Extracto
Antecedentes
Para mejorar el pronóstico de los pacientes que sufren de cáncer gástrico, una se requiere una mejor comprensión de los acontecimientos genéticos y epigenéticos subyacentes en este tipo de cáncer. A pesar de que la isla CpG methylator fenotipo (CIMP) y la inestabilidad de microsatélites (MSI) han demostrado que desempeñan un papel fundamental en la patogénesis del cáncer gástrico, se desconoce la importancia clínica de estos eventos en los resultados de supervivencia en pacientes con cáncer gástrico.
Este estudio incluyó una cohorte de pacientes con cáncer gástrico patológicamente confirmado que tenían resecciones quirúrgicas. Se analizó una cohorte de 68 cánceres gástricos. CIMP y MSI estados se determinaron mediante el análisis de promotor CpG estado de metilación de la isla 28 genes /loci, y la inestabilidad genómica en 10 marcadores de microsatélites, respectivamente. modelo de riesgos proporcionales de Cox se realizó un análisis multivariado para incluyendo la edad, el estadio, la diferenciación del tumor, KRAS resultados en el análisis multivariante, ya OS se correlacionó significativamente con una menor estadio patológico ( P = 0,0088 CIMP y o MLH1 Visto:. Shigeyasu K, Nagasaka T, Mori Y, Yokomichi N, Kawai T, Fuji T, et al. (2015) Importancia clínica de MLH1 metilación y CpG Island methylator fenotipo como marcadores de pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (6): e0130409. doi: 10.1371 /journal.pone.0130409 Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos | Recibido: 18 de febrero, 2015; Aceptado: 20-may de 2015; Publicado: 29 Junio 2015 Derechos de Autor © 2015 Shigeyasu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas KAKENHI 19390351 y 20590572 a TN, y por subvenciones R01 CA72851 y 181 572 del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud, y los fondos del Instituto de Investigación de Baylor AG Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia Introducción el cáncer gástrico es la segunda causa principal de cáncer. muertes relacionados con la PI, con cerca de 700.000 muertes al año en todo el mundo confirmados, aunque la incidencia ha disminuido gradualmente [1-3]. El cáncer gástrico es generalmente diagnosticado en una etapa avanzada, que es la principal causa de su mal pronóstico [4]. Para mejorar los resultados del cáncer gástrico, se requiere la identificación de los eventos genéticos o epigenéticos en la progresión del cáncer gástrico. El evento epigenético más importante en la progresión del cáncer es la metilación del promotor de regiones CpG de genes clave supresores de tumores. islas CpG son largas secuencias de casi 1-kb de ADN con alto contenido de guanina-citosina en las regiones promotoras de los genes [5]. En contraste con las células normales, las islas CpG dentro de los genes supresores de tumores en las células cancerosas a menudo se hypermethylated, dando lugar a un fenotipo de la isla CpG methylator (CIMP) [6,7]. silenciamiento epigenético de genes relacionados con el tumor debido a la isla CpG metilación se ha informado recientemente en el cáncer gástrico. Aberrante de la isla CpG metilación de > 100 genes reguladores del crecimiento en el cáncer gástrico hasta ahora ha sido reportado [8-24], sin embargo, la importancia clínica de CIMP en el cáncer gástrico permanece sin explorar y mal entendido A diferencia. , reparación de apareamientos erróneos (MMR), la deficiencia en el cáncer gástrico es también un evento genético importante. La inestabilidad genómica en el número de repeticiones de microsatélites (o microsatélites) se denomina inestabilidad de microsatélites (MSI). MSI es una característica causada por un sistema de ADN MMR defectuoso. inactivación funcional de genes MMR, como MLH1 A la vista de esta brecha en el conocimiento, en este estudio, hemos explorado la