PLOS ONE: Identificación de suero microARNs como biomarcadores Novel no invasivos para la detección temprana de cáncer gástrico Cancer

Extracto

Antecedentes

Para investigar el potencial de miRNAs en suero como biomarcadores para la detección temprana de cáncer gástrico cáncer (GC), un estudio basado en la población se realizó en Linqu, una zona de alto riesgo de CG en china.

Metodología /Principales conclusiones

Todos los sujetos fueron seleccionados a partir de dos grandes estudios de cohortes . miRNAs diferenciales fueron identificados en mezclas de suero de GC y de control utilizando TaqMan matriz de baja densidad, y validados en individuo de 82 pares de GC y de control, y 46 pares de displasia y el control por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real. Las tendencias temporales de la expresión de los genes miARN identificado suero se analizaron adicionalmente en un estudio retrospectivo de 58 pacientes con cáncer gástrico que tenían al menos una muestra de suero diagnóstico pre-GC basado en la población de seguimiento a largo plazo. Los perfiles de miARN resultados demostraron que 16 miRNAs fueron marcadamente upregulated en pacientes con cáncer gástrico en comparación con los controles. Una validación adicional identificado un panel de tres miRNAs suero (miR-221, miR-744 y miR-376C) como potenciales biomarcadores para la detección de GC, y el receptor característico (ROC) análisis de la evaluación del riesgo basada en la curva de funcionamiento, reveló que este grupo podría distinguir GC de los controles con sensibilidad 82,4% y 58,8% de especificidad. MiR-221 y miR-376C demostraron una correlación significativa positiva con pobre diferenciación de GC, y miR-221 muestran el nivel más alto en la displasia que en el control. Por otra parte, el estudio retrospectivo reveló una tendencia cada vez mayor de estos tres niveles de miARN durante el desarrollo GC ( P Opiniones de tendencia < 0,05), y este panel podría clasificar las muestras de suero recogidas hasta 5 años antes del diagnóstico GC clínica con 79,3 % de precisión en general.

Conclusiones /Importancia

Estos datos sugieren que el suero de miR-221, miR-376C y miR-744 tienen un gran potencial como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección temprana de GC.

Visto: canción Mi, Pan Kf, Su Hj, Zhang L, Ma Jl, Li Jy, et al. (2012) Identificación de Suero Los microARN como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección precoz del cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (3): e33608. doi: 10.1371 /journal.pone.0033608

Editor: Joseph Califano, Escuela de Medicina John Hopkins, Estados Unidos de América

Recibido: 15 Noviembre 2011; Aceptado: 13 Febrero 2012; Publicado: 14 de marzo 2012

Derechos de Autor © 2012 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica del Programa de China (973: 2010CB529303), programa de prospectiva A3 desde Fundación de Ciencias Naturales de China (30921140311) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81041012 y 81171989). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es la segunda causa principal de muerte por cáncer en el mundo, con cerca de la mitad se producen en china [1], [2]. El pronóstico de GC varía notablemente por la etapa del cáncer con la tasa de supervivencia relativa a 5 años alcanzando el 90% en la fase I, pero menos del 5% en estadio IV [3]. Por lo tanto, la detección temprana de GC es una medida clave para reducir la mortalidad y mejorar el pronóstico de GC.

A pesar de que el cribado gastroscopia para GC es altamente fiable, es invasivo y costoso, sobre todo para los países en desarrollo. Por lo tanto, se han hecho muchos esfuerzos para desarrollar pruebas de detección preliminares menos costosos en muestras de fácil acceso. Sin embargo, muchos analitos investigados previamente, tales como pepsinógeno (PG) relación I /II, el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9), no eran suficientemente sensibles y específicos para GC cribado [3], [ ,,,0],4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevos biomarcadores no invasivos para mejorar la detección precoz de la GC.

