PLoS ONE: MicroRNA-338 hemmt das Wachstum, Invasion und Metastasierung von Magenkrebs durch Targeting NRP1 Expression

Abstrakt

NRP1 als multifunktionale nicht Tyrosinkinase-Rezeptoren eine entscheidende Rolle bei der Tumorprogression spielen. MicroRNAs (miRNAs) sind eine wichtige Klasse von Pervasive Gene, die in einer Vielzahl von biologischen Funktionen beteiligt sind, insbesondere Krebs. Es bleibt unklar, ob miRNAs die Expression von NRP1 regulieren kann. Das Ziel dieser Studie war es, miRNAs zu identifizieren, die das Wachstum, Invasion und Metastasierung von Magenkrebs durch gezielte NRP1 Expression hemmen könnte. Wir fanden, dass miR-338 Expression in Magenkrebs-Zelllinien und bei Magenkrebs Gewebe reduziert wurde. Darüber hinaus fanden wir, dass miR-338 Magenkrebs-Zellmigration inhibiert, Invasion, Proliferation und Apoptose gefördert durch NRP1 Targeting-Ausdruck. Als Upstream-Regulator der NRP1, miR-338 zielt direkt auf NRP1. Die erzwungene Expression von miR-338 inhibiert die Phosphorylierung von ERK1 /2, P38 MAPK und Akt; jedoch die Expression von phosphoryliertem Erk1 /2, P38 MAPK und Akt wurde durch die Überexpression von NRP1 wiederhergestellt. In AGS-Zellen, infiziert mit miR-338 oder mit SiNRP1 transfiziert wurden die Proteinspiegel von Fibronectin, Vimentin, N-Cadherin und Schnecke verringert, aber die Expression von E-Cadherin erhöht wurde. Die Expression von mesenchymalen Marker in miR-338-exprimierenden Zellen wurde durch die Wiederherstellung der NRP1 Expression auf normalem Niveau wiederhergestellt. In-vivo-
, miR-338 auch das Tumorwachstum verringert und unterdrückt D-MVA durch NRP1 Targeting. Daraus schließen wir, dass miR-338 wirkt als ein Gen neuartigen Tumorsuppressor in Magenkrebs. miR-338 kann wandernd, invasive, proliferative und apoptotische Verhaltensweisen zu verringern, sowie Magenkrebs EMT, durch die Expression von NRP1 Abschwächen

Citation:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 hemmt das Wachstum, Invasion und Metastasierung von Magenkrebs durch NRP1 Expression Targeting. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422

Editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Empfangen: 18. Oktober 2013; Akzeptiert: 16. März 2014; Veröffentlicht: 15. April 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde vom Projekt für Wissenschaft und Technology Committee in Shapingba Bezirk von Chongqing (201302) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Neuropiline einschließlich neuropilin1 (NRP1) und neuropilin2 (NRP2) sind multifunktional nicht-Tyrosin-Kinase-Rezeptoren, die zuerst auf ihre kritische Rolle in der Entwicklung des Nervensystems basierend identifiziert [1]. NRP1 und NRP2 haben 44% Homologie und teilen viele strukturelle und biologische Eigenschaften aufweisen. NRP1 besteht vor allem in bloodvesselendothelia und NRP2 ist vor allem in Lymphgefäße [2], [3]. Nachfolgende Untersuchungen identifiziert NRP-1 als ein Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) -A-Isoform VEGF-165 in beiden Endothelzellen und einige Tumorzellen [4], [5]. Die Forschung hat gezeigt, dass NRP1 wird in verschiedenen Tumorarten hochreguliert ist und in verschiedenen Tumorgefäßsystemen exprimiert [3], [6], was darauf hindeutet, dass NRP1 spielt eine kritische Rolle in der Tumorprogression. Frühe Forschung ergab, dass NRP1 das Wachstum von Tumoren als Korezeptor von VEGFR beeinflussen könnten [5]. Wissenschaftler fanden heraus, dass später NRP1 tumorangiogenesis steigern konnte, Tumorwachstum und Kandare Tumor Apoptose ohne VEGFR [7] beschleunigen. NRP1 kann ein Korezeptor anderer Wachstumsfaktoren sein, weshalb VEGF verdeutlicht durch Neuropiline in Abwesenheit von VEGFR-1 oder VEGFR-2-Signal kann [8], [9]. Als Co-Rezeptor von TβRI /TβRII kann NRP1 Tumor Apoptose einzudämmen und das Tumorwachstum über beide kanonische und nicht-kanonische Signalisierung [10] beschleunigen. NRP1, als Co-Rezeptor von PDGFR /CMET kann über P38MAPK steigern tumorangiogenesis und ERK-Signal [11].

