Résumé
Photoimmunotherapy (PIT) est un nouveau traitement du cancer qui combine la spécificité des anticorps pour cibler les tumeurs avec la toxicité induite par photosensibilisants après exposition à proche infrarouge (NIR) de lumière. Nous avons effectué PIT dans un modèle de cancer gastrique disséminée carcinose péritonéale et surveillé l'efficacité avec in vivo Citation:. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy de cancer gastrique carcinose péritonéale dans un modèle de souris. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10.1371 /journal.pone.0113276 Editeur: Irina V. Lebedeva, Université de Columbia, États-Unis d'Amérique reçues: 2 Juillet 2014; Accepté le 21 Octobre 2014; Publié le 17 Novembre, 2014 Ceci est un article en accès libre, libre de tout droit d'auteur, et peut être librement reproduit, distribué, transmis, modifié, construit sur, ou autrement utilisé par quiconque à des fins licites. Le travail est mis à disposition dans le domaine public Creative Commons CC0 dévouement Disponibilité des données:. Les auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et Financement:. Ce travail a été soutenu par le programme NIH intra-muros et JSPS bourse de recherche. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent Introduction carcinome gastrique provoque plus de 740.000 décès liés au cancer par an dans le monde entier notamment en Asie [1] - [3]. La majorité des patients atteints de cancer gastrique présent avec localement avancé, récurrent ou métastatique excluant la chirurgie curative qui est surtout gérée par une thérapie non curative [1]. carcinose péritonéale et des métastases du foie sont des manifestations mortelles courantes de cancer de l'estomac au stade avancé [1], [4]. carcinose péritonéale se produit également dans l'ovaire, appendiculaire, du côlon, du pancréas et les cancers gastriques. Le pronostic est universellement pauvres et les traitements locaux sont toujours sans succès avec des taux élevés de récidive et la morbidité associées à une ascite et une occlusion intestinale. La thérapie systémique est aussi généralement échoué. Ainsi, de nouvelles méthodes de traitement de la carcinose péritonéale sont nécessaires. Photoimmunotherapy (PIT) est un traitement spécifique du cancer nouvelle cellule cible qui emploie un conjugué anticorps photosensibilisant (APSC), suivie par le proche infrarouge (NIR) exposition à la lumière. Un APSC consiste en un anticorps spécifique du cancer des cellules monoclonaux (mAb) et un photosensibilisant, IR700, qui est un dérivé de silice-phtalocyanine conjugué de manière covalente à l'anticorps. L'APSC se lie à des molécules cibles sur la membrane cellulaire et induit une nécrose cellulaire quasi immédiate après une exposition à une lumière proche infrarouge à 690 nm. in vitro Alors que PIT se traduit par une nécrose cellulaire rapide, le volume global de la tumeur ne peut pas changer pendant plusieurs jours. En effet, il faut au moins plusieurs jours pour les macrophages pour entrer, traiter et laisser la tumeur traitée. Par conséquent, de nouvelles méthodes, au-delà des mesures de taille, sont nécessaires pour surveiller les effets du PIT. Fluorescence protéines (ips) sont couramment utilisés pour la visualisation de processus cellulaires [10], [11]. Alors que la plupart des résultats de la mort cellulaire apoptotique dans la préservation de la membrane cellulaire et la rétention de la FP faisant fluorescence insensible à la mort cellulaire [12], [13], dans le PIT, la rupture soudaine des membranes cellulaires des résultats dans l'extrusion de cytoplasmique ips et par conséquent, une lecture relativement rapide de la mort cellulaire. Un avantage de ips pour in vivo Dans cette étude, nous avons examiné l'efficacité du PIT dans un modèle murin de cancer gastrique péritonéale disséminée utilisant in vivo GFP imagerie de fluorescence à surveiller la réponse. Matériel et méthodes Réactifs soluble dans l'eau, dérivé de silicium-phtalocyanine, IRDye 700DX NHS ester et IRDye 800 CW NHS ester ont été obtenus à partir de LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, un IgG entièrement humanisé 2 mAb dirigé contre EGFR, a été acheté chez Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Trastuzumab, 95% humanisé IgG 1 mAb dirigé contre HER2, a été acheté auprès de Genentech (South San Francisco, CA, USA). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité réactif. Conjugaison des colorants avec des mAb a été réalisée selon un précédent rapport [19]. En bref, panitumumab ou trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) a été incubé avec de l'ester IR700 NHS (60,2 ug, 30,8 nmol) ou IRDye 800 CW NHS ester (35,9 ug, 30,8 nmol) dans 0,1 mol /L Na 2HPO 4 (pH 8,6) à température ambiante pendant 1 h. On a purifié le mélange avec une colonne Sephadex G50 (PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). La concentration en protéine a été déterminée avec un kit d'essai de protéines Coomassie Plus (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA) en mesurant l'absorption à 595 nm par spectroscopie (8453 Valeur système; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). La concentration du ou IR700 IR800 a été mesurée respectivement par absorption à 689 nm ou 774 nm avec une spectroscopie pour confirmer le nombre de molécules de fluorophore conjugué à l'anticorps monoclonal. La synthèse est contrôlée de telle sorte qu'une moyenne de quatre molécules d'IR700 et deux molécules de IR800 étaient liés à un seul anticorps. Nous avons effectué SDS-PAGE comme un contrôle de qualité pour chaque conjugué comme indiqué précédemment [19]. Nous abrégeons IR700 conjugué à trastuzumab comme tra-IR700, au panitumumab comme pan-IR700 et IR800 conjugués à trastuzumab comme tra-IR800. Les cellules N87-GFP de culture cellulaire exprimant de manière stable la GFP ont été achetés de CANCER ANTI (San Diego, CA, USA). une expression élevée de la GFP a été confirmée en l'absence d'un agent de sélection avec 10 passages. Pour évaluer la destruction des cellules spécifiques par PIT, les cellules 3T3 exprimant de manière stable DsRed (3T3 /DsRed) ont été utilisés comme témoin négatif [5]. Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) additionné de 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline /streptomycine (Life Technologies) dans des flacons de culture de tissus dans un incubateur humidifié à 37 ° C à une atmosphère de 95 % d'air et 5% de dioxyde de carbone microscopie à fluorescence Pour détecter la localisation spécifique d'un antigène de conjugués IR700 et le changement dans la morphologie cellulaire après IRP, la microscopie par fluorescence a été effectuée (IX61 ou IX81. Olympus America, Melville, NY, USA). Dix mille cellules ont été ensemencées sur des boîtes de couverture à fond de verre et incubées pendant 24 heures. Tra-IR700 a ensuite été ajouté au milieu de culture (sans rouge de phénol) à 10 pg /ml et on fait incuber à 37 ° C pendant 6 heures. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS; Iodure de propidium (PI) (1:2000) ou Bleu Cytox (1:500) (Life Technologies) a été ajouté au milieu 30 min avant PIT pour détecter les cellules mortes. Les cellules ont ensuite été exposées à une lumière proche infrarouge et des images ont été obtenues en série. Un jour après PIT, les cellules ont été lavées et incubées avec le nouveau milieu après PIT (0,5 J /cm 2) et PI a de nouveau ajouté. Pour veiller à ce que la même région a été imagé marques ont été faites sur chaque boîte de culture pour indiquer où l'imagerie a été acquise. Le filtre est configuré pour détecter la fluorescence IR700 avec un filtre d'excitation 590-650 nm, et une bande 665-740 nm filtre passe d'émission. L'analyse des images a été réalisée avec le logiciel ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). La Fluorescence de cytométrie de flux de cellules après incubation avec pan-IR700 ou tra-IR700 a été mesurée en utilisant un cytomètre de flux (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) et le logiciel CellQuest (BD Biosciences). Les cellules (1 x 10 5) ont été incubés avec chaque conjugué pendant 6 heures à 37 ° C. Pour valider la liaison de l'anticorps conjugué spécifique, l'excès d'anticorps (50 ug) a été utilisé pour bloquer 0,5 pg de conjugués colorant-anticorps [8]. Cent mille cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et mis à incuber pendant 24 heures. Les milieux de culture a été remplacé par