PLOS ONE: Silencing de Claudin-11 est associée à une invasivité des cellules de cancer gastrique

Résumé

Contexte

Claudins sont des protéines membranaires qui jouent un rôle critique dans la jonction (TJ) formation et la fonction étanche. Les membres de la famille des gènes claudin ont été démontrés être régulée de manière aberrante, et de participer à la pathogénèse de divers cancers humains. Dans la présente étude, nous déclarons que la claudine-11 ( CLDN11
) est réduit au silence dans le cancer gastrique via
hypermethylation de sa région de promoteur.

Méthodologie /Principales constatations

niveaux de CLDN11 de la méthylation et l'expression de l'ARNm ont été mesurés dans des tissus primaires gastriques du cancer, des muqueuses gastriques non cancéreuses, et des lignées cellulaires d'origine gastrique à l'aide quantitative spécifique de la méthylation PCR (QMSP) et quantitative de la transcriptase inverse-PCR (qRT-PCR), respectivement. Les analyses des cancers gastriques appariés et tissus gastriques normaux adjacents hyperméthylation révélée du CLDN11
région de promoteur dans les cancers gastriques, et ce hyperméthylation était significativement corrélée avec la régulation négative de CLDN11 de l'expression vs.
tissus normaux. La région promotrice de CLDN11 a également été hyperméthylés dans toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique testés par rapport à des cellules épithéliales gastriques normales immortalisées. En outre, ARNm l'expression de CLDN11 a été inversement corrélée avec le niveau de méthylation. Traitement de CLDN11
-nonexpressing cellules de cancer gastrique avec 5-aza-2'-désoxycytidine restauré CLDN11 de l'expression. knockdown De plus, siRNA-médiée de CLDN11 de l'expression dans les cellules épithéliales gastriques normales ont augmenté leur motilité et l'invasivité.

Conclusions /Importance

Ces données suggèrent que l'hyperméthylation de CLDN11
, conduisant à l'expression régulée à la baisse, contribue à la carcinogenèse gastrique en augmentant la motilité cellulaire et l'invasivité. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents du rôle des claudine protéines dans la carcinogenèse gastrique sera probablement aider à l'identification de nouvelles approches pour le diagnostic et le traitement du cancer gastrique

Citation:. Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et al. (2009) Silencing de Claudin-11 est associée à une invasivité des cellules de cancer gastrique. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10.1371 /journal.pone.0008002

Editeur: Fatah Kashanchi, George École de médecine de l'Université de Washington, États-Unis d'Amérique

Reçu 3 Août 2009; Accepté le 23 Octobre 2009; Publié le 24 Novembre, 2009

Droit d'auteur: © 2009 Agarwal et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par les États-Unis National Institutes of Health accorde CA085069, CA138677 et CA146799 à SJ Meltzer. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) reste la deuxième cause la plus fréquente de décès par cancer au niveau mondial. Elle est l'une des tumeurs malignes les plus meurtrières et une des principales causes de décès par cancer dans les pays en développement, avec des taux de survie globale à 5 ans est inférieure à 20% [1],

Études de glucocorticoïdes et leur précurseur prénéoplasique [2].
lésions ont identifié plusieurs altérations génétiques et épigénétiques, y compris l'instabilité des microsatellites, des mutations ponctuelles, et la perte d'hétérozygotie (LOH) affectant les gènes suppresseurs de tumeur (TSG) [3] - [6]. Néanmoins, la pathogenèse moléculaire de GC est encore mal compris.

altérations épigénétiques sont extrêmement importantes dans le développement du cancer et de la progression [7]. inactivation transcriptionnelle des gènes suppresseurs de tumeur via aberrante promoteur hyperméthylation des îlots CpG, provoquant le silençage génique permanent, est un mécanisme épigénétique majeur de TSG inactivation.

Auparavant, des études ont été publiées sur le promoteur hypermethylation en glucocorticoïdes et de leurs précurseurs précancéreuses [ ,,,0],8] - [10]. p16INK4a et p15INK4b ont été parmi les premiers gènes pour montrer hypermethylation en glucocorticoïdes [11]. Notre groupe et d'autres par la suite découvert hyperméthylation du gène de réparation des mésappariements hMLH1 ADN dans GCS présentant une instabilité fréquente des microsatellites (MSI-H) [12] - [14]. Nous avons également montré que l'hyperméthylation de l'E-cadhérine (CDH1) gène se produit fréquemment dans glucocorticoïdes [15].