Als Upstream- regulatorische Gene von NRP1, die Transkriptionsfaktoren sp1 /3 und AP1 kann die Expression von NRP1 regeln [ ,,,0],12]. Einige Untersuchungen haben gezeigt, dass Butyrat die Expression von neuropilin I in kolorektalen Zelllinien durch die Hemmung der Sp1 Transunterdrückt [13].

MicroRNAs (miRNAs) sind nicht-kodierende RNA-Moleküle, etwa 21-23 Nukleotide lang, dass regulieren die Genexpression in der post-transkriptioneller Ebene [14], [15], [16]. miRNA-Expressionsanalysen Profilierungs haben eine globale Down-Regulation der reifen miRNA Ebenen in primären humanen Tumoren im Vergleich zu normalen Geweben ergab, [17], [18]. So kann miRNAs wirken als Tumorsuppressoren oder Onkogene und dysregulated miRNA-Expression zur Metastasierung von Tumorzellen beitragen könnten. Es bleibt unklar, ob miRNAs die Expression von NRP1 regulieren kann; Daher war es unser Ziel, die Ziel miRNAs von NRP1 zu bestimmen. Weitere Funktionen von NRP1 kann durch das Studium der Ziel miRNAs von NRP1 entdeckt werden.

Materialien und Methoden

Humangewebeproben und Zelllinien

Diese Studie verwendete frische Gewebe, darunter 41 menschlichen Magenkrebsproben und 24 Proben von angrenzenden normalen Schleimhaut von 41 Patienten abgeleitet Gewebe, die Operation auf dem Zweiten Affiliated Hospital der Chongqing Medical University unterzog sich zwischen 2012 und 2013 Diese Studie wurde nach durchgeführt, um die "Biomedizinische Forschung am Menschen Ethikprüfung (Vorläufig) "Verordnung des Ministeriums für Gesundheit und die Deklaration von Helsinki zu den ethischen Grundsätzen für die medizinische Forschung am Menschen. Alle Proben wurden mit der informierten Einwilligung der Patienten erhalten und die Experimente wurden von der Institutional Review Board des Zweiten Affiliated Hospital der Chongqing Medical University genehmigt. Alle Teilnehmer eine schriftliche Zustimmung in dieser Studie teilzunehmen informiert

Die SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 und N87-Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC erhalten;. Manassas, VA , USA), und die GES-1-Zelllinie wurde von der Type Culture Collection der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. Die Zelllinien wurden in RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und bei 37 ° C mit 5% CO2 inkubiert.

Grundierungen, RNA-Isolierung und miRNA Erkennung

die Primer für miR-338-3p und U6 wurden mit dem miScript Primer Assay-Kits (Qiagen Düsseldorf Deutschland) hergestellt. Die Sequenzen der miRNAs in dieser Studie verwendet wurden, waren wie folgt: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG und U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Die Rückwärtsprimer wurden auch in der reversen Transkriptionsschritt verwendet wird. Gesamt miRNA wurde aus kultivierten Zellen und Gewebeproben unter Verwendung von menschlichen RNAiso für kleine RNA (TaKaRa Bio, Otsu, Japan) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Poly-A Schwänze wurden zu miR-338 und U6 mit der miRNA Reaction Buffer Mix (Takara Bio), und dann wurde cDNA von 5 ng Gesamt-RNA synthetisiert unter Verwendung der miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). Real-time PCR wurde in einem CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) mit SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio) durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren 95 ° C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 30 s. Die Daten wurden gegen die U6 snRNA normalisiert. Nach der Amplifikation wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität der Produkte zu bestätigen.

pcDNA Expressionsplasmiden und Plasmid Transfection

Die ORF-Sequenz von NRP1 wurde aus genomischer DNA, isoliert aus dem AGS Zelle amplifizierte Linie und der ORF-Region der NRP1 cDNA dann subkloniert in den GV230 Vektor (GeneChem Corporation Shanghai, China) wurde unter Verwendung von Lipofectamin 2000 in AGS und MKN45 Zellen .Die Plasmid transfiziert (Invitrogen) .Twenty vier Stunden nach der Transfektion die Zellen wurden für eine Rettungs Experiment verwendet. AGS-Zellen, die mit NRP1 stabil transfiziert wurden, wurden ausgewählt unter Verwendung von 2 ug /uL Puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankreich) 48 h nach der Transfektion.

