PLoS ONE: N-myc Loppupään Säännellyt Gene 1 (NDRG1) Edistää Etäpesäke Ihmisen Scirrhous Mahalaukun Syöpäsolut kautta epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon

tiivistelmä

Tuore tutkimus osoitti, että korkeampi ilmentyminen N-myc vaimentua geeni 1 (NDRG1) korreloi huonon ennusteen mahalaukun syöpäpotilailla. Tässä tutkimuksessa, kysyimme, onko NDRG1 on keskeinen rooli pahanlaatuisia etenemisen lukien etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsoluja. By geenien ilmentymisen mikrosiruanalyysi ilmaus NDRG1 osoitti suurempi kasvu keskuudessa yhteensä 3691 asti geenien on erittäin metastaattinen mahasyövän solulinja (58As1) kuin niiden vanhempien alhainen metastaattinen vastine (HSC-58). Erittäin metastaattinen solulinjat osoitti vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin sekä paremman ilmentymisen vimentiinista ja Snail. Tämä vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin palautettiin Snail Knockdown erittäin metastaattinen solulinjoissa. Me seuraavaksi vakaa NDRG1 pudotus solulinjoja (As1 /Sic50 ja As1 /Sic54) päässä erittäin metastaattinen solulinja, ja molemmat näistä solulinjoista osoitti lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen vimentiinista ja Snail. Ja myös E-kadheriinin promoottoriajetun lusiferaasiaktiivisuus havaittiin korotetaan NDRG1 pudotus on erittäin metastaattinen solulinja. NDRG1 Knockdown mahalaukun syöpäsolujen osoitti tukahdutti invaasiota syöpäsolujen osaksi surround kudoksiin, tukahdutetaan etäpesäke vatsakalvon ja laski askitesta kertymistä hiirillä merkittävästi parantaa eloonjäämisaste. Tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että NDRG1 pelaa keskeinen rooli pahanlaatuinen etenemisen mahasyövän epiteelin mesenkymaalitransitioon.

Citation: Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M , et ai. (2012) N-myc Loppupään Säännellyt Gene 1 (NDRG1) Edistää Etäpesäke Ihmisen Scirrhous Mahalaukun Syöpäsolut kautta epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 joulukuu 2011; Hyväksytty: 22 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 23 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan-in-tuki Cancer Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (Dr. Ono), ja jonka kolmas Term Kattava ohjaus Research for Cancer alkaen terveysministeriön, Labor, ja hyvinvointi Japanin (Dr. Kuwano). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten Japanissa ja muissa Aasian maissa. Potilas ennustetta scirrhous mahakarsinooman on erityisen huono. Scirrhous mahakarsinoo- liittyy usein vatsakalvon levittäminen ja etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin ja maksa, jotka ovat vakavia ongelmia, on valvottava. Geeniekspressioprofiili paljasti geenin amplifikaatioita K-sam ja c-Met: in 30-40% scirrhous syöpien, ja että yli-ilmentyminen erilaisia ​​kasvutekijöitä, kuten transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β), verihiutalekasvutekijän tekijä (PDGF), insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) ja fibroblastikasvutekijä-2 (FGF-2) [1]. Viimeaikaiset DNA microarray-analyysi osoitti erityistä säätelyä useita geenejä, mukaan lukien SPARC
, RGEIII
, S100A10
, ja I-tyyppistä kollageenia [2] - [4].

eläinten malleja, jotka heijastavat ominaisuudet syöpä vatsakalvotulehdus ja etäpesäke vatsakalvon ovat tärkeitä ymmärtämisen kehittämisessä pahanlaatuinen etenemisen mahasyövän. Yanagihara et al.
[5] määritti ensin HSC-58-solulinja ihmisen scirrhous mahasyöpä, ja sitten perustettiin kaksi alilinjat, 58As1 ja 58As9, joilla on korkea potentiaali vatsakalvon levittämistä ja imusolmuke etäpesäke toistuvilla ortotooppisten inokulaation HSC-58-solujen kohdalla mahalaukun seinämän kateenkorvattomissa hiirissä [6], [7]. Nämä alalinjoja aiheuttavat usein kertymistä askites jälkeen ortotooppinen implantaatio ja näyttää lisääntyneen ilmentymisen geenejä, jotka koodaavat proteaaseja ja proteiinien liittyi solun tarttumiseen, solun liikkuvuus, proliferaation ja angiogeneesin [6]. Ne myös kasvaa valikoidusti mahalaukun submukoosassa, ja tunkeutua syvemmälle kerros päästä herakalvon tason vatsa [7]. On kuitenkin vielä epäselvää, miksi ne ovat saaneet niin suuri potentiaali etäpesäkkeitä valinnan aikana.