A la recherche du génome entier à base de microréseaux pilote menée par notre groupe, réalisée pour découvrir de nouveaux gènes épigénétique réduits au silence dans carcinogenèse gastrique, identifié claudine-11 ( CLDN11
), une protéine des jonctions serrées (TJ), comme une cible potentielle d'inactivation épigénétique dans les cancers gastriques (données non publiées).

Claudin-11 appartient à la famille des protéines CLAUDIN, qui contient plus de 23 membres. Les membres de la famille claudine sont exprimés d'une manière hautement spécifique de tissu dans une variété de tissus normaux et néoplasiques [16]. Claudins sont des protéines transmembranaires qui jouent un rôle crucial dans la formation et la fonction TJ. JT sont des jonctions intercellulaires critiques dans le transport paracellulaire de solutés, ainsi que dans le maintien de la polarité cellulaire. Les cellules tumorales présentent souvent des carences structurelles et fonctionnelles dans leur TJs [17]
.

Au cours des dernières années, un certain nombre d'études ont démontré une expression aberrante de claudine protéines dans divers types [18], [16] le cancer. Plusieurs de ces études ont trouvé dysrégulation d'expression de la protéine claudine via
promoteur hypermethylation. silencing induit par hyperméthylation-de claudine-7 expression a été précédemment rapporté dans le sein [19] et colorectal [20] carcinomes. Claudin-6 est également épigénétique réduit au silence dans le cancer du sein [21], tandis que claudines -3 et -4 sont épigénétique réglementées dans les cellules de cancer de l'ovaire [22], [23].

Le courant identifie et rapports étude, à notre connaissance pour la première fois, que le la région du promoteur de CLDN11 est hyperméthylés dans les tissus du GC et des lignées cellulaires. De plus, alors CLDN11 de l'ARNm a été exprimée dans tous les tissus de la muqueuse gastrique non cancéreuses primaires, ainsi que dans une lignée normale immortalisée de cellules épithéliales gastriques, il a été réduite au silence dans tous les tissus du GC et des lignées cellulaires examinées. downregulation intéressant, siRNA-médiée de CLDN11
à CLDN11

exprimant

Matériaux de cellules gastriques ont également été associés à des changements phénotypiques liés au cancer, en particulier augmentation de la motilité cellulaire et l'invasivité. et méthodes

Lignes cellulaires et tissulaires clinique Specimens

cellules humaines immortalisées normales gastriques épithéliales (HFE145) ont été obtenus par le Dr Duane T. Smoot (Université Howard) et GC lignées de cellules AGS, SIIA, MKN28, KATOIII et SNU-1 ont été obtenues auprès de l'ATCC. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées et maintenues dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de veau foetal et une solution antibiotique-antimycosique 1% (Invitrogen).

tissus normaux et tumoraux gastriques primaires appariées ont été recueillies à l'hôpital Johns Hopkins ( JHH). Spécimens étaient snap-congelés immédiatement après résection.

Ethique Déclaration

Université Johns Hopkins Conseil d'examen (JHU) Institutionnel (CISR) l'approbation a été obtenue pour tous les cas inclus dans l'étude. Les cas ont été obtenus à partir de JHU pathologie chirurgicale sous 02-07-19-05e d'exemption JHU IRB-approuvé en vertu de l'article 45 CFR 46,101 (b), qui renonce aux exigences pour l'obtention du consentement du patient.

Purification et préparation de l'ADN génomique L'ARN total et

L'ADN génomique a été extrait de congélation rapide des échantillons de tissus ou de lignées cellulaires en utilisant un DNeasy Blood & Kit de tissu (Qiagen, Valencia, CA) selon le protocole du fabricant. L'ARN total a été extrait avec du réactif Trizol (Invitrogen). Extrait l'ADN et l'ARN ont été quantifiés en utilisant un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre (NanoDrop, Wilmington, DE).