Los microARN (miRNA) son una clase abundante de pequeños ARN no codificantes que regulan negativamente la expresión génica mediante el apareamiento de bases con la región 3 'no traducida del ARNm diana, dando como resultado o bien la escisión del ARNm o la represión de traducción [5], [6]. aumento de la evidencia ha demostrado que los miRNAs están involucrados en diversos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación celular, proliferación y apoptosis [7], y participar en la carcinogénesis humana como oncogenes o supresores tumorales [8]. Los estudios han indicado que el perfil de expresión de los genes miARN varía entre los tipos de tumores y puede diferenciar el cáncer y tejidos normales [9], [10]. Recientemente, los miRNAs circulantes se han sugerido un gran potencial como biomarcadores para muchos tipos de cáncer, incluyendo GC [11] - [16]. Sin embargo, el valor de hacer circular los miRNAs en la detección temprana de GC no se ha informado todavía.

Desde 1989, se han llevado a cabo una serie de estudios en el condado de Linqu, una zona de alto riesgo de CG en la provincia de Shandong, China , incluyendo un estudio poblacional de cohorte de lesiones gástricas precancerosas [17], [18], y un ensayo aleatorio para inhibir la progresión de las lesiones gástricas [19]. Esta cohorte nos permite investigar los cambios dinámicos en los niveles circulantes de miARN durante el desarrollo de GC, y nos ofrece una oportunidad única para explorar el potencial de hacer circular los miRNAs en la detección temprana de GC.

Aquí, se presenta los resultados de diferencial miRNAs en el suero de GC y displasia (DYS), y un estudio retrospectivo diseñado para evaluar los cambios dinámicos durante el desarrollo GC.

Materiales y Métodos

diseño del estudio y población

Los detalles de la población de estudio, los procedimientos de examen endoscópico, criterios de histopatología gástrica y seguimiento se han descrito en otra parte [17] - [19]. En pocas palabras, una encuesta de detección endoscópica se puso en marcha en 1989 entre los 3399 residentes de 35-64 años en el condado de Linqu, una zona de alto riesgo de CG, y los sujetos sin diagnóstico GC fueron seguidos posteriormente con el examen endoscópico repetido realizado en 1994 [17 ], [18]. En 1995, un ensayo de intervención aleatorizado controlado con placebo se inició en esta población hasta 2003, cuando se repite el examen endoscópico se realizó [19]. Todos los sujetos fueron sometidos a extracción de sangre, tanto en el inicio y el final de punto encuestas de cada estudio, y algunas de ellas con lesiones gástricas avanzadas, como la metaplasia intestinal (MI) o DYS, también se proporcionan sangre y recibieron el examen endoscópico en 1992 y 1999.

en el estudio actual, un multi-etapa, anidados estudio de casos y controles a partir de dos grandes cohortes fue diseñado para identificar y validar los miRNAs suero diferencial en GC y DYS, y un estudio retrospectivo fue realizado para investigar el potencial de suero candidato miRNAs en la detección temprana de GC (Figura 1).

Este estudio se dividió en cuatro fases escalonadas. En la fase I, mezclas de suero de 14 pacientes con cáncer gástrico y 14 controles por edad y sexo con el diagnóstico de gastritis superficial (SG) o gastritis atrófica crónica leve (CAG) se utilizaron para generar perfiles de miARN por el análisis conjunto. Se identificaron miRNAs diferenciales, y se seleccionaron los miRNAs muy upregulated miRNAs o moderadamente upregulated tienen informes funcionales o relacionados con biomarcadores para su posterior análisis. En la fase II, miRNAs identificados fueron validados mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) en las muestras de suero individuales de 14 GC y controles que se utilizaron para la prueba de matriz en fase I. En la fase III, los miRNAs alterado de manera significativa posteriormente fueron validados en pacientes GC 68 y 46 DYS, así como sus controles de la misma edad y sexo. a continuación, se realizó el análisis de evaluación de riesgos característica de funcionamiento del receptor basado en curva (ROC) entre los 68 pares de control de GC para evaluar el efecto de discriminación de miRNAs suero en GC. A cada sujeto se le asigna en cualquiera de los grupos de alto o bajo riesgo mediante la comparación de los niveles de expresión de biomarcadores miARN a los valores de corte correspondientes derivados de la curva ROC. En la fase IV, un estudio retrospectivo se llevó a cabo en 58 pacientes con cáncer gástrico, que proporcionaron al menos una muestra de suero pre-diagnóstico elegibles en el estudio de seguimiento a largo plazo como se ha descrito anteriormente, para explorar la tendencia temporal de los potenciales biomarcadores miARN y determinar su valor en la detección temprana de GC. Todo el estudio fue aprobado por el Consejo de la Universidad de Pekín Hospital Cancer &Revisión Institucional; Instituto, y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito.