Meidän Tässä tutkimuksessa käytimme näitä erittäin metastaattinen solulinjojen selvittämään, miten ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa voisi hankkia metastaattista potentiaalia. Ensin verrataan geeniekspressioprofiilien välillä erittäin metastaattinen ja alhainen metastaattinen vanhempien solulinjoissa mikrosiruanalyysillä. Olemme keskittyneet yksi geeni nimeltä N-myc alavirtaan säännelty geeni 1 (NDRG1), koska se havaittiin selvästi voimistunut on erittäin metastaattinen mahasyövän solulinjoja verrattuna niiden vastine soluihin. Lisäksi aiemmin raportoitu, että NDRG1 ilme oli predicative merkkiaine pahanlaatuinen etenemisen ja huonon ennusteen mahalaukun potilailla [8]. Tämän mukaisesti tutkimuksessa havaitsimme, että korkean NDRG1 ilmentyminen korreloi merkitsevästi kasvaimen angiogeneesiä ja pahanlaatuiset etenemisen yhdessä huonon ennusteen mahasyövässä [9]. Meillä on myös raportoitu, että NDRG1 pudotus indusoi tuotannon vähenemiseen tehokkaita angiogeenisten tekijöiden ja kasvaimen angiogeneesin keuhkosyövän soluja, ja lisäksi, että NDRG1 on ennustava markkeri kasvaimen angiogeneesiä ja huonon ennusteen potilailla, joilla ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10]. NDRG1, yksi neljästä NDRG perheen geenejä, mikä osoittaa erilaisia ​​toimintoja [11], ja NDRG1 toimii joko etäpesäke vaimennin tai onkogeenisten ja pahanlaatuisten promoottorin, riippuen kasvaintyypeissä [11], [12]. Lisäksi ilmentyminen NDRG1 geenin valvotaan tarkasti N-Myc: llä ja niihin liittyvät Myc proteiinit [13], ja yli-ilmentyminen c-Myc indusoi epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) in nisäepiteelisoluissa [14]. Tärkeän roolin EMT viitataan usein sen lähellä kehitystä vasten ja syövän etenemistä lukien syövän etäpesäkkeiden [15], [16]. Kuitenkin näissä tutkimuksissa, sääntelyn rooli NDRG1 ei ole tutkittu. Meidän Tässä tutkimuksessa tutkimme metastaattista potentiaalia mahalaukun syöpäsolujen sen korrelointia EMT-pohjainen rooli NDRG1.

Tulokset

vertailu Cell Growth, Solumorfologia, Tumor Growth, levittäminen ja Gene Expression Profiles välillä Helposti metastasoitunut mahasyöpä syöpäsolulinjoista ja niiden Low metastaattinen Counterpart

yhdenmukainen aiempien tutkimusten [6], [7], erittäin metastaattinen solulinjoissa 58As1 ja 58As9 kasvuvauhti oli kuin niiden vanhempien vastine, HSC-58, jossa on kaksinkertaistaa aikoina 23-26 tuntia verrattuna 30 tuntia vanhempien soluja (kuvio 1A). 58As1 solut helposti irrotettavissa ja osoitti jousitus-tyyppinen solujen kasvun kanssa pyöreä morfologia, kun taas HSC-58 ja 58As9 solut kiinnitetään ja osoitti kerroksellinen solujen kasvua fibroblastisella morfologia (kuvio 1 B). Sekä 58As1 ja 58As9 solut osoittivat paljon korkeampi kasvaimen kasvulukuja ihonalaisen ksenograftimallia verrattuna vanhempien HSC-58-solut (kuvio 1 C). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että potilaalle tehdä elinsiirron 58As1 solujen aiheuttama paljon korkeampi vatsakalvon levittämistä ja askitesta kertymistä kuin HSC-58-soluissa [6], [7]. Olemme edelleen vahvisti vatsakalvon levittämistä solujen istuttamalla ne vatsaonteloon hiirien. Hiiret istutettiin 58As1 solut osoittivat ulkonäkö keskimäärin 8 ± 3 näkyvä kyhmyjä suoliliepeessä kunkin hiiren ja kertymistä askites (vaihteluväli 0,7-2,5 ml /hiiri) (kuvio 1 D, E). Sitä vastoin, hiiret istutettu vanhempien HSC-58-solut osoittivat muodostumista vähän jos ollenkaan pieniä kyhmyjä, ja mitään ilmeistä kertymistä askites.