Quantitative méthylation spécifique PCR (QMSP) pour Claudin-11

ADN génomiques obtenu à partir de 36 les échantillons de patients, comprenant 18 GC et 18 noncancerous muqueuse de l'estomac (NS) des tissus appariés, ainsi que de diverses lignées de cellules gastriques, ont été soumis à QMSP. QMSP a été réalisée comme précédemment décrit, avec des modifications mineures [24]. En bref, le traitement bisulfite d'ADN génomique a été réalisée en utilisant un kit EpiTect bisulfite traitement (QIAGEN, Valencia, CA). Un amplicon MSP et la sonde TaqMan pour détecter l'ADN complètement méthylé ont été conçus pour inclure plusieurs sites CpG dans la région 5'-UTR du gène
CLDN11. CLDN11
amorces et spécifique de séquences de sondes utilisées étaient: amorce sens 5 'CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3'; amorce inverse 5 'GACGAAAACAACAACGCTACT 3'; TaqMan sonde 5'TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 '. CpGenome méthylé ADN Universal (Chemicon International, Temecula, CA) a servi de contrôle positif, et des dilutions en série de celui-ci ont été utilisés pour tracer une courbe standard. QMSP avec sonde TaqMan ont été effectuées sur un cycleur thermique iQ5 (BioRad, Hercules, CA) en utilisant iQ Supermix ( ibid.
). Cinquante cycles d'amplification par PCR à partir de 50 ng d'ADN génomique traité au bisulfite ont été réalisées en triple exemplaire, conformément au protocole du fabricant. Duplex PCR avec β-actine (ACTB) amorce et de sonde des séquences contenant aucun CpG ont été réalisées pour la normalisation. Les séquences d'amorce et de sonde utilisées ont été publiées antérieurement [24]. valeur de méthylation Normalisée (NMV) a été défini comme suit: NMV = ( CLDN11-S
/ CLDN11-FM
) /( ACTB-S
/ ACTB -FM
) * 100, où CLDN11-S
et CLDN11-FM
représentent les niveaux de méthylation de CLDN11 dans l'échantillon et entièrement ADNs méthylés, respectivement, tandis que ACTB-S
et ACTB-FM
correspondent à β-actine
dans l'échantillon et des ADN totalement méthylés, respectivement. Le total du génome ADN amplifié (WGA) a été utilisé comme témoin négatif non méthylé.

Analyse quantitative transcription inverse-PCR

Le CLDN11
amplicon RT-PCR a été conçu pour se chevauchent une frontière intron-exon afin d'exclure l'ADN génomique ( g
ADN) amplification. Les séquences d'amorce ont été publiés comme précédemment [18]. Une étape qRT-PCR a été effectuée comme décrit précédemment [24], en utilisant un kit Quantitect Sybra RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA) selon le protocole du fabricant. CLDN11 de l'expression était normalisée à β
actine expression. L'ARN total provenant de cellules HFE145 a été utilisée pour la courbe standard. ( CLDN11-S
/ CLDN11-C
) /( ACTB-S
/ ACTB-C
), où CLDN11- S
et CLDN11-C
représenter CLDN11 de niveaux d'expression de l'ARNm dans l'échantillon et de contrôle, respectivement essai ARNm, tandis que ACTB-S
et ACTB
-C correspondent à
niveaux d'expression de ß-actine dans l'échantillon et de contrôle Test ARNm, respectivement

5-aza-2'-désoxycytidine (5-aza-dC) Traitement.

AGS est une lignée de cellules de GC manifestant hyperméthylation du CLDN11
promoteur en liaison avec l'expression d'ARNm absent
CLDN11. 5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC) le traitement des cellules a été effectuée comme décrit précédemment [24]. En bref, la lignée cellulaire de GC AGS (ATCC numéro de catalogue CRL-1739) a été ensemencé à une densité de 2 x 10 ^{5 cellules /ml dans un flacon T-75. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été traitées avec 1 uM de 5-aza-dC pendant 72 heures. Les supports contenant 5-aza-dC a été remplacé par du milieu fraîchement préparé toutes les 24 heures. Les cellules ont ensuite été récoltées pour l'extraction d'ARN total. Les ARN totaux de cellules AGS avant et après traitement 5-aza-dC ont été soumis à analyse en temps réel RT-PCR quantitative.}