importancia de la deficiencia de CIMP y MMR en el cáncer gástrico y se determinó su contribución como pronóstica marcadores en pacientes con cáncer gástrico. Materiales y Métodos Las muestras de tejido Este estudio incluyó una cohorte de pacientes con cáncer gástrico patológicamente confirmado que se habían sometido a resección quirúrgica en la Universidad de Okayama hospitalaria (Okayama, Japón) a partir de 1998-2004. Se analizaron un total de 68 tejidos de cáncer gástrico y sus mucosa gástrica normal emparejados. Todos los tejidos mucosa gástrica normal se obtuvieron de los sitios adyacentes a, pero al menos 5 cm de distancia de, el tumor original. Todos los pacientes proporcionados por escrito el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital de la Universidad de Okayama. Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para el uso de sus datos para futuros análisis. Todos los cánceres gástricos y la mucosa gástrica normal eran muestras de tejido fresco congelado, de la que se extrajo el ADN utilizando un kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN). MSI se llevó a cabo mediante el examen de 2 repeticiones de mononucleótidos (BAT25 y BAT26), se repite 12 dinucleótidos (D17S250, D18S35, D18S58, D18S69, D2S123, D4S1559, D4S2381, D4S470, D5S107, D5S346 y D8S87, TP53), y uno repite tetranucleotide, MYCL, como se describe anteriormente [ ,,,0],31]. Los tumores que muestran los cambios en ≥5 alélicas de 15 marcadores fueron clasificados como MSI-H (denominado en adelante como "MSI"), y el resto se clasificaron como microsatélites estables (MSS). Debido a la hipermetilación frecuente de varios genes es uno de los rasgos característicos de los tumores con CIMP, se investigó el estado de metilación de CpG promotor de 28 loci relacionados con la isla-( APC Se llevó a cabo la secuenciación directa para identificar KRAS software JMP (versión 10.0, SAS Institute Inc .) se utilizó para llevar a cabo el análisis estadístico. Se utilizó la prueba t de Student para comparar variables continuas, y se utilizó la prueba exacta de Fisher para analizar las variables categóricas. La supervivencia global (OS) se midió desde la fecha de la operación a la fecha de la muerte. Las estadísticas método de Kaplan-Meier y log-rank para las diferencias entre los diversos factores pronósticos fueron utilizados para estimar las distribuciones del sistema operativo. modelos de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para calcular el índice de riesgo (HR) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% (IC). Se realizó un análisis de regresión logística univariante o multivariante para determinar las diferencias en la HR entre cada grupo. Todos los reportados valores de P ¿Cuáles son las dos caras, y P Hotel < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Estudio de la población En este estudio, se investigó a 68 pacientes con cáncer gástrico. En los CpG promotoras de la se determinó MLH1 28 loci CpG incluyendo APC los resultados de supervivencia en los pacientes en base a MLH1 3 ' la superposición relación entre CIMP y se analizó el estado de metilación de MLH1 3 ' del mismo modo, las tasas de supervivencia a los 5 años fueron analizadas para determinar los grupos CIMP-alta y CIMP-bajo, y la tasa fue ligeramente mayor en el grupo CIMP-alta que en el grupo CIMP-bajo, pero la diferencia no fue significativa ( log-rank P = 0,0688 Contribución de la deficiencia de reparación de genes y el estado de CIMP tasa de supervivencia Las tasas de supervivencia a 5 años se analizaron y se compararon entre estos grupos; CIMP-alta / MLH1 3 ' relación entre el MLH1 metilación La relación de solapamiento entre los MLH1 5 ' El análisis multivariado de predictores de resultado de supervivencia Un modelo de riesgos proporcionales de Cox, incluyendo la edad, el estadio, la