seuraavan verrattuna geeniekspressioprofiilit välillä 58As1 solujen ja niiden vanhempien vastine, HSC- 58, käyttämällä DNA-mikrosiruanalyysillä. Ja 41000 RNA-transkriptien ja variantteja, olemme määritelleet 3691 differentiaalisesti ilmentyvien geenien, jotka ilmentyivät 2-kertaiseksi, ja 3536-geenit, jotka olivat vaimentua 0,5-kertainen tai vähemmän 58As1 soluissa verrattuna HSC-58-soluissa. Kuvio 1F esitetään geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti 58As1 soluissa verrattuna HSC-58-soluja, rajoittumatta ne, jotka kuuluvat NDRG perheen, ja geenit, jotka liittyvät metastaasiin, mukaan lukien matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) /katepsiinit, tarttuvuus ja epiteelin-mesenkymaaliset-siirtymä ( EMT). Neljän geenien NDRG perheen [17], ilmentyminen NDRG1 ja NDRG4 on yliaktiivista erittäin metastaattinen solulinja (58As1) verrattuna emo-solulinja (HSC-58). Ilmaisu EMT liittyvien geenien 58As1 soluissa vaikutti erityisesti hankinta korkean metastaattisen potentiaalin. Ekspression epiteelin-spesifisten geenien, kuten E-kadheriinin ( CDH1
), P-kadheriinin ( CDH3
) ja β-kateniinin ( CTNNB1
), säädeltiin vähentävästi . Sen sijaan vain MMP-1 ( MMP-1
) ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut; ilmaus katepsiini L ( CTSL1
) lisättiin, mutta se katepsiini B ( CTSB
) ei ollut. Ilmentyminen mesenkyymispesifisissä geenejä, vimentiinistä ( VIM
) ja Snail ( SNAI1
), keskeinen transkriptio tekijä tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentyminen oli upregulated.

Tehostettu NDRG1 Gene Expression in Erittäin Metastaattinen mahasyövän Cell Lines

entisestään verrattuna proteiinin ilmentyminen useiden geenien HSC-58, 58As1 ja 58As9 solut (kuvio 2A). Ilmentyminen NDRG1 oli merkittävästi lisätty, ja että vimentiinin, Snail, p-ERK1 /2, p-Akt, ja p-GSK-3β lisättiin myös, sekä 58As1 ja 58As9 soluja verrattuna HSC-58-soluissa. Ei ollut mitään näkyvää ilmentymistä Wnt3a ja Wnt5a näissä solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Sen sijaan havaitsimme, vähentyneen ilmentämisen E-kadheriinin ja β-kateniinin 58As1 ja 58As9 soluja verrattuna HSC-58-soluissa (kuvio 2A). Fosforylaatiota β-kateniinin Ser33 /37 ja Ser552: n havaittiin olevan paljon vähemmän 58As1 ja 58As9 kuin HSC58. Sopusoinnussa proteiinin ekspressiotasoja, mRNA: n ekspressiotasot NDRG1, vimentiinin, Snail ja MMP-1-oli korkeampi sekä erittäin metastaattinen solulinjoissa kuin vanhempien vastine (kuvio 2B). Oli paljon vähemmän mRNA: n ilmentymisen E-kadheriinin ja β-kateniinin sekä 58As1 ja 58As9 kuin HSC-58.

immunosytokemiallinen analyysi paljasti, että lokalisoinnin E-kadheriinin sekä sytoplasmassa ja kalvo, ja β-kateniinin oli enimmäkseen lokalisoitu sytoplasmassa sekä HSC-58 ja 58As9 soluja (kuvio 2C). Immunosytokemiallisessa analyysi 58As1 ei voitu suorittaa, koska 58As1 kasvaa suspensiossa. Lisäksi ilmentyminen β-kateniinin oli suhteellisesti pienempi sekä sytoplasmassa ja tumassa, mutta että Snail havaittiin olevan paljon suurempi ytimen 58As1 ja 58As9 kuin HSC-58 (kuvio 2D). Tutkimme myös E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta (kuvio 2E) ja β-kateniinin aiheuttama toimittaja aktiivisuutta TopFlash reportterianalyysi (kuvio 2F) ja totesi, että oli merkittävä lasku lusiferaasiaktiivisuutta ohjaavat E-kadheriinipromoottorin ja myös β-kateniinin sekä 58As1 ja 58As9 verrattuna HSC-58, vastaa mRNA-tasot molempien geenien.

NDRG1 knockdown indusoi lisääntymisen merkkejä E-kadheriinin ja vaimennussäätely vimentiinista ja Snail erittäin Metastaattinen Solut