Procesamiento de la muestra y la extracción de RNA

Hasta 5 ml de sangre completa de cada participante en ayunas se recogieron con casos y controles realizados en el mismo año. Las muestras de sangre se dejaron reposar durante 30 a 40 min y el suero se llevó a cabo la separación por centrifugación a 965 g durante 15 min. El suero sobrenadante se recuperó y se almacenó a -80 ° C hasta su análisis. Se aisló ARN de 100 l de suero usando el Kit miRNeasy Mini (Qiagen, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante, con modificación menor [20]. Por miARN perfiles, dos piscinas fueron creadas mediante la combinación de las mezclas de la fase acuosa superior después de la separación de fases y etanol a partir de pacientes 14 GC (12 hombres, 2 mujeres, con una edad, 62 (SD 6,4) años) y 14 por sexo y edad de controles pareados (edad, 61 (SD 5,9) años), respectivamente. Después de la unión a la membrana de la columna de centrifugación RNeasy Mini y posterior lavado, el ARN se eluye con 40 l de agua libre de RNasa. Para todos los experimentos QRT-PCR, el ARN extraído a partir de 100 l de suero se eluyó con 100 l de agua libre de RNasa. Para normalizar la variación de muestra a muestra en el paso de aislamiento de ARN, se añadió sintética ath-miR-159a a cada muestra de suero para miARN perfiles mientras cel-miR-39 se añadió para el análisis de QRT-PCR como se describe por Mitchell et al
[11].

Mirna perfilado

Mirna perfiles se realizó utilizando TaqMan gama baja densidad a (v2.0) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Esta plataforma de perfiles de QRT-PCR consiste en la tarjeta de microfluidos uno de 384 pocillos en la que 377 miRNAs pueden ser analizados en conjunto con tres controles endógenos (U6, RNU44 y RNU48) y un control negativo no relacionadas con (ath-miR-159a) humana. En resumen, el ARN agruparse por separado de 14 pacientes con cáncer gástrico y controles de la misma como se describe anteriormente fue transcripción inversa utilizando el kit de transcripción inversa TaqMan miARN y ensayos multiplex RT TaqMan miARN (piscina humana; Applied Biosystems). Para cada conjunto de ARN, se añadieron 3 l de RNA total de cada uno de los multiplex reacciones de transcripción inversa.

Para aumentar la cantidad de cDNA disponibles para el análisis, el enriquecimiento de los genes diana se realizó con un paso de preamplificación. La mezcla de reacción de 25 l consistía en 2,5 l de cDNA diluido combinados con 12,5 l de TaqMan PreAmp Master Mix (2 ×), 2,5 l de Megaplex preamplificador cebadores (10 ×), y 7,5 l de agua libre de nucleasa. La etapa de preamplificación se realizó en un sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante.