miRNA Gene Klonierung und ektopische Expression

Die Mensch miR-338-Gen wurde mittels PCR-amplifizierte von normalen genomischen DNA und in einen lentiviralen Vektor geklont. Die Lentiviren wurden durch die Co-Transfektion von HEK293T-Zellen mit Plasmiden, eine PGC-LV, pHelper 1.0 und pHelper 2.0 unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) erzeugt. Viren wurden 48 h nach der Transfektion geerntet und die Infektionen wurden in Gegenwart von 2 mg /ml Polybren (GeneChem Corporation) durchgeführt. Steuer miRNA viruses wurde von GeneChem Corporation (Shanghai, China) erworben. AGS-Zellen, die mit miR-338 stabil infiziert waren, wurden ausgewählt, unter Verwendung von 2 ug /uL Puromycin (Invitrogen) 48 Stunden nach der Infektion.

Gene Expression Knockdown durch RNA-Interferenz

NRP1 Ausdruck von AGS wurde Zellen durch Transfektion folgende gezielte siRNA Sequenzen (Sangon Biotech, Shanghai, China) mit Lipofectamin 2000 (Invitrogen) zum Schweigen gebracht;
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (soweit nicht anders angegeben, 3 siRNA # verwendet wurde). Steuer siRNAs (SIC) wurden durch die Einführung von vier Basenaustausche in NRP1 Targeting-Sequenz (GATAGGTCATGACTGCCC) erzeugt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde NRP1 Expression durch Immunoblotting untersucht.

Luciferase Reporter Assay

Ein PsicheckTM-2 Dual-Luziferase miRNA Zielexpressionsvektor für 3'UTR Luciferase-Assays verwendet wurde (Sangon Biotech, Shanghai, China). Die Ziel Onkogen der miRNA-338 wurde auf der Basis des Online-mikroRNA-Zieldatenbank http://www.microrna.org/microrna/home.do ausgewählt. Die Primer-Sequenzen für die Wildtyp-3'UTR waren wie folgt: vorwärts: 5 'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3' und Reverse-5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3 '. Da es zwei Bindungsstellen in der NRP1 3'UTR sind, haben wir zwei Primersequenzen für die Mutante 3'UTR. Für eine Mutante 3'UTR wurden die Primer-Sequenzen die folgenden: vorwärts: 5'-GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'und umgekehrt: 5' GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3 '. Für die andere Mutante 3'UTR wurden die Primer-Sequenzen wie folgt: vorwärts: 5'-GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'und umgekehrt: 5' GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3 '. Für die Luciferase-Assay wurde Lipofectamine 2000 bis cotransfect MKN45 Zellen mit dem hsa-miR-338 und PsicheckTM-2 Dual-Luziferase miRNA Zielexpressionsvektoren mit Wildtyp oder mutierte Zielsequenzen verwendet. Die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 Stunden nach der Transfektion gemessen, und die Ergebnisse wurden gegen Renilla-Luciferase normalisiert. Jedes Reporterplasmid wurde mindestens dreimal transfiziert (an verschiedenen Tagen), und jede Probe wurde dreifach getestet.

Zelllebensfähigkeit und Clonability Assays

Die transfizierten Zellen wurden in 96-Well-Platten bei einer Dichte von 1 × 10 ^{4 Zellen /Vertiefung. Eine MTT-Lösung (20 ul von 5 mg /ml MTT) wurde 4 Hut 37 ° C zu den Kulturen (für ein Gesamtvolumen von 200 ul) zugesetzt und inkubiert. Nach der Entfernung des Kulturmediums wurden die verbleibenden Kristalle in DMSO gelöst und die Extinktion bei 570 nm wurde gemessen. Für die Koloniebildungstest wurden die Zellen bei einer niedrigen Dichte (1000 Zellen /Platte) und erlaubt ausgesät zu wachsen, bis sichtbare Kolonien erschienen. Die Zellen wurden dann mit Giemsa gefärbt und die Kolonien wurden gezählt.}

Migration und Invasion Assays

Für die Transwell-Migrationsassays, 10 x 10 ^{4-Zellen wurden in der oberen Kammer plattiert mit einem nicht-beschichteten Membran (24-Well-Einsatzes; 8 mm Porengröße; BD Biosciences). (; 8 mm Porengröße; BD Biosciences 24-Well-insert) für den Invasionsassays, 2 × 10 5-Zellen wurden in die obere Kammer mit einem Matrigel-beschichtete Membran überzogen. Bei beiden Tests wurden die Zellen in einem serumfreien Medium ausplattiert und ein Medium mit 10% Serum ergänzt wurde als Chemoattraktans in der unteren Kammer verwendet. Die Zellen wurden für 16 h bei 37 ° C und 5% CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator inkubiert. Nach 16 Stunden wurden die nicht migrierten /nicht eindringenden Zellen von den Oberseiten der Transwell Membranfiltereinsätze mit Wattestäbchen entfernt. Die migrierten /eingedrungenen Zellen an den Unterseiten der Einsätze mit Giemsa gefärbt wurden, und die Zellen wurden gezählt.}