Me seuraavaksi tutkittava, onko NDRG1 knockdown erityisesti kohdistuu ilmentymistä EMT liittyvien geenien erittäin metastaattinen solulinjan, 58As1. Perustimme kaksi stabiilia NDRG1 pudotus solukloonien, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 transfektoimalla NDRG1 shRNA osaksi 58As1 soluihin. Molemmat As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 soluista osoittivat samanlaisia ​​kasvuvauhti toisiinsa ja niiden vanhempien vastine As1 /Mock3, jossa kaksinkertaistaa aikoina 25-27 tunnin viljelmässä (kuvio 3A). Molemmat NDRG1 vaiennetaan solulinjat osoittivat tarttuu tiukasti solujen kulttuuriin lautasen ja sidekudosta morfologia, kun taas As1 /Mock3 solut osoittivat suspension-tyyppinen solujen kasvua pyöreillä solumorfologiaan (kuvio 3B). Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus NDRG1 hiljentäminen on kasvaimia aktiivisuutta 58As1 solujen käyttäen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun määrityksessä. Molemmat NDRG1 vaiennetaan solulinjat osoittivat merkittävästi vähentää niiden kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, kuten on osoitettu pesäkkeiden määrä pehmeässä agarissa ( ^{* p <
0,01) (kuvio 3C).}

sitten vertasimme geeniekspressioprofiilien välillä As1 /Mock3 ja As1 /Sic50 soluihin käyttämällä DNA-siru-analyysi (kuvio 4A). NDRG1 pudotus lisännyt ilmentyminen E-kadheriinin ( CDH1
) ja P-kadheriinin ( CDH3
), mutta vähentynyt ilmentyminen vimentiinista ( VIM
) ja Snail ( SNAI1
). Me seuraavaksi suoritetaan Western blot ja qRT-RCR analyysit useita molekyylejä, jotka moduloidaan NDRG1 Knockdown vuonna mikrosiruanalyysi (kuvio 4B, C). Nämä kaksi solulinjaa osoitti paljon pienempi ilmentyminen sekä NDRG1 mRNA: ta ja proteiinia verrattuna As1 /Mock3 soluja. Tehostettu ekspressio E-kadheriinin havaittiin yhdenmukaisesti As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 soluja verrattuna As1 /Mock3 solujen Western blot -analyysillä. Vuonna As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 soluja, sekä western blot ja qRT-PCR-analyysit vahvistivat vähentynyt ilmentyminen vimentiinista ja Snail vaikuttamatta ilmentymistä p-ERK1 /2, ERK1 /2, s-Akt, Akt, p-GSK-3β ja GSK-3β (kuvio 4B, C).

Toisaalta, NDRG1 on tunnettu tukahduttaa etäpesäkkeiden ja soluproliferaatiota eturauhas- ja paksusuolen syöpäsoluissa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että NDRG1 moduloi Wnt-β-kateniinin signalointireitin, joilla on tehostunut ilmentyminen E-kadheriinin ihmisen eturauhas- ja paksusuolen syöpä solujen [18], [19]. Kuitenkin NDRG1 pudotus on 58As1 solut eivät vaikuta β-kateniinin ilmentymistä sekä proteiini- ja mRNA-tasolla (kuvio 4B, C). Ja myös β-kateniinin ohjaavat promoottorin aktiivisuutta TopFlash reportterianalyysi paljastanut mitään eroa promoottorin aktiivisuuteen As1 /Mock ja NDRG1 vaiennetaan solulinjoissa. Näin ollen, β-kateniinin ilmentymistä ei vaikuttanut NDRG1 pudotus. NDRG1 pudotus siis jatkuvasti lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen Snail ja vimentiinista vuonna erittäin metastaattinen solulinjassa. Kuitenkin, ei havaittu selvää muutosta ilmentymisen β-kateniinin by NDRG1 knockdown.

Enhanced E-kadheriinipromoottorin Activity by NDRG1 Knockdown läpi Snail mahasyövän Cells

eri transkriptiotekijöitä, jotka tukahduttaa ilmentyminen E-kadheriinin kuten Snail, Slug, Twist, TCF4 ja SIP1 [20], ilmentyminen Snail oli nimenomaan moduloitu NDRG1 mahalaukun syöpäsoluja. Tutkimme, onko ilmaus E-kadheriinin ja /tai vimentiinista voitaisiin säädellä Snail HSC-58 soluihin. Ohimenevä hoito Snail siRNA lisännyt ilmentyminen E-kadheriinin, mutta ei että vimentiinista ja NDRG1, aika-riippuvaisella tavalla (kuvio 5A). Oli vain hieman jos lisääntymiseen β-kateniinin ilmentymisen Snail knockdown. Lisäksi E-kadheriinin promoottoriajetun lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi tukahdutti transfektoimalla Snail komplementaarisen DNA: n kahdessa syövän testatut solulinjat (kuvio 5B). Seuraavaksi me verrattuna E-kadheriinipromoottorin aktiivisuuden välillä As1 /Mock3 ja sen NDRG1 vaiennetaan solulinjoissa. Kuten nähdään kuviosta 5C, oli merkittävä (* p
< 0,05) lisääminen E-kadheriinin promoottorin aktiivisuutta NDRG1 pudotus.

