le groupe de GIN et à 60,6% dans le groupe GC (p <méthylation; 0,001 pour les deux GIN et GC vs NC), avec 100% de spécificité pour le diagnostic GPI (20/20) (figure 1). Les valeurs prédictives positives et négatives et les rapports de vraisemblance positifs et négatifs pour le diagnostic IN et GC étaient de 100% (90/90), 23,8% (20/84), infini et 0,42, respectivement. Les résultats d'analyse de MSP représentant pour promoteur de la méthylation de ZIC1 sont présentés dans la figure 2.

Association des caractéristiques clinico avec promoteur de la méthylation de ZIC1 dans le plasma des patients du GC

Nous avons ensuite corrélé les caractéristiques clinico avec le ZIC1 de taux de méthylation de promoteur dans le plasma des patients du GC afin d'identifier toutes les associations. Les résultats ont révélé aucune association marquée entre les le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et les paramètres cliniques, y compris la taille de la tumeur, le grade de différenciation, de l'état des ganglions lymphatiques, la profondeur de l'invasion tumorale et le stade TNM (p > 0,05) (tableau 1) .

détermination combinée de ZIC1 de l'hyperméthylation et le niveau CEA

l'importance de la détermination combinée de la le taux de hypermethylation de ZIC1 et le niveau du CEA pour la le diagnostic et la prédiction précoce du GC a été analysée. Nous avons mesuré le niveau du CEA dans 9 NCS, 24 patients GIN et 71 patients du GC avant le traitement. Les sensibilités de niveau CEA dans les groupes GC, IN, et EGC ont été de 22,5% (16/71), 16,7% (24/04) et 10,5% (2/19), respectivement. Dans tous les 3 des groupes, la sensibilité de promoteur de la méthylation de ZIC1 était significativement plus élevée que celle du niveau de la CEA (p < 0,05).

détermination combinée de ZIC1
hypermethylation et le niveau CEA dans le groupe de GC.

dans le groupe GC, la sensibilité et la spécificité de la détermination combinée de l'em> le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et le niveau du CEA (test en tandem) <étaient 16,9 % et 90,9%, respectivement (tableau 2). La sensibilité de l'analyse combinée de ces deux paramètres (essais en parallèle) a été de 69,0% (tableau 2), ce qui était supérieur à celui des sensibilités obtenues par l'essai de chaque paramètre seul. ROC analyse de la courbe a été réalisée pour évaluer l'importance du taux de méthylation de l'ADN et le niveau CEA pour le diagnostic GC. L'AUC pour le test de méthylation du promoteur de ZIC1 seul était 0,610 (S1 Fig) et que pour l'évaluation combinée de promoteur de la méthylation de ZIC1 et le niveau du CEA (test en tandem) était 0,539 (S2 Fig) . Notamment, lorsque promoteur de la méthylation de ZIC1 et le niveau du CEA ont été analysés en parallèle, l'AUC a augmenté à 0,633 (figure 3). Sur la base des résultats ci-dessus, la détermination combinée de la le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et le niveau CEA (test parallèle) pour le diagnostic de GC a été jugée synergique par rapport à l'utilisation de chaque méthode seule.

détermination combinée de ZIC1 de l'hyperméthylation et le niveau CEA dans le groupe GPI.

dans le groupe GPI, la sensibilité et la spécificité de la détermination combinée de la em> ZIC1
taux de méthylation le test de méthylation du promoteur de ZIC1 seul était 0,792 (S3 Fig) et que pour l'évaluation combinée de la le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et le niveau du CEA (test parallèle) était 0,771 (Fig 4). Par conséquent, la détection de promoteur de la méthylation de ZIC1 pourrait être une alternative plus efficace pour le diagnostic GPI.

Discussion

Récemment, de nombreux gènes ont été trouvés être méthylé dans les tissus du GC , y compris E-cadhérine
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, SFRP1
et PTEN
[17]. les fréquences de méthylation rapportés ont varié de 56% à 96% [17]. Méthylation de l'ADN a également été observée dans les échantillons de sang provenant de patients atteints de GC. Plusieurs TSG ont été trouvés pour être méthylé dans des échantillons de sang provenant de patients du GC, y compris p16
, E-cadhérine
et RAR
, avec des taux de détection de 37% à 48%, respectivement [18-21].

ZIC1
est aberrantly downregulated dans certains types de cancer, indiquant sa fonction comme un TSG. Nos travaux antérieurs ont révélé que le ZIC1 de promoteur est souvent méthylé dans les tissus de carcinome gastrique primaire, avec un taux de détection élevé de 94,6%, mais pas dans les tissus gastriques normaux [14]. Nos résultats ont révélé que ZIC1
est un roman candidat TSG qui est downregulated via promoteur hypermethylation en GC. plasma Cependant, au mieux de notre connaissance, aucune étude n'a étudié le promoteur de la méthylation de ZIC1 en GC ou GIN.