Para el análisis de PCR en tiempo real, se diluyó el producto mediante la adición de 75 l de agua libre de nucleasa, y 9 l de la mezcla diluida se combinó posteriormente con 450 l de TaqMan 2 × PCR universal Master Mix sin uracil-N-glicosilasa y 441 l de agua libre de nucleasa. Después de cargar 100 l de cada mezcla de piscina multiplex, la matriz se centrifugó y se sella. La amplificación se realizó en un Applied Biosystems 7900 HT ciclador térmico (Applied Biosystems) utilizando las condiciones del ciclo recomendadas por el fabricante. Los datos fueron analizados mediante el software RQ Manager versión 1.2 y DataAssist ™ Software versión 2.0 (Applied Biosystems). Después de la normalización utilizando los pinchos-en ath-miR-159a, el pliegue del cambio de los niveles de miRNA en GC en comparación con el control fue calculado por el método.

Mirna cuantificación por tiempo real QRT-PCR

la transcripción inversa se realizó usando el kit TaqMan miARN transcripción inversa y los cebadores de tallo-bucle-miARN específicos (Applied Biosystems). La mezcla de reacción de 7,5 l consistía en 0,75 l de 10 x tampón de transcripción inversa, 0.095 l de inhibidor de RNasa (20 unidades /l), 0.075 l de dNTP 100 mM con dTTP, 0,5 l de MultiScribe transcriptasa inversa (50 unidades /l), 1,5 l de cebador, 2,5 l de ARN, y 2,08 l de agua libre de RNasa. La transcripción inversa se realizó en un Sistema de PCR profesional T (Biometra, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante.

PCR en tiempo real se realizó por duplicado y se incluye no-plantilla controles negativos. Para la reacción de 20-l, cDNA (3 l) se combinó con 10 l de TaqMan 2 × PCR Universal Master Mix sin uracil-N-glicosilasa, 1 l de la mezcla de ensayo TaqMan miARN, y 6 l de agua. La amplificación se realizó en un sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de expresión de miRNAs se normalizaron a la de pinchos-en cel-miR-39, y se calcularon utilizando el método.

El análisis estadístico

El emparejado t
ensayo se utilizado para examinar la diferencia en la edad media entre los grupos. La prueba de Wilcoxon o la prueba de Mann-Whitney se utilizó para comparar los niveles séricos de miARN diferentes grupos en su caso. Se establecieron curvas ROC para evaluar los efectos de diagnóstico de miRNAs, y se empleó el modelo lineal generalizado con medidas repetidas para analizar las tendencias temporales de los niveles séricos de miARN durante el desarrollo de GC después de la transformación logarítmica. Todos los P
valores fueron de dos caras y menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS 13.0, Chicago, IL).

Resultados

Características de los sujetos

Un total de 82 pacientes con cáncer gástrico, 46 sujetos con DYS, y 128 controles con SG o CAG leve se incluyeron en este estudio. Como se muestra en la Tabla 1, no hubo diferencias significativas en las edades entre los pacientes con GC o DYS y sus controles correspondientes ( P = 0,329
y 0,214, respectivamente).

Mirna perfiles

Los miRNAs expresados ​​diferencialmente se identificaron en mezclas de suero de 14 GC y 14 controles utilizando matriz de baja densidad TaqMan. Entre 377 miRNAs analizadas, 99 mostraron > 2 veces upregulated y 40 mostraron < 0,5 veces downregulated cambios en pool de suero GC (Tabla S1). Dieciséis miRNAs upregulated (miR-221, miR-744, miR-376C, miR-191, miR-27a, let-7e, miR-27b, miR-222, miR-21, miR-18a, miR-19a, miR 17, miR-106b, miR-106a, miR-20a y miR-155), demostrando notables cambios de expresión en el suero de GC y que tiene informes de expresión funcionales o diferenciales en el tejido GC fueron seleccionados como los candidatos para la validación puño etapas [21] - [28]

Primera fase de validación

Las expresiones de 16 miRNAs candidatos se midieron en muestras de suero individuales de 14 GC y controles que se utilizaron para la prueba de matriz.. Consistentemente con los resultados de perfilado, los 16 miRNAs mostraron niveles séricos más altos en el grupo GC que en el grupo control (Figura S1). Entre ellos, 9 miRNAs suero (miR-221, miR-744, miR-376C, miR-191, miR-27a, let-7e, miR-27b, miR-222 y miR-21) tuvieron > 2 veces la media el cambio en el grupo GC en comparación con el grupo control ( P Hotel < 0,05), y por lo tanto se eligieron para su posterior validación