GSK-3β on keskeinen entsyymi aktivoinnin EMT polku [20], [21], ja myös fosforylaation NDRG1 [22], [23]. Expression of p-GSK-3β nostettiin erittäin metastaattinen solulinja, 58As1 (katso kuvio 2A). Me tutki GSK-3β oli mukana NDRG1 aiheuttama muuttunut ilmentyminen E-kadheriinin ja vimentiinista. Hoidon inhibiittoria (CT99021) GSK-3β johti vähentyneeseen ekspressioon p-NDRG1 ja p-GSK-3β, ja myös lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin 58As1 soluissa (kuvio 5D). Kuten kuviossa 5E, β-kateniinin Knockdown ei vaikuttanut ilmaus E-kadheriinin, vimentiinistä ja Snail.

NDRG1 Knockdown indusoi mesenkyymikasvaimia Epithelial Siirtyminen ja vaimentaa Etäpesäke vatsakalvon by Highly Metastasoitunut mahasyöpä syöpäsoluja

vertailu kasvaimen kasvuvauhdin As1 /Mock3, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 solujen ksenograftimallia paljasti hitaampi kasvaimen kasvu sekä As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 esittäjä NDRG1 taintumisen (kuvio 6A, B). NDRG1 Knockdown tukahdutti paikallisen invaasion As1 /Mock3 kasvainsoluja ympäröivän strooman ja vieressä rasva- ja /tai lihaskudoksen ja kapseloitu kasvaimen kasvua (kuvio 6C). Korkea ilmentyminen E-kadheriinin havaittiin As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 kasvaimia, kun taas korkea ekspressio vimentiinista havaittiin syöpäsoluja As1 /Mock3 kasvaimia (kuvio 6D). Sitä vastoin ei ollut juuri mitään muutosta ilmentymistä β-kateniinin As1 /Sic50 ja As1 /Sic54 kasvaimissa verrattuna As1 /Mock3 kasvain.

tutkia NDRG1 Knockdown voi vaikuttaa etäpesäke vatsakalvon ja kertymistä ja askites, vertasimme metastaattisen potentiaalin As1 /Sic50 ja As1 /Mock3 soluissa, sen jälkeen potilaalle tehdä transplantaation. Kuviossa 7A edustavat kuvat laajentuneen vatsaontelon ja läsnäolo syövän kyhmyt on vatsakalvon. Sen jälkeen potilaalle tehdä inokulointi As1 /Sic50 solujen määrä kyhmyt esiintyvät vatsakalvon oli noin 30% pienempi kuin mitä aiheutuu As1 /Mock3 soluja, mutta tämä väheneminen ei ollut tilastollisesti merkitsevä ( p
= 0,21) (Kuva 7B). Kuitenkin kyhmyt johtuvat As1 /Sic50 solut osoittivat paljon pienempiä kokoja kuin tuonti As1 /Mock3 soluja (kuvio 7A). Kertyminen Vesivatsanesteestä As1 /Sic50 soluja oli merkitsevästi (* p < 0,01) vähentynyt, noin 10%, joka indusoi As1 /Mock3 soluja (kuvio 7C). Lisäksi oli merkittävä (* p
< 0,01) kasvu eloonjäämisaste hiirillä, jotka inokuloitiin As1 /Sic50 soluja (51 ± 16 vuorokautta) verrattuna 35 ± 14 vuorokauden hiiriä inokuloitiin As1 /Mock3 soluja, mikä osoittaa, että NDRG1 taintumisen pidensi elinaikaa (kuvio 7D).

keskustelu

Olemme aiemmin raportoitu, että NDRG1 korreloi kasvaimen angiogeneesiä ja huono eloonjäämisen potilailla, joilla on mahalaukun syövän, mikä viittaa siihen, että NDRG1 ennakoiva biomarkkeri pahanlaatuinen etenemisen mahasyövän [9]. Meidän Tässä tutkimuksessa havaitsimme seuraavat ominaisuudet liiketoimen taustalla korkean metastaattista potentiaalia mahasyövässä: microarray, western blot ja RT-PCR-analyysit yhdessä paljasti säätelyä NDRG1 on erittäin metastaattinen solulinjat, 58As1 ja 58As9 verrattuna niiden alhainen metastaattinen vanhempien vastine, HSC-58; korkeampi ilmentyminen vimentiinista, Etana, ja MMP-1, ja alempi ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin näkyivät erittäin metastaattinen solulinjoissa verrattuna niiden vanhempien vastine; geenien vaimentua siinä erittäin metastaattinen solulinja, NDRG1 knockdown johti ylösajon E-kadheriinin ja downregulation vimentiinista ja Snail, mutta melkein mitään vaikutusta ilmentymistä β-kateniinin; E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus merkittävästi täydennetty NDRG1 knockdown; NDRG1 Knockdown myös tukahdutti vatsakalvon levittäminen ja kertymistä askites, ja invaasion erittäin metastaattinen solujen ympäröiviin normaaleissa kudoksissa.