diferenciación, KRAS Discusión metilación del ADN en las células del cáncer se ha convertido en un tema de intensa investigación. La inactivación de genes supresores de tumores por CpG de metilación de regiones promotoras acelera la carcinogénesis debido a la regulación del ciclo celular aberrante y la proliferación [15]. Algunos candidato aberrante se ha informado de genes metilados en el cáncer gástrico. RASSF1A concurrente metilación CpG en múltiples genes se ha definido como CIMP en el cáncer colorrectal (CRC) y el cáncer gástrico [15,40,53- 57], y ha sido demostrado que se correlaciona con la hipermetilación de los genes supresores de tumores. Sin embargo, la evidencia de CIMP en el cáncer gástrico no es tan convincente como es el caso de CCR [58,59]. En el cáncer gástrico, CIMP-alta se ha descrito en el 41% [40] y 31% [54] tumores. Los pacientes con cáncer gástrico CIMP-alta tienen una supervivencia significativamente más corta que las personas con cáncer gástrico CIMP-bajo [54,60]. Otro informe mostró que CIMP se asoció con una mejor supervivencia en el cáncer gástrico [54]. El metaanálisis reciente se ha centrado en la fuerte relación de CIMP con H. pylori, EBV, y MSI, pero CIMP no podía mostrar un potencial pronóstico para el cáncer gástrico [61]. Por el contrario, la inestabilidad en el microsatélites se repite dentro de varios genes reguladores del crecimiento se define como MSI. Un panel estándar, tal como el panel de NCI, se recomienda, incluyendo mononucleótido (BAT26 y BAT25) y dinucleótido (D2S123, D5S346, D17S250 y) repite [62]. Tres niveles de MSI se pueden identificar: alto nivel de MSI (MSI-H), de bajo nivel de MSI (MSI-L), y el SMS. El fenotipo de MSI-H en el cáncer gástrico se informó a representar el 5% -50% MSI tumores positivos [17]. MSI es una característica causada por un sistema de ADN MMR defectuoso. inactivación funcional de genes MMR, como MLH1 Como se describió anteriormente, y el estado CIMP MMR-deficiencia son las características clave de cáncer gástrico y pueden reflejar diferencias en la supervivencia en los pacientes que sufren de esta malignidad. correlación significativa entre CIMP y MSI se ha informado en GC [61]. Sin embargo, los datos relativos a los efectos sinérgicos de estos parámetros son escasos, y se requiere un análisis multivariado de estos parámetros genéticos y epigenéticos. En nuestro estudio, CACNA1G Sin embargo, la deficiencia de MMR CIMP y son dependientes entre sí. MSI-asociados surgen CRC esporádicos a través de un proceso que implica CIMP [66,71]; Por lo tanto, se debe realizar un análisis estadístico integrado de la deficiencia de CIMP y MMR. Por ejemplo, en los adenocarcinomas duodenal, CIMP / MLH1 En conclusión, nuestros datos sugieren que la estratificación de los pacientes con CIMP en base a MLH1
estado de la mutación, y combinado CIMP / MLH1
estado de metilación en relación con la supervivencia global (SG).
), mejor diferenciación tumoral ( P =
0,0267) y CIMP-alta y estado metilado MLH1 3 'gratis ( P = 0,0312
). La estratificación de la condición n CIMP con respecto a MLH1
estado de metilación aún más la predicción permitido de pronóstico del cáncer gástrico.
Conclusiones
estado /metilación puede tener un potencial para ser biomarcadores de pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico
o MSH2
, por la metilación del promotor es responsable del fenotipo MSI-alta (MSI-H) en el cáncer gástrico. En un estudio previo, el cáncer gástrico con MSI-H mostró una mayor frecuencia de localización antral, subtipo intestinal, menor incidencia de metástasis en los ganglios linfáticos, y la mejora de la supervivencia, en comparación con los microsatélites estables (MSS) o MSI-L cáncer gástrico [17,25 -30]. Sin embargo, se desconoce la importancia clínica de la deficiencia de MMR en el cáncer gástrico.