Segunda etapa de validación

Hemos examinado el miARN 9. expresiones de un gran conjunto de suero de 68 pares de GC y de control. Como se muestra en la Figura 2, 8 de los 9 miRNAs (miR-221, miR-744, miR-376C, miR-191, miR-27a, let-7e, miR-27b y miR-222) demostraron niveles significativamente elevados en el grupo GC con más de 2 veces el cambio ( P Hotel < 0,05)., y se seleccionaron estos miRNAs para los siguientes análisis

evaluación del riesgo de casos de GC utilizando un panel de miRNAs

para evaluar el efecto discriminador de miRNAs en suero en GC, se establecieron curvas ROC para cada uno de los 8 miRNAs utilizando 68 pares de GC y el control en la validación de la segunda etapa (Figura 3). Los resultados revelaron que el miR-744, miR-376C, miR-221 y let-7e producido las mayores áreas bajo las curvas ROC (AUCs) y podría tener el potencial como biomarcadores para la detección de GC.

La evaluación del riesgo basada en los cuatro miRNAs fue utilizado para distinguir muestras de suero de casos de GC de los controles. Para cada uno de los genes miARN, que en primer lugar se calculó el valor de corte óptimo del nivel relativo de expresión (miR-744: 5.49 × 10 ^{-4; miR-376C: 6,05 × 10 -4; miR-221: 1,47 x 10 -3; let-7e: 1,61 × 10 -3), en la que el índice de Youden (sensibilidad especificidad +-1) para el diagnóstico de GC fue mayor en la curva ROC. A continuación, hemos dividido el tema en un grupo de alto riesgo, que representa el posible caso GC, cuando el nivel sérico de cualquiera de los cuatro miRNAs fue igual o mayor que el valor de corte correspondiente, y un grupo de bajo riesgo, lo que representa el control , cuando los niveles en suero de todos los cuatro miRNAs fueron menores que los valores de corte.}

de acuerdo con este criterio de evaluación, los GC 56 y 32 controles se predijo correctamente como casos de CG y no GC, la producción de la sensibilidad del 82,4% y la especificidad del 47,1%. Desde let-7e demostró el valor más pequeño e intervalo de confianza más amplio de las AUC entre los cuatro miRNAs en el análisis de la curva ROC (Figura 3), se repitió esta evaluación de riesgos después de excluir let-7e y obtuvimos una mayor especificidad (40/68, 58,8 %), mientras que la sensibilidad se mantuvo sin cambios, lo que indica que la contribución de let-7e a la diferenciación de los GC de los controles fue insignificante, y el panel de tres miARN (miR-221, miR-376C y miR-744) era una combinación más eficiente de los biomarcadores para el diagnóstico de GC.

para examinar aún más el potencial de este panel para la detección temprana de GC, se evaluó un subgrupo de 30 pacientes GC en etapa temprana, y 22 se predijo correctamente como casos de CG con la sensibilidad de 73,3% .

Asociación entre miARN suero de expresión y diferenciación de calidades GC

Por otra parte, hemos tratado de investigar la correlación entre los niveles de expresión de miR-221, miR-744 y miR-376C, y grados de diferenciación de GC. Como se muestra en la Figura 4A-C, todos los tres miRNAs mostraron mayores niveles en suero en el grupo GC pobremente diferenciado (43 GCs incluyendo 29 hombres y 14 mujeres; edad, 60 (SD 8,3) años) que el grupo GC en bien o moderadamente diferenciado (24 GC incluyendo 19 machos y 5 hembras, edad, 60 años (SD 6,2) años). Entre ellos, el suero de miR-221 y miR-376C demostraron una correlación significativa positiva con pobre diferenciación de GC ( P = 0,006
y 0,004, respectivamente).