Tässä tutkimuksessa, NDRG1 Knockdown johti tukahduttaminen etäpesäkkeiden erittäin metastaattinen mahalaukun syöpäsoluja (kuva 6 , 7), mikä viittaa siihen, että NDRG1 voi olla etäpesäke promoottori geenin sijasta etäpesäke vaimennin geeni mahasyövässä. Nykyinen tutkimus tukee vahvasti ajatusta, että onko NDRG1 edistää tai estää pahanlaatuinen etenemistä ihmisen syövän riippuu kasvaintyyppeihin ja /tai erilaistumista status [11], [12]. On kuitenkin vielä epäselvää, miksi NDRG1 toimii tuumorisuppressoriproteiinia tai promoottori riippuen kasvaintyypeille tai histologisia tyyppejä. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että NDRG1 tukahduttaa kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä haimasyöpä kautta NDRG1 ajettu vaimennus NF-KB signalointireitistä [24], [25]. Tuoreessa tutkimuksessa on raportoitu, että ilmentyminen etäpesäke estävä geeni, KAI1
geeni, on mukana NDRG1 välittämää etäpesäkkeiden tukahduttaminen eturauhassyövän kautta ATF3-NF-KB-reitin [26]. Edelleen tutkimus vaaditaan ymmärtää mikä sääntelymekanismiin on erityisesti vastuussa NDRG1 ajetaan edistämiseksi pahanlaatuisten etenemisen mahalaukun syöpäsoluja.

EMT on viime kohokohta, joka voisi olla tiiviisti liittyy syövän pahanlaatuisia etenemisen lukien acquirement erittäin metastaattista potentiaalia [15], [16]. Meidän olevassa tutkimuksessa, NDRG1 Knockdown tehostettu ilmentyminen E-kadheriinin ja tukahdutti ilmaus vimentiinista sekä in vitro
ja in vivo
. NDRG1 voi olla keskeinen rooli siirtyminen polarisoitunut epiteelisolujen fenotyyppi erittäin liikkuvia mesenkymaaliset fenotyyppi. Osittainen tai täydellinen menetys E-kadheriinin usein havaittu etenemisen kohti maligniteetti lukuisissa kasvaimissa, mukaan lukien mahasyöpä [27], [28]. Oliveira et ai. [29] ilmoitetaan läheinen yhteys E-kadheriinin tappio ja korkea metastaattista potentiaalia mahasyövässä. Chan, et ai. [30] Lisäksi on raportoitu liukoisen E-kadheriinin biomarkkerina pitkäaikaiseen selviytymisen mahasyöpäpotilaista. NDRG1 Knockdown johti suhteellisesti suurempi E-kadheriinin ilmentymisen As1 /Sic50 kasvaimia kuin As1 /Mock3 kasvaimia, mikä viittaa siihen, että NDRG1 voi erikseen ohjata EMT mahdollisesti transkriptiotekijän Snail mahalaukun syöpäsoluja (kuva 7E).

Wnt signalointi on keskeinen roolit pahanlaatuinen etenemisen ja etäpesäkkeiden keuhkojen ja rintasyövän solujen [31], [32], ja Wnt signalointia myös indusoi EMT johon liittyy metastasointiin epiteelin syövän [31], [33]. NDRG1 tunnetaan etäpesäke vaimennin geeni eturauhasen ja peräsuolen syöpä solujen [11], [12]. Liu et al [18] on raportoitu, että NDRG1 estää etäpesäkkeiden kautta Wnt /β-kateniinin signalointireitin eturauhassyöpäsoluissa. Asiaankuuluva tutkimus Chen et al [19] on myös osoittanut, että NDRG1 moduloi TGF-β-aiheuttama EMT kautta muuttunut ilmentyminen β-kateniinin ja E-kadheriinin peräsuolen syöpäsolun. Nykyinen tutkimus osoitti vähentynyt ilmentyminen β-kateniinin molemmissa erittäin metastaattinen solulinjoissa verrattuna vanhempien vastine, HSC-58. Kuitenkin sekä western blot ja qRT-PCR-analyysit ei havaittu merkittävää muutosta ekspressiotasot β-kateniinin ja β-kateniinin ajettu promoottorin aktiivisuuteen erittäin metastaattista 58As1 soluissa ja sen kaksi NDRG1 vaiennetaan solulinjat. Vaikuttaa epätodennäköisempää, että β-kateniinin on keskeinen rooli tukahduttaminen etäpesäkkeiden mukaan NDRG1 Knockdown erittäin metastaattinen syöpäsoluja.