Antibodies

Antikörper gegen Fibronektin, Vimentin, N-Cadherin, E-Cadherin, Schnecken- und GAPDH wurden von Santa Cruz Biotechnology (CA, USA) erworben. Phospho-ERK1 /2, Phospho--Akt, und Phospho-P38MAPK wurden aus Abcam (Cambridge, UK) erworben und insgesamt ERK1 /2, Akt und P38MAPK waren von BD Biosciences (USA). D Systems (Minneapolis, MN, USA), und HRP (Meerrettich-Peroxidase) konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-konjugierte HRP-anti-Maus-IgG und Ziegen-IgG von Santa Cruz Biotechnology erworben wurden

Immunoblotting

Gesamtprotein aus den transfizierten Zellen extrahiert RIPA wurde mit Lysepuffer (Beyotime, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nachdem die Ganzzellproteinextrakte wurden quantifiziert den BCA-Protein-Assay unter Verwendung von, wurden durch 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese äquivalente Mengen von Zellysaten gelöst und wurden auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran übertragen, die dann in 5% fettfreier Milch blockiert wurde in TBST für 1 Stunde bei 4 ° C. Die Blots wurden dann mit primärem Antikörper inkubiert. Nach Inkubation mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper wurden die Proteinbanden mit einem verstärkten Chemilumineszenz-Reagens (Millipore, Billerica, MA, USA) sichtbar gemacht. Die folgenden Antikörperverdünnungen wurden verwendet: anti-Fibronektin, 1:200; anti-Vimentin, Anti-E-Cadherin und Anti-N-Cadherin, 1:1200; anti-Schnecken- und anti-GAPDH, 1:500; Anti-phospho-Erk1 /2, anti-phospho-Akt und anti-phospho-P38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-total ERK1 /2, anti-Akt und anti-P38MAPK, 1:500; und HRP-konjugierten IgG, 1:7000.

Xenograft Experimente

Männliche athymische Nacktmäuse 6 bis 8 Wochen alt waren, waren von der Tierversuchszentrum von Chongqing Medical University erhalten und wurden akklimatisiert für 2 Wochen. Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren von Chongqing Medical University durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche von Chongqing Medical University genehmigt. Alle Operationen wurden unter Natriumpentobarbital Anästhesie durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren. Die gleiche Anzahl von AGS-Zellen (10 ^{6) mit Zwangs Expression von miR-338 oder cont-miR, mit oder ohne NRP1 Restaurierung, wurden in 100 &mgr; l PBS suspendiert und subkutan in die rechte hintere Flanke jeder Maus (10 Mäuse injiziert pro Gruppe) wurde .Tumor Wachstum täglich in jeder Gruppe überwacht. Das Tumorvolumen wurde mit der Formel V berechnet = 1/2 a × b2, wobei a die längste Achse Tumor ist, und b ist die kürzeste Tumorachse. Die Mäuse wurden 5 Wochen später getötet und die Tumore wurden in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde in Formol für nachfolgende immunhistochemischen Analyse fixiert, und der andere Teil wurde in flüssigem Stickstoff für Western-Blot oder qRT-PCR erhalten.}

Immunhistochemie

erhaltenen Tumoren in Formalin wurden in Paraffinblöcken platziert und auf positiv geladenen Objektträgern geschnitten. Die Schnitte wurden in Xylol, hydratisiert in abgestufter Alkohol und vorbehandelt für Antigen Retrieval in Citrat-Puffer für 20 min in einem 98 ° C Dämpfer (CD34 und NRP1) entparaffiniert. (; D Systems 1:100 R &) Die Schnitte wurden bei 4 ° C über Nacht mit CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) und NRP1 inkubiert. Immunostaining wurde durchgeführt, die ultra S-P Detection Kit (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, China) mit, und die Farbe wurde mit einem DAB-Kit (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, China) entwickelt .Subsequently, die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Objektträger wurden dann gefärbt mit H &. E-Morphologie beurteilen