Los niveles de expresión de biomarcadores séricos en sujetos miARN DYS con

Para aclarar aún más la relevancia de estos tres miRNAs con lesión gástrica premaligna, se analizó la expresión de los 46 pares de DYS y control. Como se muestra en la Figura 4D-F, un nivel significativamente elevado de miR-221 se encontró en el grupo DYS en comparación con los controles ( P = 0,027
), mientras que no se encontraron diferencias significativas para el miR-376C o miR 744. Un análisis más detallado de evaluación del riesgo con arreglo a procedimientos establecidos reveló que este panel de tres miARN podría distinguir DYS de control con la sensibilidad de 56,5% y la especificidad del 47,8%.

Los cambios dinámicos de biomarcadores miARN suero durante el desarrollo GC

en el estudio retrospectivo, se detectaron los cambios dinámicos de los tres biomarcadores miARN suero en 58 pacientes con cáncer gástrico que fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo con el intervalo de tiempo desde la extracción de sangre para el diagnóstico de GC: pre-diagnóstico 2-5 años , 6-9 años, grupos de 10-14 años y ≥15 años (Tabla 2). Algunos sujetos pueden existir simultáneamente en dos o más de dos grupos, ya que proporcionaron muestras de suero en varios puntos de tiempo del periodo de seguimiento.

Como se muestra en la Figura 5A, los tres miRNAs suero visualizan claramente el aumento de expresión durante GC desarrollo, excepto ligero aumento de suero de miR-744 en el pre-diagnóstico grupo ≥15 años. Además la prueba de tendencia mostró una tendencia lineal estadísticamente significativa en los tres niveles de miARN entre 20 pacientes con cáncer gástrico que contribuyeron con tres muestras de suero en diferentes momentos durante el período de seguimiento (Figura 5B).

Por último, se evaluó el potencial de biomarcadores miARN para la predicción temprana de GC en 29 pacientes, que habían proporcionado muestras de suero a los 2-5 años antes del diagnóstico de GC. De acuerdo con el criterio de evaluación de riesgo establecido antes, el 23 de los 29 pacientes GC (79,3%) fueron clasificados correctamente como los casos de CG que representa este panel de suero de tres miARN.

Discusión

El objetivo de este estudio fue identificar miRNAs diferenciales en el suero de GC y DYS, e investigar el potencial de miRNAs en suero como biomarcador para la detección precoz de la GC. Encontramos los niveles significativamente elevados de suero de miR-221, miR-376C y miR-744 en pacientes con cáncer gástrico mediante el cribado basado en microarrays sistemática y validación de dos etapas. Este panel de tres miARN suero podía distinguir los GC de los controles y mostró una tendencia creciente durante el desarrollo GC. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio poblacional en la exploración de los cambios dinámicos de miRNAs en suero asociados con GC y sus precursores en una zona de alto riesgo de CG.

La incidencia de CG varía ampliamente en todo el mundo con las tasas más altas se producen en el este de Asia, incluyendo Japón, Corea y china [1], [2]. En China, la mayoría de los GC son diagnosticados en etapas avanzadas que se traducen en un mal pronóstico con una tasa de supervivencia a 5 años promedio < 30%, mientras que en Japón y Corea del más del 60% de los GC son diagnosticados en una etapa temprana de detección endoscópica basada en la comunidad con tasa de supervivencia a 5 años > 80% [29], [30]. Aunque el impacto de la detección temprana de GC mediante el cribado endoscópico es significativo en Linqu, ha habido sólo unos pocos cribado poblacional para GC en China debido al alto costo y la falta de endoscopista experto.