Dans la présente étude, nous avons d'abord démontré que la méthylation aberrante du ZIC1 de promoteur n'a pu être détectée dans le plasma de patients atteints GIN GC et à des fréquences de 60,6% et 54,0%, respectivement, qui étaient significativement plus élevés que ceux des commandes numériques. Ces résultats sont cohérents avec ceux des études précédentes [14]. D'un point de vue diagnostique, promoteur de la méthylation de ZIC1 présentaient une spécificité élevée pour discriminer les CN des GC et GIN patients (100%). Nos résultats ont également démontré que la détection de la le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 avait une valeur prédictive positive élevée et un rapport de vraisemblance positif et l'ASC pour GC et le diagnostic de GIN, suggérant que l'évaluation de méthylation du promoteur de ZIC1 a utilité potentielle pour le diagnostic et la prédiction précoce de la GC.

de nombreuses études antérieures ont porté sur périphérique méthylation de l'ADN du sang dans GC plutôt que les patients atteints de GIN, avec seulement une poignée d'études portant sur la méthylation d'ADN dans GIN. Le développement des techniques endoscopiques a permis la disponibilité des traitements plus efficaces et moins invasives pour EGC et GIN patients. Dans l'ensemble, le dépistage de GIN contribue à la surveillance du GC et la réduction des décès liés à la GC. Un aspect intéressant de la présente étude est que nous avons démontré aberrante promoteur de la méthylation de ZIC1 dans le plasma de patients GIN, avec un taux de détection qui était significativement plus élevé que celui des sujets NC (p < 0,001). Dans l'avenir, la détection de hyperméthylation du ZIC1 de promoteur pourrait potentiellement être utilisé comme un signe d'alerte précoce ou à l'écran pour GC dans les groupes à haut risque.

Nous avons également évalué ZIC1
méthylation de promoteur dans le plasma de patients du GC en association avec divers paramètres clinicopathologiques. Non statistiquement relations significatives ont été observées entre les promoteur de la méthylation de ZIC1 et les différents paramètres cliniques, y compris la taille de la tumeur, le grade de différenciation, de l'état des ganglions lymphatiques, la profondeur de l'invasion tumorale et le stade TNM; Cependant, dans notre précédente étude [15], ZIC1 de la méthylation a été trouvé pour être impliqué dans GC invasivité. Dans la présente étude, la plupart des patients du GC ont été diagnostiqués et traités à un stade précoce, ce qui peut avoir influencé les résultats finaux. Validation dans une population plus importante pourrait fournir des indications sur ces résultats différents. Que existe une corrélation entre aberrante promoteur de la méthylation de ZIC1 et les caractéristiques cliniques GC exige une clarification par une analyse plus approfondie.

Le CEA est un marqueur tumoral classique qui est communément évaluée en clinique. Ce marqueur est considéré comme étant le plus souvent présents chez les patients atteints de GC tardives; Cependant, de nombreuses études ont montré que la méthylation d'ADN peut être détectée à partir des premiers stades de la GC. Dans notre étude, une courbe ROC a été généré pour évaluer l'importance de la détection combinée de la le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et le niveau CEA (test parallèle) pour le diagnostic de GC, révélant que leur détection combinée produit plus des résultats significatifs que la détection de l'un des paramètres seul. Par conséquent, nous suggérons que la mesure combinée de la le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et le niveau CEA peut améliorer le diagnostic de la GC.

En conclusion, nos résultats ont révélé que la mesure de promoteur de la méthylation de ZIC1 dans l'ADN dérivé du plasma est d'importance pour la détection précoce du GC et pour l'évaluation des risques dans les populations à risque élevé. La mesure combinée de la le taux de méthylation du promoteur de ZIC1 et le niveau CEA (test parallèle) peut améliorer les lignes directrices actuelles pour le diagnostic précoce du GC; cependant, d'autres études avec des échantillons plus importants et la validation clinique sont nécessaires.

Informations complémentaires
S1 Fig. Détection de promoteur de la méthylation de ZIC1 dans le cancer gastrique (GC) des échantillons de plasma.
Une courbe ROC pour évaluer l'importance de la ZIC1
test de méthylation du promoteur pour le diagnostic de GC.
Doi : 10.1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 Fig. détection combinée de promoteur de la méthylation de ZIC1 et (essais en tandem) au niveau du CEA dans le cancer gastrique (GC) des échantillons de plasma.
Une courbe ROC pour évaluer l'importance de la détection combinée des deux paramètres (test en tandem .) pour le diagnostic de GC
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 Fig. Détection de promoteur de la méthylation de ZIC1 dans néoplasie intraépithéliale gastriques (GPI) échantillons de plasma.
Une courbe ROC pour évaluer l'importance de la ZIC1 de l'essai de méthylation du promoteur pour le diagnostic GPI.
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

• PLOS ONE: Regulatory Fonction B Cell est supprimée par le tabagisme et l'obésité Sujets chez H. pylori-Infected et est corrélée avec un risque élevé de gastrique Cancer
• PLOS ONE: exosomal miARN du péritoine Lavage Fluid comme potentiels Prognostic Biomarqueurs de péritonéale Métastase dans gastrique Cancer