un milieu de culture frais contenant 10 pg /ml de tra-IR700 et les cellules ont été incubées pendant 6 heures à 37 ° C. Après un lavage avec du PBS, un milieu de culture exempt de rouge de phénol ont été ajoutés. Ensuite, les cellules ont été irradiées avec NIR lumière laser à longueur d'onde 685-695 nm (BWF5-690-8-600-0.37; B &. W TEK INC, Newark, DE, USA). La densité de puissance réelle de mW /cm 2 a été mesurée avec un compteur de puissance optique (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA). Les effets cytotoxiques de PIT avec tra-IR700 a été déterminée par cytométrie de flux PI coloration, qui détecte les membranes cellulaires compromises. Pour le dosage de cytométrie de flux, les cellules ont été trypsinisées 1 h après le traitement et on les lave avec du PBS. PI a été ajouté à la suspension cellulaire (finale 2 pg /ml) et incubée à température ambiante pendant 30 minutes, suivi par cytométrie en flux. Cent mille les cellules ont été ensemencées sur des boîtes de couverture à fond de verre et incubées pendant 12 heures. Tra-IR700 a ensuite été ajouté au milieu de culture (sans rouge de phénol) à 10 pg /ml et on fait incuber à 37 ° C pendant 6 heures. Les cellules ont été lavées avec du PBS et remplacé par un nouveau, le rouge de phénol libre du milieu de culture et la face inférieure de la vitre de recouvrement est marquée (pour déterminer la position d'observation). PIT après, les cellules ont été incubées à nouveau pendant 1 jour. Un jour après IRP, les cellules ont de nouveau été observées. L'intensité de la GFP a été évaluée avec un total de pixels avec le même seuil dans le même domaine [20]. L'analyse des images a été réalisée avec le logiciel ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Fluorescence de cellules traitées a également été mesurée en utilisant un cytomètre de flux (FACS Calibur). animaux et tumoraux modèles Tous in vivo In vivo Souris avec le cancer péritonéale soit disséminée (à 6 semaines après l'implantation de cellules) ou des tumeurs de flanc (à 7 jours après l'implantation de cellules) ont été injectés par voie intraveineuse avec 100 ug de tra-IR700 et tra-IR800. Un jour après l'injection, les images ont été réalisées en série avec une perle Imager pour détecter IR700 /fluorescence IR800, et Maestro pour la GFP. images lumière blanche des souris ont été obtenus avec un iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA). In vivo PIT Afin d'évaluer l'effet de PIT dans le modèle de flanc , les souris porteuses de tumeurs N87-GFP ont été randomisés en 4 groupes d'au moins 10 animaux par groupe comme suit: (1) aucun traitement (contrôle); (2) que l'exposition de la lumière NIR à 50 J /cm 2 le jour 1 et 100 J /cm 2 le jour 2; (3) 100 ug de tra-IR700 i.v., aucune exposition à la lumière NIR; (4) 100 ug de tra-IR700 i.v., la lumière NIR a été administré à 50 J /cm 2 le jour 1 après l'injection et 100 J /cm 2 le jour 2 après l'injection. Ces conditions ont été appliquées chaque semaine pendant 3 semaines. Les souris ont été surveillées quotidiennement, et des images de fluorescence ont été obtenues en commençant 1 jour avant l'IRP et les volumes des tumeurs ont été mesurées trois fois par semaine jusqu'à ce que le diamètre de la tumeur a atteint 2 cm, après quoi les souris ont été euthanasiées avec du dioxyde de carbone. Pour l'imagerie de fluorescence, les souris ont été injectées avec 100 ug de tra-IR700 ou irradiés comme suit: (1) la lumière NIR a été administré à 50 J /cm 2 le jour 1 après l'injection et 100 J /cm 2 sur jour 2 vers la droite tumeur (2) pas de lumière NIR a été administrée à la tumeur gauche qui a servi de contrôle. Contrôles inclus (1) seule exposition à la lumière NIR à 50 J /cm 2 le jour 1 et 100 J /cm 2 le jour 2 vers la droite tumeur; (2) pas de traitement pour la tumeur gauche Pour évaluer le cancer péritonéale disséminée, les souris ont été randomisés en 4 groupes de 5 animaux par groupe pour les traitements suivants:. (1) aucun traitement (contrôle); (2) que l'exposition de la lumière NIR à 50 J /cm 2 le jour 1 et 100 J /cm 2 le jour 2; (3) 100 ug de tra-IR700 i.v., aucune exposition à la lumière NIR; (4) 100 ug de tra-IR700 iv, la lumière NIR a été administré à 50 J /cm 2 le jour 1 et 100 J /cm 2 au jour 2 après l'injection. Les données sont exprimées en moyenne ± sem à partir d'un minimum de quatre expériences, sauf indication contraire. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un programme de statistiques (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Pour des comparaisons multiples, une analyse unidirectionnelle de variance (Anova) post test (test de Kruskal-Wallis avec post-test) et le test de Tukey a été utilisé. La probabilité cumulée de la survie, déterminé ici que le diamètre de la tumeur ne pas atteindre 2 cm, a été estimé dans chaque groupe avec l'utilisation de la méthode de Kaplan-Meier analyse de la courbe de survie, et les résultats ont été comparés avec le test du log-rank et test de Wilcoxon. Étudiant de t Résultats Confirmation du profil d'expression des cellules N87-GFP comme cible pour PIT Nous avons examiné les signaux de fluorescence. de pan-IR700 et tra-IR700 lié aux cellules N87-GFP par FACS. Après 6 heures d'incubation avec soit pan-IR700 ou tra-IR700, les cellules N87-GFP constamment montré une luminosité plus élevée avec tra-IR700 que pan-IR700 (Fig. 1A). Ces signaux étaient presque entièrement bloqués par l'addition d'un excès trastuzumab ou panitumumab, ce qui suggère la liaison spécifique et la confirmation de l'expression ultérieure de la protéine HER2 que l'EGFR [21]. Ces données suggèrent que HER2 a été la cible préférable PIT dans les cellules N87-GFP en raison de sa plus haute expression. microscopie à fluorescence série de cellules N87-GFP a été effectuée avant et après PIT. Après exposition à la lumière NIR (2 J /cm 2) gonflement cellulaire, la formation de vésicules et la rupture du lysosome ont été observées, ce qui entraîne l'extrusion du cytoplasme au niveau extracellulaire (Fig. 1B). PI coloration a montré des dommages de la membrane cytotoxique aiguë causée par PIT. La plupart de ces changements cellulaires ont été observés dans les 30 minutes d'exposition à la lumière (Informations complémentaires vidéo S1 et S2). Aucun changement significatif n'a été détecté dans l'EGFR-négative des cellules 3T3 irradiés avec de la lumière NIR, suggérant PIT induit aucun dommage dans les cellules non-cibles (Fig. S1). afin de quantifier l'effet de in vitro Un jour après l'exposition à la lumière NIR de 0,5 J /cm 2, environ 50% des cellules ont montré une cytotoxicité aiguë (Fig. 1C), et l'intensité de fluorescence de la GFP a été considérablement réduite dans les cellules mortes (colorées positives avec PI), tandis que la fluorescence de la GFP a été conservée dans les cellules survivantes (Fig. 1D). Ces études suggèrent que la GFP a été extrudé à partir de la cellule après la rupture des membranes. Afin d'étudier le changement de fluorescence de la GFP, nous avons comparé le total des pixels de la GFP dans le même domaine avant et un jour après PIT (Fig. S2). Le rapport de la fluorescence de la GFP a diminué directement avec la dose de lumière, alors qu'aucune diminution a été détectée avec exposition à la lumière NIR ou tra-IR700 seul (Fig. 1E). Ces résultats ont été confirmés par l'analyse FACS (Fig. 1F et sur la Fig. S3) et suggèrent que le PIT conduit à une diminution de la fluorescence de la GFP suite à la mort cellulaire nécrotique à 1 jour après IRP d'une manière dépendante de la dose de lumière. ensuite, nous avons examiné l'effet de PIT in vivo sur le flanc Afin de surveiller in vivo Quantification du total GFP intensité de fluorescence a révélé qu'il y avait une diminution significative après PIT (n = 5 souris dans chaque groupe, * p = 0,0118 < 0,05, ** p = 0,0010 < 0,01, *** p = 0,0049 < 0,01, test de Tukey ANOVA) (Fig. 3C). En raison de la tumeur recroissance, le rapport de la GFP a encore augmenté au jour 4 après IRP, bien qu'il soit inférieur à celui d'autres groupes témoins. L'imagerie en temps réel de fluorescence de la GFP et sa quantification a permis la comparaison en temps réel des groupes et ont montré une forte corrélation entre une fluorescence de la GFP et la progression de la tumeur dans chaque groupe Pour confirmer cet effet, ex vivo Lorsque PIT a été répété chaque semaine, l'activité de fluorescence de la GFP a finalement disparu (Fig. 4C et D), indiquant complète