MSI análisis
análisis
sodio bisulfito de modificación y análisis CIMP
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Mp región
, MGMT-Eh región
, MINT1
, MINT2
, MINT31
,
MLH1 5 ', MLH1 3 '
, p14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-región1
, RASSF2A-región2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2-región1
, SFRP2- región2
, UNC5C
, 3OST2
, FOXL2
), y las secuencias de los cebadores correspondientes se enumeran en la Tabla S1. El ADN genómico fue modificada-bisulfito para convertir todos los residuos de citosina no metiladas a uracilos. En resumen, 0,5-2,0 g de ADN se desnaturalizaron en NaOH, se trató con bisulfito de sodio, y se purificó utilizando el sistema de limpieza de ADN Wizard (Promega). El estado de metilación de cada locus relacionados con CIMP se evaluó mediante análisis de restricción combinado con bisulfito (COBRA). reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para COBRA se realizó en un ADN molde con bisulfito modificado en una mezcla de PCR de 25 l que contiene 12,5 l de kit HotStarTaq Mix Master (Qiagen), 0,5 mol /L de cada cebador de PCR, y aproximadamente 25 ng de bisulfite modificados de ADN. Los productos de PCR fueron digeridos mediante la adición de la enzima de restricción a 37 ° C durante 12 h. El ADN digerido se separó en geles de agarosa al 3% en 1 x tampón de Tris-acetato-EDTA y se tiñó con bromuro de etidio. ADN colónica normal humano tratado con SssI metilasa (New England Biolabs) se utilizó como control positivo para los alelos metilados, y se utilizó el ADN de los linfocitos normales como control para los alelos metilados. Se usó agua como control negativo de PCR para controlar la contaminación de la PCR. CIMP-alta se definió como no menos de 10 de la metilación de estos loci.
análisis KRAS mutación
exón 2 (codón 12/13) mutaciones. PCR para KRAS
gen se llevó a cabo en una mezcla de PCR que contiene 25-l 12,5 kit l de Mix Master HotStarTaq con cebadores. El kit de purificación QIAquick PCR se utiliza para purificar los productos de PCR, y ellos fueron secuenciados directamente en un ABI 310 secuenciador de ADN [32].
Los análisis estadísticos
Resultados
gen, la propagación de metilación de CpG dentro de su región 3 'a ser un crítico para MLH1 expresión [33]. Una descripción de la cohorte de pacientes y varias características clínico basado en el sexo, la edad, el estadio, la diferenciación del tumor, estado de MSI, KRAS
mutación, y metilación MLH1 3 '
se muestra en la Tabla 1. estos estados se compararon entre los grupos CIMP-alta y CIMP-bajo. De estos parámetros, el estado de MSI y MLH1 3 '
estado de metilación mostraron notables diferencias entre los 2 grupos (tabla 1).
El estado de metilación
, CACNA1G
, CHFR
, COX2
, DAPK
, DCC
, HPP1
, MGMT-Mp región
, MGMT-Eh región
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, '
, MLH1 3' MLH1 5
, p14
, p16
, RASSF1A
, RASSF2A-región1
, RASSF2A-región2
, RASSF3
, RASSF5
, RASSF6
, RUNX3
, SFRP2 -region1
, SFRP2-región2
, UNC5C
, 3OST2
y FOXL2
fueron analizados para determinar el estado de cada CIMP cáncer gástrico . espectro de metilación de estos loci se muestra en la baldosa del mapa (Fig 1a). En estos loci, CACNA1G
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, '
, MLH1 3' MLH1 5
, p16
, RASSF2A-región1
, RASSF2A-región2
, RUNX3
, SFRP2-región2
, UNC5C
, 3OST2
, y FOXL2
metilado fueron significativamente en el grupo CIMP-alta (Tabla 2).