GC es un fin consecuencia de las lesiones gástricas múltiples etapas con diferentes características biológicas, lo que proporciona una oportunidad para detectar GC en etapa temprana mediante el uso de biomarcadores. En nuestro estudio anterior, encontramos la relación de suero PG I /II decliné monótonamente con la gravedad de las lesiones gástricas, sin embargo, la sensibilidad y especificidad para predecir lesiones gástricas avanzada y GC eran pobres [31]. Recientemente, evidencia acumulada indicó que miRNAs juegan papeles importantes en la oncogénesis, y miRNAs derivados del tumor puede entrar en la circulación en una forma notablemente estable [11], [32], [33], lo que sugiere que miRNAs podrían ser utilizados como novela no invasiva biomarcadores para la detección precoz de la GC.

Más recientemente, un estudio identificó cuatro miRNAs upregulated GC-asociado (miR-17-5p, miR-21, miR-106a y miR-106b) [34], que también se muestra mayores niveles de expresión en el suero GC en nuestra matriz, mientras que la regulación a la baja notable de let-7a en su estudio no fue observado por nosotros. Otro estudio encontró cinco miRNAs séricos elevados (MIR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34 y miR-423-5p) en pacientes con cáncer gástrico [13], mientras que sólo el miR-20a y miR-27a se upregulated en nuestra matriz, y miR-27a se validó que se sobreexpresa notablemente en pacientes con cáncer gástrico. Los resultados parcialmente contradictorios pueden reflejar las diferencias en los tipos de muestras, herramientas o métodos de cuantificación [35] cribado.

Entre los tres miRNAs suero identificados en nuestro estudio, el miR-221 se ha encontrado anormalmente regulada al alza en los tejidos de cáncer de muchos tipos, tales como gástrico [24], de colon [21], de próstata [36] y el cáncer de mama [37]. MiR-221 podría post-transcripcional de p27 y p57 suprimir, facilitando así la transición de fase G1 /S y el aumento de la proliferación celular y el crecimiento del tumor [24], [36], [38], [39]. Los estudios han demostrado que el nivel de expresión de miR-221 en plasma se asoció con la supervivencia global del cáncer colorrectal [40] y la progresión del cáncer de próstata [41]. Sólo unos pocos estudios han explorado la relevancia funcional de miR-376C, como miR-376C podría aumentar la proliferación, la supervivencia y la quimio-resistencia de las células de cáncer de ovario por la orientación ALK7 [42]. Para el miR-744, su patrón de expresión, la función fisiológica y la relación con la carcinogénesis no se conocen en la actualidad.

En nuestro estudio, encontramos este panel de tres miARN podría distinguir muestras de suero de la GC de los controles con una sensibilidad de 82,4% y una especificidad de 58,8%. Además, nuestro estudio indica que entre 30 pacientes con cáncer gástrico en etapa temprana, 22 (73,3%) fueron clasificados correctamente, lo que sugiere este panel podría servir como un biomarcador para la detección precoz de la GC. Además, se plantea la posibilidad de que este panel de miRNAs puede ser útil como un método de control previo de la GC en la población general con alto riesgo de GC.

También estábamos interesados ​​en explorar las asociaciones entre estos tres miRNAs en suero y la diferenciación grados de GC. Mediante la comparación de los niveles de miRNA en el suero de pacientes con diversos grados de GC, hemos encontrado una expresión de miARN sérica mayor en GC pobremente diferenciado. Este resultado reveló que la expresión de alto nivel de estos miRNAs en suero en pacientes de GC estaba asociada con la etapa avanzada de GC. Aunque el mecanismo de este fenómeno no está clara, el alto nivel de estos miRNAs en el suero puede tener algún valor para indicar la progresión de la selección y el tratamiento de GC.