Toisaalta, GSK-3β tunnetaan myös olevan rooli valvonnassa EMT [20], [21], ja GSK-3β on olennainen entsyymi fosforylaation NDRG1, erinomainen alitilaan GSK-3β [22], [23]. Ilmaisu p-GSK3p oli suhteellisesti korkeampi erittäin metastaattinen solulinjoissa kuin niiden emosolulinjassa (kuvio 2B). Hoito tehokas estäjä GSK-3β johti tukahdutetaan ilmaisu p-NDRG1, mukana säätelyä E-kadheriinin ja β-kateniinin (kuvio 5D). Kuitenkaan ollut juuri mitään eroja ilmentymisessä GSK-3β ja p-GSK-3β by NDRG1 Knockdown on erittäin metastaattinen soluja (kuvio 4B), mikä viittaa siihen, että GSK-3β ei saa olla merkittävä rooli induktioon EMT kautta NDRG1 mahalaukun syöpäsoluja.

Snail on edustava transkriptiotekijä, joka ohjaa ilmentymistä E-kadheriinin [20]. Erilaisten sääntely tekijät kopiointia ohjaavat E-kadheriinin ilmentyminen Snail oli nimenomaan moduloitu NDRG1 mahasyövän solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt. Snail pudotus indusoidun ilmentymisen lisääntyminen E-kadheriinin (kuvio 5A), ja eksogeeninen tarnsfection Snail-cDNA tukahdutetaan E-kadheriinin promoottorin aktiivisuutta (kuvio 5B).

erittäin metastaattinen mahasyövän solulinjat, ilmentyminen Snailin ilmentyminen lisääntyy, kuten verrattuna niiden alhaisen metastaattisen vastine, HSC-58 (kuvio 2A, B). Molemmat NDRG1 vaiennetaan solulinjoissa, As1 /Sic50 ja As1 /Sic54, osoitti vähentynyt ilmentyminen Snail verrattuna niiden erittäin metastaattinen vastine, As1 /Mock3 (kuvio 4B, C). Lisäksi E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus merkittävästi stimuloi molemmissa NDRG1 vaiennettu solulinjoissa verrattuna niiden erittäin metastaattinen vastine (kuvio 5C).

Yhteenvetona NDRG1 Knockdown indusoi säätelyä E-kadheriinin ja downregulation vimentiinista ja Snail, ja tukahdutti invaasio, etäpesäke ja kertyminen Vesivatsanesteestä erittäin metastaattinen mahalaukun syöpäsoluja. Tämä NDRG1 säätelyyn E-kadheriinin ja /tai vimentiinista ilmentymisen vaikutusta epiteelin mesenkymaalitransitioon mahalaukun syövän soluja. Tämä NDRG1 aiheuttama muutos EMT tuntuu olevan ainakin osittain johtuvat transkriptiotekijä Snail. NDRG1, sen lähellä yhteydessä kanssa EMT liittyviä geenejä, voisivat osallistua hankintaan korkean metastaattisen potentiaalin progressiivisella mahalaukun syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja Solulinjat

HSC-58 perustettiin ihmisen scirrhous mahakarsinoomat ja 58As1 ja 58As9 olivat itsenäisesti perustettiin toistuvasti potilaalle tehdä istuttaminen HSC-58 solujen osaksi mahalaukun seinämän Kateenkorvattomien hiirten kuten aiemmin on kuvattu [5], [6]. AS1 /Sic50 ja AS1 /Sic54 solut perustettu vakaa transfektoimalla NDRG1 shRNA osaksi 58As1 soluihin. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). BxPC-3, ihmisen haimasyövän solulinjoissa, saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1-vasta-aine synnytettiin kuten on aikaisemmin kuvattu [34]. Muut vasta-aineet hankittiin seuraavasti: anti-β-aktiini vasta-aine ja anti-Snail-vasta olivat Abcam; anti β-kateniinin vasta-ainetta, anti-β-kateniinin (ser 33/37), anti-β-kateniinin (ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β-vasta-ainetta, anti-EGFR-vasta-aine, anti-GAPDH-vasta-ainetta, anti-p-GSK-3β-vasta-ainetta, anti-ERK1 /2-vasta-aine anti-p-ERK1 /2-vasta-aine, anti-AKT-vasta-ainetta, anti-p-AKT-vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology; anti-vimentiinista vasta-aine oli Calbiochem; anti-E-kadheriinin vasta-aine oli peräisin BD. CT99021 hankittiin Axon Medchem BV (Hollanti).