metilación y el estado CIMP en los cánceres gástricos
. 10 pacientes estaban en el CIMP-alta / MLH1 3 '
metilado, 1 paciente se encontraba en el CIMP-bajo / MLH1 3'
metilado, 20 pacientes estaban en el CIMP alta / MLH1 3 '
no metilado y 37 pacientes estaban en el CIMP-bajo / MLH1 3'
grupos no metilados (figura 1b). Kaplan-Meier de supervivencia se generaron de acuerdo con el estado de metilación
MLH1 3 '. Las tasas de supervivencia a los 5 años se determinaron para los grupos metilados y no metilados MLH1 3 '
. Las tasas de supervivencia a 5 años fueron significativamente mayores en el MLH1 3 '
grupo metilado en comparación con el grupo no metilado. (Log-rank P = 0,0257
; 1c figura)
; Fig. 1d)
metilado, CIMP-bajo / MLH1 3'
metilado, CIMP alta / MLH1 3 '
no metilado y CIMP-bajo / grupos no metilados MLH1 3 '
. Hemos observado que las tasas de supervivencia global fue mayor en el combinado CIMP-alta / MLH1 3 '
grupo metilado, en comparación con los otros grupos en los que las diferencias no fueron estadísticamente significativas (log-rank P
= 0,0706; Fig. 1e)
y MSI
metilación y se analizó 3 '
estado de metilación. 10 pacientes fueron clasificados como MLH1 5
metilado / 3 '
metilado, 8 pacientes como MLH1 5
metilado / 3' no
metilado, 1 paciente como MLH1 5 '
no metilado / 3'
metilados, y 49 pacientes como 5 '
no metilado / 3'
no metilado (figura 2a). En el grupo metilado MLH1 3 '
, más de 80% de los pacientes mostraron MSI. Por el contrario, en el grupo no metilado MLH1 3 '
, casi todos los casos mostraron SMS (figura 2b). las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se generaron de acuerdo con estado de metilación
MLH1 5 '. Las tasas de supervivencia a 5 años se analizaron para los MLH1 5 '
grupos metilados y no metilados, y la tasa fue ligeramente superior en el MLH1 5'
grupo metilado que en la no grupo metilado pero las diferencias no fueron significativas (log-rank P = 0,1009
; la figura 2c). Kaplan-Meier de supervivencia se generaron de acuerdo con el estado de MSI. Las tasas de supervivencia a 5 años se analizaron para determinar los grupos de MSI y SMS, y la tasa fue ligeramente mayor en el grupo de MSI que en el grupo MSS pero las diferencias no fueron significativas (log-rank P = 0,1316
; la figura 2d).
estado de la mutación, y CIMP / estado de metilación
MLH1 3 'en relación con el sistema operativo se utilizó para realizar el análisis multivariante (tabla 3). Sólo fase ( P = 0,0088
), la diferenciación ( P = 0,0267
), y CIMP / MLH1
estado de metilación ( P = 0,0312
) fueron predictores estadísticamente significativos de la OS. índice de riesgo fue significativamente menor en el CIMP-alta / grupo metilado MLH1 3 '
.
, p14ARF
, y MGMT
[34-38]; CHRNA3
, DOK1
, y GNMT
[39]; p16
, hMLH1
, MINT1
, MINT2
, MINT12
, MINT25
, y MINT31
[40]; APC
, CDH1
, MHL1
, CDKN2A
, CDKN2B
, y RUNX3
[17 ]; CDH1
[41]; DKK3
[42]; PTEN
[43]; MGMT
[44]; TFPI2
[22]; CACNA2D3
[45]; PCDH10
[46]; Sox2
[47]; MAL
[48]; y fueron reportados previamente COX2
[49] que se hypermethylated en el cáncer gástrico. La metilación de p16
promotor islas CpG es un marcador de potencial maligno de la displasia en el estómago [50]. La metilación de MGMT
se asocia con la etapa avanzada y mal pronóstico [44]. la metilación del ADN aberrante en estos genes puede promover el desarrollo de cáncer gástrico. Sin embargo, los objetivos de genes precisas de la hipermetilación de la carcinogénesis siguen siendo desconocidos [51,52].
o MSH2
, por mutacional inactivación y la metilación del promotor es responsable del fenotipo MSI-H en el cáncer gástrico. En particular, similar a CRC, la metilación de MLH1
está asociado con el MSI-H fenotipo [15,40,63,64] porque MLH1
metilación precede a la pérdida de expresión de la proteína. Leite M et al. informaron que se observó MLH1
promotor hipermetilación en el 78,7% (70/89) de los casos analizados MSI [65]. La metilación de la región 3 'del se requiere MLH1
promotor, que está cerca de su sitio de inicio de transcripción (TSS), para el silenciamiento de genes. El extremo 5 'del promotor también es propensa a la metilación, pero esto no es funcionalmente importante a menos que la metilación se extiende a la crítica región 3' [66,67]. estado de MSI es responsable de la mutación de los genes que regulan el ciclo celular y la señalización de apoptosis, incluyendo TGFβRII
, IGFIIR
, TCF4
, RIZ
, BAX
, CASPASE5
, FAS
, BCL10
, y APAF1
[17,25] y los genes de mantenimiento de la integridad genómica , incluyendo MSH6
, MSH3
, MED1
, RAD50
, BLM
, ATR
, y MRE11
[17,68]. Los cánceres gástricos con MSI-H muestran una mayor frecuencia de localización antral, subtipo intestinal, menor incidencia de metástasis en los ganglios linfáticos, y la mejora de la supervivencia relativa a los del cáncer gástrico con MSS o MSI-L [17,25-30].