mise à mort de la tumeur. Caractérisation du modèle péritonéale disséminée avec l'imagerie de fluorescence afin de déterminer l'histoire naturelle du modèle péritonéale disséminée, l'imagerie de fluorescence série a été réalisée. Les tumeurs implantées ont montré le signal de fluorescence élevé avec IR700, IR800, et la GFP, qui a co-localisée avec l'autre (IR800 a été utilisé pour éviter une auto-fluorescence intestinale) (fig. 5). Ces données suggèrent que ce modèle de cancer du péritoine disséminée peut être contrôlée dans des souris vivantes en utilisant la fluorescence de la GFP. en temps réel la fluorescence de la GFP imagerie était réalisée dans le modèle péritonéale disséminée avant et après PIT (Fig. 6A). IR700 fluorescence a diminué après PIT (Fig. S4). GFP TFI a progressivement augmenté dans les groupes non-PIT en raison de la croissance tumorale. Dans le groupe traité PIT, GFP TFI a diminué de 1 jour à 3 jours après PIT (Fig. 6B). Quantification du total intensité de fluorescence de la GFP a révélé une diminution significative après PIT (n = 5 souris dans chaque groupe, * p = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, test avec post-test de Kruskal-Wallis) (Fig. 6C). En raison de la tumeur re-croissance, le taux de GFP augmente à nouveau à partir de 4 jours après IRP, même si elle a maintenu inférieur à celui des autres groupes, comme on l'observe avec le modèle de flanc de la tumeur. Ainsi, PIT a causé une tumeur importante ciblée tuant effet dans les deux flancs et modèles de tumeur péritonéale disséminée, ce qui pourrait être suivie avec la GFP IFT. Cette étude démontre que l'effet de PIT peut être surveillé par imagerie par fluorescence de la GFP. Contrairement à l'apoptose [12], [13], dans lequel la GFP et les protéines fluorescentes apparentées deviennent plus lumineux en raison du volume cytoplasmique diminuant, au cours de la mort cellulaire nécrotique avec PIT, les dommages de la membrane conduit à la libération des contenus cytoplasmiques dont GFP. Cette caractéristique unique de la GFP et les protéines fluorescentes connexes fait des biomarqueurs utiles pour PIT. In vivo Le concept d'utilisation de la thérapie ciblée la lumière est plus de trois décennies ancienne [22]. En raison de l'hydrophobie de sensibilisateurs traditionnels thérapie photodynamique (PDT), la pharmacocinétique de l'anticorps conjugué agents PDT est fortement limitée dans sa capacité à fournir des conjugués à la cible. Par conséquent, les sensibilisateurs PDT ciblées avec des anticorps n'a été couronnée de succès dans des modèles où le conjugué a été injecté directement dans la tumeur ou le péritoine [23]. Afin de fournir un conjugué anticorps-photosensibilisant (APSC) systémique, le photosensibilisant doit être préférentiellement hydrophile. Photosensibilisant à base de phtalocyanine hydrophile IR700DX lorsqu'ils sont conjugués à un anticorps est un véhicule blindé qui peut être administrée par voie intraveineuse. Cette forme de thérapie, appelé PIT, diffère de PDT traditionnelle non seulement dans l'hydrophilie du photosensibilisant, mais aussi dans sa dépendance à la lumière NIR pour activer le photosensibilisant. la lumière NIR a une meilleure pénétration dans les tissus que la lumière de longueur d'onde inférieure utilisée dans la PDT. Cette nouvelle génération de TTB montre la pharmacocinétique intraveineuse semblables à des anticorps nus, ce qui entraîne l'accumulation de tumeur très ciblée avec une liaison non cible minimale et peut être appliquée à un large spectre d'anticorps, ce qui permet de nombreuses applications potentielles dans tout le corps. Malgré la chimiothérapie cytotoxique, le résultat pour le cancer de l'estomac au stade avancé reste faible. Parce que, la majorité des patients atteints de métastases péritonéales présentent des symptômes insidieux tels que le manque d'appétit, perte de poids, sensation de ballonnement, la douleur ou le diagnostic de l'anémie est souvent retardée et les thérapies locales ne sont plus possible [24]. PIT est une méthode prometteuse de traitement du cancer péritonéale disséminée. Afin d'effectuer efficacement PIT, le APSC doit être délivré par voie systémique et la lumière doit être appliquée de