Expériences petits ARN interférents Knockdown

CLDN11
oligos ARNsi spécifique de ont été achetés auprès d'Ambion Inc. (Austin, TX). La lignée cellulaire HFE145, qui est CLDN11
positif, a été choisi pour étudier l'effet de la claudine-11 knockdown sur la migration et l'invasion propriétés des cellules gastriques. Des expériences ont été réalisées comme décrit précédemment (Agarwal et al.
, 2005). Les cellules cultivées dans des plaques à 6 puits ont été transfectées avec des duplex de cARNi utilisant de la lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Mock-transfections et duplex de siRNA non spécifiques ont été utilisés comme témoins négatifs. Les cellules ont été traitées pendant 48 à 72 heures pour permettre knockdown maximale, après quoi ils ont été soit récoltées pour l'analyse Western blot ou utilisés pour la migration et l'invasion des essais.

Western Blot Analyse des Claudin-11 dans des lignées cellulaires gastriques

cultures de cellules confluentes ont été lavées avec du HBSS (Invitrogen) et des lysats de cellules entières ont été effectuées en utilisant du tampon de lyse: 62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 10% de glycerol et 2% de SDS. La concentration en protéine a été déterminée en utilisant un acide bicinchoninique (BCA) trousse de dosage (Pierce, Rockford, IL). Vingt microgrammes de protéines totales ont été séparés par 10% à 20% de SDS-PAGE sur des gels de Tris-Glycine (Invitrogen) et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (Millipore Corp., Bedford, MA). Les membranes ont été bloquées avec 5% de lait écrémé en poudre, on le lave dans du tampon TBST, et sondées avec un 11 anti-claudine anticorps (Zymed, San Francisco, CA). Les blots ont ensuite été lavées et mises en incubation à la peroxydase de raifort conjuguée à un anticorps secondaire (IgG anti-lapin: 1:10,000; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Pour la détection, la chimioluminescence a été réalisée à l'aide d'un kit de chimioluminescence amplifiée (Amersham Pharmacia Biotech).

Cellule Invasion et migration Assay

invasivité des cellules siRNA transfectées a été déterminée en utilisant des inserts de chambre d'invasion Matrigel enduites (24 puits format avec des pores de 8 pm, BD Biosciences) en utilisant une chambre test Boyden modifiée [25]. Les cellules ont été cultivées jusqu'à environ 80% de confluence et privées de sérum pendant une nuit. Le jour de l'essai, les cellules ont été trypsinisées et le nombre de cellules viables prises. Environ 50.000 cellules ont été déposées sur le dessus de chacun de chaque filtre dans un milieu exempt de sérum. Un volume égal du même milieu contenant 20% de FCS a été placé dans la chambre basse ( i.e.
, Bien en dessous du filtre) pour agir en tant que chimiotactique. Les plaques d'essai ont été incubées à 37 ° C pendant jusqu'à 48 heures. Les cellules non migrées ou envahissent à travers les pores des inserts Transwell ont été enlevés manuellement à l'aide d'un coton-tige. Les cellules présentes à la partie inférieure de la membrane ont été fixées dans du methanol froid pendant 10 minutes et ensuite colorées avec du cristal violet à 0,01% dans 20% d'éthanol. Après 10 minutes d'incubation, les filtres ont été lavés soigneusement à l'eau et mis en suspension dans 200 ul d'acide acétique à 5% et 5% de methanol. lectures colorimétriques ont été prises à OD _{595. Les expériences ont été répétées au moins trois fois, dans chaque expérience en triple. Pour évaluer la migration des cellules, des essais ont été effectués essentiellement comme ci-dessus, sauf que les cellules ont été étalées sur le dessus de (Matrigel sans) inserts non couchés.}

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Student t -test (SPSS version 16), avec p
<. 0,05 considéré comme statistiquement significatif