, CHFR
, DCC
, HPP1
, MINT1
, MINT2
, MINT31
, '
, MLH1 3' MLH1 5
, p16
, RASSF2A-región1
, RASSF2A-región2
, RUNX3
, SFRP2-región2
, UNC5C
, 3OST2
, y FOXL2
fueron significativamente metilado en el CIMP-alta grupo. En particular, se informó de la metilación del promotor de FOXL2
en el cáncer gástrico. FOXL2
es un gen que codifica un factor de transcripción forkhead y es esencial para la función de ovario [69]. FOXL2
regula el ciclo celular mediante la inducción de la detención en G1 y protege a las células del daño oxidativo mediante la promoción de la reparación del ADN oxidado y aumentando la cantidad del agente antioxidante glutatión [69]. FOXL2
suprime la proliferación, invasión y promueve la apoptosis de las células de cáncer cervical [70]. La metilación del promotor de FOXL2
puede tener un papel importante en la tumorigénesis en el cáncer gástrico. Por el contrario, se requería
metilación MLH1 3 'para la deficiencia de MMR y mostró MSI. El '
grupo metilación MLH1 3 tenía una tendencia hacia un buen pronóstico en la estimación de supervivencia de Kaplan-Meier.
estado de metilación mostró un valor pronóstico significativo tanto en OS y el tiempo hasta la recidiva (TTR) en el análisis multivariante [72]. Los pacientes con CIMP-alta / MLH1
tumores -unmethylated tuvieron el peor sistema operativo y TTR [72]. En nuestro análisis multivariante de los pacientes con cáncer gástrico, sólo el / grupo metilado CIMP-alta MLH1 3 '
tenía un buen pronóstico. La razón de buen pronóstico en el CIMP-alta / sigue siendo desconocido grupo metilado MLH1 3 '
. Este fenómeno puede ser debido a la inactivación sinérgica de genes vitales debido a la mutación y la metilación del promotor. A fin de confirmar nuestros hallazgos, se realizó una validación independiente de los resultados de los datos del paciente en envíen a La base de datos del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA). [73-75] CIMP-alta / MLH1
grupo hiper-metilado mostraron más frecuente de metástasis de ganglios linfáticos (p = 0,0009), estadio de la enfermedad avanzada (p = 0,0078; S1 de archivos), y ligeramente mejor supervivencia libre de enfermedad (archivo S2). Por otro lado, el estado de CIMP /MSI no puede mostrar el valor significativo como marcador pronóstico (Tabla S2). Este resultado muestra que MLH1
tiene el papel más importante de los genes MMR en la carcinogénesis de GC. Se requieren nuevas investigaciones para dilucidar la relación entre el estado CIMP y la deficiencia de MMR. Este enfoque dará lugar a una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer gástrico.
estado de metilación puede permitir la predicción del cáncer gástrico pronóstico. El CIMP-alta / grupo metilado MLH1 3 '
tenía buen pronóstico, pero otros grupos puede requerir un tratamiento intensivo para la mejora de la supervivencia, que necesita ser validado en estudios futuros.
Apoyo a la Información
S1 archivo. Relación entre CIMP y MLH1
metilación en pacientes con cáncer gástrico en la base de datos TCGA.
Se investigó el estado de metilación de CpG promotor de 17 loci relacionados con la isla-( APC
, CACNA1G
, CHFR
, DAPK
, DCC
, MGMT
, MENTA