manière sélective au péritoine. Dans ces conditions, il y a la livraison suffisante de APSCs entraîner une réduction des tumeurs disséminées après PIT. Ce processus peut être suivi en temps réel avec in vivo Il existe plusieurs limites à cette étude. Il convient de noter que tous les cancers gastriques expriment pas HER2 et, par conséquent, tra-IR700 peuvent ne pas être uniformément efficace dans le cancer gastrique disséminée. En effet, il peut être nécessaire d'utiliser un cocktail d'APSCs pour couvrir efficacement la plupart des profils d'expression dans une tumeur donnée [25]. Une autre mise en garde dans cette étude est que la lumière pourrait être administré par voie transcutanée dans les petites souris, mais ce n'est pas possible chez les humains. Afin de traiter efficacement les humains avec PIT, il sera nécessaire d'appliquer la lumière laparoscopie pour empêcher l'absorption par la peau. Une autre limitation est que notre modèle n'a été évaluée chez des souris immunodéprimées. La réaction immunologique du PIT sera évaluée à l'avenir chez les souris immunocompétentes. Enfin, dans la fluorescence imagerie à proximité de la GFP terme sera limité à des études animales, car elle nécessite la transfection de la tumeur avec une protéine endogène. Néanmoins, ceci est une lecture utile pour les études précliniques. PIT est efficace contre HER2-positif cancer gastrique carcinose péritonéale dans une imagerie de modèle de souris et de la fluorescence de la GFP permet la surveillance des effets de l'IRP. Informations complémentaires Remerciements Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des national Institutes of Health, national Cancer Institute, Centre de recherche sur le cancer. Kazuhide Sato est soutenu par JSPS bourse de recherche pour le japonais biomédicale et comportementale Les chercheurs au NIH.
GFP imagerie de fluorescence. In vitro
et in vivo
expériences ont été menées avec une, ligne de HER2 exprimant GFP exprimant gastrique cellule cancéreuse (N87-GFP). Un conjugué composé d'un photosensibilisant, IR-700, conjugué à trastuzumab (tra-IR700), suivie par la lumière NIR a été utilisé pour PIT. In vitro
PIT a été évaluée par la mesure de la cytotoxicité avec une coloration morte et une diminution de la fluorescence de la GFP. In vivo
PIT a été évaluée dans un modèle de carcinose péritonéale disséminée et une xénogreffe de flanc en utilisant des mesures de volume de la tumeur et l'intensité de la fluorescence de la GFP. In vivo
effets anti-tumoraux de PIT ont été confirmées par des réductions significatives dans le volume tumoral (au jour 15, p < 0,0001 par rapport au témoin) et GFP intensité de fluorescence (modèle de flanc: au jour 3, PIT traités vs. contrôle p < 0,01 et le modèle péritonéale disséminée: au jour 3 PIT traités par rapport au témoin, p < 0,05). Les effets cytotoxiques in vitro
ont été montrés à être dépendante de la dose de lumière et a provoqué la rupture des cellules nécrotiques conduisant à GFP libération et une diminution de l'intensité de fluorescence in vitro.
Ainsi, la perte de fluorescence de la GFP a servi comme un biomarqueur utile de la nécrose cellulaire après PIT
études ont montré PIT pour être hautement spécifique d'une cellule, par conséquent, les cellules exprimant non immédiatement adjacentes à des cellules cibles présentent pas d'effets toxiques [5]. Les cellules traitées avec PIT subissent une expansion de volume rapide conduisant à la rupture de la membrane cellulaire, l'extrusion du contenu des cellules dans l'espace extra-cellulaire et la nécrose irréversible [6] - [8]. Nos résultats démontrent que d'autres et la cytotoxicité induite par PIT totalement ne repose pas sur les espèces réactives de l'oxygène ou de l'existence de l'oxygène singulet désactivateurs [9]. En outre, la cytotoxicité induite par PIT est principalement dans la membrane cellulaire plutôt dans les mitochondries que se produit avec PDT.
imagerie est qu'ils ne nécessitent pas d'injections extrinsèques des agents (tels que la luciférine dans le cas de bioluminescence) et peuvent être surveillés en temps réel [14] - [18]. Comme ils exigent la transfection de gènes, ils seraient probablement seulement être utile dans les études pré-cliniques.