Résultats et discussion

Nous avons testé d'abord notre hypothèse que le CLDN11
promoteur est hyperméthylés et que cette hypermethylation corrélation inverse avec expression de l'ARNm
CLDN11 dans les tissus GC primaires. tissus normaux et tumoraux gastriques primaires appariées ont été recueillies à l'hôpital Johns Hopkins (JHH). Les échantillons ont été obtenus immédiatement après résection et congélation rapide jusqu'à utilisation. Seuls les cas obtenus avec le consentement éclairé approuvé par le comité d'examen institutionnel (IRB) ont été inclus dans ce projet. ADN génomiques ont été obtenus à partir de 36 échantillons cliniques, comprenant 18 GC et 18 muqueuse gastrique (NS) tissus noncancerous appariés. niveaux de méthylation de promoteur de CLDN11 dans ces échantillons ont été analysés à l'aide quantitative en temps réel par PCR spécifique de la méthylation (QMSP). Figure 1A affiche la valeur de méthylation normalisée (NMV), i.e.
, Le ratio de la valeur méthylé du CLDN11
région de promoteur dans chaque échantillon à un ADN de contrôle entièrement méthylé. CLDN11
NM Vs
étaient significativement plus élevés dans les échantillons de GC que dans leurs tissus NS correspondant ( P
< 0,001). Pour évaluer si promoteur de hypermethylation de CLDN11 dans GCS a été associée à silençage de CLDN11 de l'expression, Les taux d'ARNm de CLDN11 ont été mesurés à l'aide quantitative en temps réel (qRT-PCR) dans les ARN extraits des 36 échantillons utilisés pour l'analyse de la méthylation. Comme le montre la figure 1B, les valeurs d'expression normalisées (NEV) de CLDN11
dans des échantillons de GC étaient significativement plus faibles que dans les échantillons NS appariés ( P
< 0,001). Ces données établit que promoteur de hypermethylation de CLDN11 corrèle avec l'expression de l'ARNm
CLDN11 diminuée ou réduite au silence dans le primaire GCS.

Ensuite, nous avons évalué méthylation du promoteur
CLDN11 et l'expression dans des lignées de cellules gastriques. cellules immortalisées humaines normales gastriques épithéliales (HFE145) et des lignées de cellules de GC AGS, SIIA, MKN28, KATOIII et SNU-1 ont été étudiés. Toutes les lignées cellulaires testées (GC AGS ASAI, MKN28, KATOIII et SNU-1) ont démontré hyperméthylation de promoteur, alors qu'aucune n'a été observée dans la méthylation HFE145 cellules normales immortalisées (figure 2A). Les taux d'ARNm de CLDN11 ont été évalués en utilisant la qRT-PCR sur les ARN purifiés à partir de lignées cellulaires, tandis que la claudine-11 expression de la protéine a été analysée par Western Blot. Comme on le voit sur la figure 2B, les 5 lignées cancéreuses présentaient pas d'expression détectable de CLDN11
ARNm ou de protéines, tandis que les cellules manifestent HFE145 niveaux d'expression élevés
CLDN11. Cette constatation établit que CLDN11
est coordonnée des lignées cellulaires hyperméthylés et downregulated en GC par rapport aux cellules épithéliales gastriques normales (NGECs).

Afin de valider le silençage de CLDN11
expression par hyperméthylation, on a traité la lignée de cellules AGS GC avec l'agent de déméthylation 5-aza-2-désoxycytidine (5-aza-dC, 1 uM) pour faire varier les intervalles de temps. Les ARN totaux extraits avant vs.
Après le traitement ont été soumis à qRT-PCR pour CLDN11
. Comme on peut le voir sur la figure 3, à chaque point de temps, CLDN11 de l'ARNm est devenu de nouveau exprimé lors du traitement avec 5-aza-dC, confirmant que CLDN11
est réduit au silence par promoteur hyperméthylation dans AGS . cellules GC

les membres de la famille des protéines de claudine ont été impliqués dans la régulation de l'adhésion cellulaire, l'invasion et la migration des cellules cancéreuses [25] - [27]. Par conséquent, nous avons ensuite cherché à savoir si la motilité influences cellulaire ou l'invasivité de CLDN11. HFE145 cellules, qui expriment en abondance CLDN11
, ont été choisis pour étudier les effets de CLDN11 de la knockdown sur les propriétés invasives et migratoires des cellules épithéliales gastriques. transfections siRNA transitoires ont été effectuées en utilisant CLDN11-
duplex de siRNA spécifiques. Transfection avec CLDN11
duplex siRNA spécifique de claudine-11 niveaux de protéines par >efficacement réprimés; 90%, alors que l'expression est restée inchangée en mock- ou contrôler les cellules siARN traitées (figure 4A). La motilité cellulaire et l'invasion des essais ont été effectués sur des cellules transfectées par siRNA en utilisant un système de dosage de Boyden modifiée chambre [25]. Il est intéressant, comme illustré sur les figures 4B et 4C, l'inhibition de CLDN11 de l'expression dans des cellules HFE145 augmenté de manière significative le potentiel de migration et invasifs de ces cellules, respectivement.