Se evaluó además si este panel de tres miARN podría predecir gástrico avanzado lesiones, tales como DYS. Sólo se encontró el miR-221 muestra un nivel de expresión elevado en DYS, lo que sugiere este panel fue más específico para GC. A pesar del efecto limitado de este panel en la detección de DYS, miR-221, uno de los tres miRNAs suero, puede ser útil para identificar a aquellos sujetos DYS por el altísimo riesgo de desarrollar CG. Curiosamente, mediante el seguimiento de forma prospectiva la evolución de estos DYS temas, encontramos la menor tasa de regresión de las lesiones menos graves y GC un incidente en el grupo de alto riesgo predicho que tenía un mayor nivel de suero de miR-221 (datos no mostrados).

al examinar retrospectivamente la expresión de miRNAs tres muestras de suero de pre-diagnóstico de pacientes con cáncer gástrico, hemos observado una tendencia creciente durante el desarrollo de GC, y su posterior análisis indicó que este grupo podría predecir GC hasta 5 años por delante de clínica GC diagnóstico. Estos resultados apoyan fuertemente el valor de estos tres miRNAs para predecir la ocurrencia de GC. La combinación de este suero de tres miARN de la firma con el diagnóstico patológico puede mejorar la detección precoz de la GC en sujetos con lesiones gástricas avanzadas, como la mensajería instantánea y DYS.

Para descartar la posibilidad de que el aumento de la edad y el más corto período de almacenamiento de las muestras de suero contribuido a un mayor nivel de miRNAs en el tiempo, analizamos la expresión de los genes miARN en 82 controles que se sometieron a la extracción de sangre en los mismos puntos de tiempo con los pacientes GC. No se observó ninguna diferencia significativa durante el período de seguimiento (datos no mostrados), lo que sugiere que el aumento de los niveles séricos de miARN lo largo del desarrollo de GC no pueden atribuirse a un aumento de la edad y el apoyo que los miRNAs estaban presentes en el suero en una forma estable. En consecuencia, los miRNAs circulantes pueden ser utilizados como un biomarcador para desarrollar una prueba no invasiva para la detección de GC en el futuro debido a su fácil accesibilidad, alta estabilidad y el coste de ensayo bajo.

Nuestro estudio tiene varios puntos fuertes. En primer lugar, todos los sujetos procedían de una población de alto riesgo de GC y se sometieron a diagnóstico patológico riguroso, lo que justifica nuestra hipótesis de que la diferencia observada en los niveles séricos de miARN entre los GC y los controles podría ser atribuida principalmente, si no la totalidad, de la transformación neoplásica. En segundo lugar, nuestro estudio basado en la población con un alto cumplimiento y más de 20 años de seguimiento mejorado la fiabilidad del estudio, y proporcionó la primera evidencia en los cambios dinámicos de miRNAs en suero durante el desarrollo GC, así como su potencial como biomarcadores para identificar individuos de alto riesgo de GC.

Este estudio también tiene algunas limitaciones. Debido a que muy pocos sujetos fueron diagnosticados con mucosa gástrica normal en esta población [17], hemos utilizado los sujetos con SG /CAG leves como controles. Sin embargo, en comparación con los estudios que utilizan los sujetos normales generalmente como control, nuestra estrategia de selección patológica de control basado en el diagnóstico diluyó la disparidad entre los casos y controles, y por tanto, sólo podría causar la subestimación de los resultados. Además, los resultados de este estudio preliminar con el tamaño pequeño de la muestra requieren una confirmación adicional en grandes estudios prospectivos y la relevancia funcional de la miRNAs recientemente identificado necesita ser clarificado aún más.

En conclusión, este estudio poblacional hemos identificado un conjunto de miRNAs suero diferenciales (miR-221, miR-376C y miR-744) en el GC y propusieron su potencial como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección precoz de la GC.

Apoyo a la Información
Figura S1. niveles
de suero de los 16 miRNAs seleccionados en 14 pares de sujetos GC y de control en la validación de la primera etapa. La mediana de pliegue se dieron cambios en los niveles de miARN que comparan GC con el control y se realizaron las pruebas de Wilcoxon para examinar la diferencia entre dos grupos. Los niveles relativos de miRNAs (escala log10 en el eje Y) se normalizaron a la clavó en cel-miR-39
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033608.s001 gratis (JPG) sobre Table S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0033608.s002 gratis (XLS)

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