Synthèse du trastuzumab ou panitumumab IR700 conjugué, et IR800 conjugué trastuzumab
in vitro PIT
cytotoxicité test
Estimation de l'intensité de la fluorescence GFP in vitro
procédures ont été menées en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire Ressources (1996), US national Research Council, et approuvé par le Comité soin et l'utilisation des animaux NIH. Six à huit semaines d'âge des souris nues athymiques homozygotes femme ont été achetés chez Charles River (NCI-Frederick). Afin d'évaluer l'effet que la cellule tumorale directe tuant des in vivo
PIT, des souris nude immunodéprimées ont été utilisés. Pendant les procédures, les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane. Dix millions de cellules N87-GFP ont été injectées par voie sous-cutanée dans le dos droit des souris. Afin de déterminer le volume de la tumeur, le plus grand diamètre longitudinal (longueur) et le plus grand diamètre transversal (largeur) ont été mesurées avec un pied à coulisse externe. Les volumes des tumeurs basées sur des mesures d'épaisseurs ont été calculées par la formule suivante; volume tumoral = longueur x largeur 2 × 0,5. Tumeurs atteignant environ 100 mm 3 de volume ont été sélectionnés pour l'étude. Pour mesurer la fluorescence de GFP après PIT, dix millions de cellules N87-GFP injection sous-cutanée dans les deux dorsi des souris. Pour le modèle de souris de cancer péritonéal disséminée, cinquante millions de cellules N87-GFP avec PBS (total 300 pl) ont été injectés dans la cavité péritonéale.
In vivo l'imagerie de fluorescence
images de fluorescence ont été obtenus avec un imageur Pearl (LI-COR Bioscience) pour détecter IR700 /fluorescence IR800, et un imageur Maestro (CRi, Woburn, MA, USA) pour la GFP. Pour la GFP, un filtre passe-bande 445 à 490 nm (excitation) et un filtre bleu passe-haut au-dessus de 515 nm (émission) ont été utilisées. Le filtre d'émission accordable a été automatiquement intensifié par incréments de 10 nm 500-600 nm pour les verts ensembles de filtres à une exposition constante (500 msec). Les images de fluorescence spectrale sont constitués de spectres d'autofluorescence et les spectres de la GFP (GFP-N87 tumorale), qui sont alors sans mélange, sur la base du motif caractéristique spectrale de la GFP, en utilisant le logiciel Maestro (CRi). Régions d'intérêt (ROI) ont été établis manuellement, soit sur la tumeur du flanc ou sur la région abdominale, le cas échéant à l'intensité du modèle et la fluorescence a été mesurée [19].
Caractérisation du modèle de souris péritonéale disséminée
Analyse statistique
test a également été utilisé pour comparer les deux in vitro
étude; p < 0,05 a été considéré pour indiquer une différence statistiquement significative
Microscopie in vitro PIT
Évaluation in vitro PIT effet
PIT, nous avons effectué un test de cytotoxicité basé sur l'incorporation de PI, qui a démontré que la mort cellulaire a augmenté avec la dose de lumière croissante (Fig. 1C). Aucune cytotoxicité significative n'a été détectée avec exposition à la lumière NIR ou tra-IR700 seul.
Évaluation avec la GFP fluorescence in vitro après PIT
In vivo PIT réduit le volume de la tumeur dans le modèle de xénogreffe de flanc
souris porteuses de tumeurs (Fig. 2A). PIT induit des réductions significatives de volume de la tumeur (n = 10 dans chaque groupe, * p = 0,0456 < 0,05, test de Tukey). Quatre souris sur dix dans le groupe de PIT ont été complètement guéris par le traitement (Fig. 2B). La survie a été prolongé de façon significative dans le groupe PIT par rapport au groupe témoin (n = 10 dans chaque groupe, ** p < 0,0001, test de longue rang et test de Wilcoxon) (figure 2C).. Ces données suggèrent que PIT a provoqué une réduction significative des tumeurs et la survie prolongée in vivo
.