La présente étude confirme donc l'hypothèse selon laquelle CLDN11
, une protéine de jonction serrée, est réduit au silence en GC par hyperméthylation de promoteur, et ces données soutiennent la participation de CLDN11
dans le contrôle de l'invasion des cellules GC et la migration.

hyperméthylation de promoteur est connue pour être associée à la répression transcriptionnelle de certains gènes. Méthylation de l'ADN peut interférer avec la liaison de facteurs de transcription dont les sites de liaison contient des dinucléotides CpG. Utilisation du logiciel TFSEARCH, nous avons scanné la séquence CLDN11
trouvé à hyperméthylé dans les tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires, ie
., L'amplicon QMSP (-104 à +4 bases par rapport à le site de début de transcription pour CLDN11
). Cette analyse a identifié des sites de liaison putatifs pour Sp1 et GATA-1 et GATA-2. Des études antérieures ont montré que l'hyperméthylation de l'ADN du promoteur contribue à silençage de CLDN3
et CLDN4
dans des lignées cellulaires de l'ovaire, en partie via
perturbation induite par la méthylation de la liaison de Sp1 à son site de liaison complémentaire (22, 23). En outre, les membres de la famille GATA ont été montré pour être des régulateurs positifs de CLDN11 de la transcription [28]. D'autres études sont maintenant garantis pour évaluer si hypermethylation de ces sites interfère avec la liaison des facteurs de transcription, et comment une telle perturbation peut influencer le gène de la transcription de CLDN11.

Les cellules tumorales présentent généralement des lacunes structurelles et fonctionnelles dans leur TJs [17]. Ces lacunes sont associés à une perte de la polarité et de la différenciation. Un autre lien important entre TJ et le cancer est une perte d'intégrité TJ, qui provoquerait une fuite ou le transport de substances pro-tumorigènes (tels que des facteurs de croissance ou de nutriments) dans le développement des primordia des cellules tumorales, la promotion de la croissance des tumeurs [29]. En outre, la perte de la polarité, la différenciation et les propriétés adhésives associés à une fonction altérée dans le cancer TJ peut être critique dans l'acquisition d'un phénotype métastatique [30]. Des études ont suggéré que les anomalies dans les protéines TJ-associés peuvent représenter la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), changeant ainsi l'invasivité et la motilité des cellules cancéreuses.

Modulations dans l'expression de protéines TJ-associés, particulièrement des protéines Claudin, ont été démontré dans un certain nombre de cancers. Des études récentes de nous et d'autres ont montré des altérations de la régulation de la protéine claudine dans divers cancers épithéliaux [18]. Les membres de la famille des gènes de la claudine sont exprimés d'une manière hautement spécifique de tissu, ainsi qu'une très spécifique stade de développement,. En outre, selon le type de cancer, l'expression des protéines CLAUDIN peut être régulée à la hausse ou régulés à la baisse dans les cellules cancéreuses. Par exemple, plusieurs protéines Claudin sont surexprimés dans les cancers du côlon, des ovaires, du pancréas et de la prostate, alors que certains sont downregulated dans le cancer du sein et les cancers de la tête et du cou [16], [18]

Des études ont déjà signalé des changements dans l'expression les profils des membres de la famille claudine à associer CG. analyse sérielle d'expression génique (SAGE) a identifié le CLDN18
gène comme dans GCS possédant régulée à la baisse un phénotype intestinal [31]. Le gène CLDN23 de downregulated est également dans de type intestinal GCS [32]. A l'inverse, Cunningham et al.
Rapporté CLDN4 de l'expression à être augmentée dans la métaplasie intestinale et la dysplasie épithéliale gastrique, identifier ce gène comme marqueur des lésions précurseurs de GC [33]. Dans l'étude actuelle, nous avons trouvé CLDN11 de l'expression à downregulated ou réduits au silence GC via
hypermethylation de sa région de promoteur. De plus, nous avons constaté que, contrairement à CLDN18
et CLDN23
, CLDN11 de l'expression a été downregulated dans des échantillons GC patient, ainsi que dans des lignées cellulaires, quel que soit diffuse vs .
sous-type intestinal.