Gene Expression mikrosirut

Täydentävät RNA monistettiin, leimattu, ja hybridisoidaan 44K Agilent 60-mer oligomicroarray mukaisesti valmistajan ohjeiden (Agilent Technologies). Kaikki hybridisoitiin mikrosirun objektilasit skannattiin by Agilent skanneri. Suhteellinen hybridisaatio intensiteettiä ja taustan hybridisaatio-arvot laskettiin käyttäen Agilent Feature Extraction Software. Tunnistaa ylös tai alas geenien, laskimme suhteet (ei-log skaalata taitettava muutoksia) päässä normalisoitu signaali voimakkuudet kukin koetin väliset vertailut ohjaus ja koenäytteiden. Sitten perustettu kriteerit geenien: up-geenien, suhde ≥2-kertainen; down-geenien, suhde ≤0.5.

Muodosta of NDRG1 shRNA ja perustaminen NDRG1 Knockdown solulinjojen

Voit hankkia ihmiselle U6 siRNA vektori perustuu pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ihmisen U6-promoottori (joka sisältää Hind
III ja Bam
HI kloonauskohtia) monistettiin ihmisen genomisesta DNA: sta alukeparilla 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC ja 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, ja ligoitiin Bgl
II sivusto pcDNA3. Osittainen DNA-fragmentit ihmisen NDRG1 DNA syntetisoitiin kemiallisesti ja kloonattiin pcDNA3-hU6siRNA katkaistiin Hind
III ja Bam
HI tuottaa pcDNA3shNDRG1. Syntetisoitu DNA: t on pcDNA3shNDRG1 olivat: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA ja: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. Etana cDNA valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [35]. Snail-cDNA ligoitiin pcDNA3 (pcDNA3-Snail). Solut transfektoitiin pcDNA3shNDRG1 tai pcDNA3-Snail käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Transfektoitu stabiilisti kloonit määritettiin käyttämällä G418-valinnan.

transfektio Sirna

siRNA vastaavat nukleotidisekvenssejä Snail ja β-kateniinin ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA), vastaavasti, siRNA dupleksit transfektoiduissa käyttäen Lipofectamine RNAiMAX ja Opti-MEM-alustassa (Invitrogen) noudattamalla valmistajan suosituksesta.

Luciferase Assay

saamiseksi E-kadheriinin-Luc vektori, E-cadhein promoottori (-262 +120) monistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukepareja: 5'-AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'ja 5'-AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Aaltoalleviivaus restriktioentsyymipilkkomiskohtia. Monistettu fragmentti ligoitiin pGEM-T-easy-vektoriin (Promega) ja siirretään pGL3-perusvektoriin (Promega) in Bglll- ja Hindlll-kohtien. E-kadheriinin-luc ja pcDNA3-Snail transfektoitiin käyttäen Lipofectamine LTX ja Opti-MEM-alustassa (Invitrogen) noudattamalla valmistajan suosituksesta. 24 tunnin kuluttua lusiferaasiaktiivisuus mitataan valmistajan ohjeiden (Promega). Lisäksi tutkimme myös lusiferaasiaktiivisuutta ohjaavat β-kateniinin käyttäen TopFlash reportterivektoria kuten aiemmin on kuvattu [18].

Soft Agar pesäkkeenmuodostuskyvyn Pitoisuus

4 × 10 ^{3 solut levytettiin 1 ml: aan kasvatusliuosta, joka sisälsi 0,36% (w /v) agaria kerrokseksi tyvikerroksessa 0,72% (w /v) agaria 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kasvaa 3-4 viikkoa. Pesäkkeet kuvattiin ja laskettiin kymmenen satunnaisesti näkökenttien klo 50X suurennus valomikroskoopilla. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.}

Western blot -analyysi ja fraktiointi Nucleus ja Solulima

Solut hajotettiin puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, 0,1% NP40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 1 mM Na3VO4. Kokosoluliuotteista altistettiin SDS-PAGE: lla ja blotattiin Immobilon kalvoja (Millipore Corp., Bedford, MA) kuten aiemmin on kuvattu [24], [25]. Valmistella sytosoliin ja ydin- osa, solut hajotettiin bufferA (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCI, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% IGEPAL ja proteaasi-inhibiittoreita), ja inkuboidaan 20 minuutin ajan jäillä. Sentrifugoinnin jälkeen (3 min, 5000 rpm), supernatantti käytettiin solulimafraktio. Saatu pelletit resuspendoitiin bufferB (20 mM HEPES, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glyseroli, 1 mM DTT ja proteaasi-inhibiittorit) ja inkuboitiin 2 tunnin ajan jatkuvasti sekoittaen 4 ° C: ssa. Sentrifugoinnin (5 min, 15000 rpm), supernatantti käytettiin ydin- osa.

• PLoS ONE: Expression profilointi Stem Cell-sivujen Geenit Neoadjuvant-Käsitelty mahasyövän A NOTCH2, GSK3b ja β-kateniinin Gene Signature ennustaa Survival
• PLoS ONE: rooli verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja VEGF-R genotyypin ohjaamisessa Metastaattinen prosessin pT4a resektoitiin mahasyövän Patients