imagerie GFP Fluorescence In vivo après PIT dans le modèle de xénogreffe de flanc
PIT, la GFP d'imagerie en temps réel a été réalisée chez des souris avec des tumeurs de la N87-GFP de flanc bilatéral (Fig. 3A). la fluorescence de la GFP a démontré la charge tumorale et la réponse à l'IPP. fluorescence de la GFP a été corrélée avec IR700 fluorescence, qui a diminué rapidement après PIT (Fig. 3C). imagerie de fluorescence totale (TFI) de la GFP dans les tumeurs non traitées (contrôle) et dans les tumeurs recevant la lumière seulement augmenté en raison de la croissance tumorale. Dans les tumeurs traitées avec PIT, TFI de la GFP a diminué progressivement dans la tumeur traitée, alors que la tumeur opposé dans la même souris (iv seulement, pas de lumière) a montré une augmentation fluorescence de la GFP (Fig. 3B).
.
analyse a été réalisée (Fig. 4A). L'effet de l'IRP a été confirmée par une diminution de la fluorescence IR700 (Fig. 4B). Sous cette condition, l'intensité de la GFP de ex vivo
tumeurs a diminué après PIT (Fig. 4B). Ces données suggèrent que la GFP imagerie en temps réel en direct est compatible avec ex vivo
imagerie.
GFP Fluorescence imagerie après In vivo PIT dans le modèle péritonéale disséminée
Discussion
fluorescence de la GFP imagerie permet le processus complet de la tumorigenèse, le traitement, la régression, la métastase ou la récidive, à être détectée dans le même animal sans procédures invasives [10], [11]. En utilisant des cellules exprimant la GFP cytoplasmique, les effets antitumoraux induits par PIT pourraient être facilement surveillés en raison de l'extrusion de la GFP de cellules traitées.
GFP imagerie de fluorescence.
Conclusions
Figure S1.
spécifique la mort cellulaire nécrotique ciblée a été observée après PIT in vitro.
cellules N87-GFP ont été co-cultivées avec 3T3 /DsRed (HER exprimant non) des cellules. Ils ont été traités avec des tra-IR700 et observées (avant et après irradiation de la lumière NIR). la mort cellulaire nécrotique spécifique ciblée a été observée lors de l'excitation avec de la lumière NIR (après 30 min). Aucun dommage n'a été démontré dans les cellules 3T3 /DsRed. . * Cellules 3T3 /DsRed, Bar = 25 um
doi: 10.1371 /journal.pone.0113276.s001
(TIFF)
Figure S2.
Effet de la GFP-fluorescence à 1 jour après PIT a été observée in vitro.
décroissants intensité GFP-fluorescence à 1 jour après PIT a été observée pour être d'une manière dépendante de la dose de lumière. Bar = 100 um. La ligne noire au bord était le marqueur pour déterminer la position d'observation
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s002
(TIFF)
Figure S3.
Les diminutions de GFP-fluorescence à 1 jour après PIT évalué par cytométrie en flux. Décroissants intensité GFP-fluorescence à 1 jour après PIT était d'une manière dépendante de la dose de lumière par l'analyse de cytométrie de flux
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s003
(TIFF)
Figure S4.
In vivo
imagerie de fluorescence en réponse à PIT répétée dans le péritonéale disséminée modèle de souris. In vivo
imagerie de fluorescence en réponse à PIT répétée. fluorescence IR700 a été diminuée en réponse à PIT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s004
(TIFF)
vidéo S1. images
Time-lapse DIC d'une cellule N87-GFP traité par PIT. images Time-lapse séquentielles DIC (vidéo) d'une cellule N87-GFP montre des changements morphologiques de la cellule après l'irradiation de lumière NIR dans les cellules traitées avec tra-IR700 (25 min observation au total). Clignotant est un rayonnement NIR de lumière (2 J /cm 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s005
(AVI)
vidéo S2.
Time-lapse images de fluorescence de PI d'une cellule N87-GFP traité par PIT. séquentielles images de fluorescence de PI Time-lapse (vidéo) présente des dommages à membrane rapide d'une cellule N87-GFP après irradiation de la lumière NIR dans les cellules traitées avec des tra-IR700 (25 min observation au total). Clignotant est l'irradiation de lumière NIR (2 J /cm 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s006
(AVI)
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