claudine-11, également connu sous protéine spécifique oligodendrocytes, a d'abord été identifié pour être exprimé spécifiquement dans les brins des jonctions serrées des oligodendrocytes dans le cerveau et dans les cellules de Sertoli de rats et de souris [ ,,,0],34], [35]. Perte d'expression claudine-11, ce qui conduit à la rupture de la barrière TJ, est associée à des déficits neurologiques et de reproduction [36]. Une étude récente a rapporté surexpression et de mauvaise localisation CLDN11
de la barrière hémato-testiculaire dans les cellules de Sertoli d'être associé à la néoplasie intraépithéliale testiculaires chez les hommes [37]. Les données de l'étude actuelle établit que CLDN11
est exprimée dans les tissus gastriques normaux et immortalisés NGECs. Cependant, ses fonctions complètes dans l'estomac normal ainsi que dans la carcinogenèse gastrique restent floues.

Dans une tentative d'explorer l'implication possible de CLDN11
en GC, nous avons étudié les changements phénotypiques associés à silençage CLDN11 de l'expression dans CLDN11-
exprimant les cellules épithéliales gastriques (HFE145). knockdown Très intéressant, siRNA-médiée de CLDN11
entraîné une augmentation de la motilité et l'invasion cellulaire.

Des études antérieures ont rapporté des changements phénotypiques spécifiques du cancer pour être associés à des modulations de l'expression claudine dans différents types de cancer . La surexpression de claudine-3 et claudine-4 protéines dans des lignées cellulaires de cancer ovarien entraîne une augmentation de l'invasion par ces cellules [25]. Dans le cancer du côlon, l'augmentation de l'expression de claudine-1 a été rapporté, et les changements dans la claudine-1 expression exercent des effets significatifs sur la croissance des tumeurs et des métastases xénogreffes chez la souris nude athymiques [27]. D'autre part, claudine-7 régulation négative dans le cancer du sein a été associée à discohesion cellulaire accrue et la capacité des cellules du cancer du sein pour diffuser [19]. En outre, des expériences dans des lignées cellulaires du pancréas ont montré que l'expression de la claudine-4 conduit à invasivité réduite, tumorigène, et le potentiel métastatique de ces cellules [38]. Les raisons de ces écarts en vigueur sont actuellement pas claires, mais elles peuvent être liées à des différences spécifiques de tissus en fonction claudine ou même à des variations de réponse des différentes lignées cellulaires. De toute évidence, les membres de la famille claudine sont connus pour être exprimés d'une manière spécifique d'un tissu et peuvent exercer des effets divergents.

Bien que ces dernières années, il est devenu clair que TJs et les protéines TJ-associés ont une vaste et diversifiée fonctionnelle et les activités physiologiques dans des conditions normales et cancéreuses, les mécanismes moléculaires sous-jacents de ces activités restent floues. JT sont des appareils perfectionnés intercellulaires capables de recruter les protéines de signalisation, régulant ainsi divers processus cellulaires, y compris la croissance cellulaire, la différenciation et la tumorigenèse [39], [40]. protéines Claudin associent directement avec discrètes voies de transduction du signal en interagissant avec les molécules de signalisation, tels que la protéine kinase C atypique et les protéines Rho, ainsi qu'avec d'autres protéines contenant de domaine-PDZ. Dans le cancer de l'ovaire, claudines modifier l'invasion tumorale en régulant l'activité des MMP [25]
.

En résumé, les données de l'étude identifient CLDN11
comme une cible de modification épigénétique, ainsi qu'un prometteur biomarqueur pour le cancer gastrique détection précoce, le diagnostic et la thérapie. Ces résultats suggèrent également la participation de CLDN11 de la régulation à la baisse dans la carcinogenèse via
promotion de l'invasion cellulaire et la motilité. Les mécanismes de ce phénomène sont soumis à une enquête plus approfondie.

Remerciements

Nous remercions le Dr Duane T Smoot pour son généreux don de HFE145 cellules.

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