Die Quantifizierung von immunhistochemischen Färbeintensität

, um die Tumorgefäßdichte zu bestimmen, fünf zufällig ausgewählten Hell- mikroskopischen Aufnahmen (Vergrößerung 40 ×; Bereich 0,89 mm ^{2) pro Probe erhalten wurden, wie oben beschrieben, und die positiv gefärbt Mikrogefße wurden mit dem Programm ImageJ gezählt. Der rote Kanal, auf CD34-Färbung entspricht, wurde isoliert und digitalisiert in ein binäres Bild, mit schwarzen Anzeige stained Gefäßen und weiß was keine Färbung. Gefäße mit Lumen wurden digital gefüllt und ein Composite-D-MVA wurde quantitativ bestimmt. Mit dem ImageJ Programm, braun gefärbte Bilder spezifisch für DAB-Färbung wurden durch einen Farbentfaltungs Makro extrahiert. Alle Intensitätswerte innerhalb der gleichen Gruppe wurden gemittelt, um die Verhältnisse zwischen den verschiedenen Gruppen zu berechnen.}

Statistical Analysis

SPSS 17.0 Software wurde für die statistische Analyse verwendet. Die Daten werden als Mittel ± Standardabweichung (s.d.) dargestellt. Gruppenvergleiche wurden unter Verwendung des Student-t-Test durchgeführt. Die Unterschiede wurden als signifikant betrachtet bei p <. 0,05

Ergebnisse |

MIR Selection

Um in unserer nachfolgenden Analyse, Proteintargets von NRP1 enthalten sein concordantly von zumindest vorausgesagt hatte werden drei der folgenden vier Vorhersage-Tools: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) und miRDB (mirdb.org/miRDB/). Auf der Basis der Januar 2012-Release-Version, fanden wir 11 microRNAs, die möglicherweise NRP1 gezielt. Wir hatten zuvor mehrere miRNAs abnormal exprimiert in Magenkarzinom mit einem Gen-Chip [19] (Tabelle 1). Basierend auf den beiden oben genannten, sagten wir voraus, einer vorgeschalteten miRNA von NRP1: miR-338

miR-338 herunterreguliert in Magenkrebs Gewebe und Zelllinien

die Rollen von miR zu erkunden. -338 in der menschlichen Entwicklung von Magenkrebs, gemessen wir ihre Expressionsniveaus in 41 menschlichen Magenkrebsproben und 24 angrenzenden normalen Schleimhaut-Proben. Nach einer qRT-PCR-Analyse wurde das Niveau von miR-338 Expression signifikant im Tumorgewebe reduziert im Vergleich zu den angrenzenden normalen Schleimhaut Gewebe (Abb. 1A). Zusätzlich wurde miR-338-Expression in den Magenkrebszelllinien (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 und N87) vermindert im Vergleich mit dem normalen Magenschleimhaut Zelllinie (GES1) (1B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-338 ist nach unten reguliert in Magenkrebszellen, eine Erkenntnis, die relevant für die menschliche Entwicklung von Magenkrebs sein könnte.

miR-338 zielt direkt auf Onkogene NRP1

NRP1 wurde berichtete ein wichtiges Molekül sein, das Magenkrebs Migration und Invasion antreibt. Mit Vorhersage-Tools, sagten wir voraus, dass die Ziel-miRNA von NRP1 war miR-338. Um sicherzustellen, dass miR-338 zielt direkt auf Onkogen NRP1, führten wir Luciferase-Reporter-Assays zu untersuchen, ob miR-338 direkt mit den Ziel onkogenen NRP1 in Wechselwirkung tritt. Wir identifizierten zwei mögliche Bindungsstellen für miR-338 in der 3'UTR der NRP1 mRNA. Um festzustellen, ob NRP1 von miR-338 durch direkte reguliert Bindung an den 3'UTR von NRP1 konstruierten wir eine Reihe von 3'UTR Fragmente, einschließlich der vollen Länge Wildtyp NRP1 3'UTR, eine Bindungsstelle 1-Mutante und eine Bindungsstelle 2-Mutante (Abb. 2A). Diese Fragmente wurden dann in das psiCHECK2 Luciferase-Reporter Plasmid insertiert. Wir fanden, dass die Co-Transfektion von miR-338 und der Wildtyp NRP1 3'UTR eine signifikante Abnahme der Luciferase-Einheiten verursacht Vergleich zu den Kontrollen mit. Jedoch ist die Co-Transfektion von miR-338 und dem mutierten NRP13'UTR nicht eine Abnahme der Luciferase-Einheiten bewirken (Fig. 2B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-338 Ziele direkt NRP1.

miR-338 hemmt die Magenkrebszelle Migration, Invasion und Proliferation und fördert die Apoptose durch NRP1

Um die funktionelle Bedeutung von miR-338-Überexpression untersuchen bei Magenkrebs, infizierten wir die Zelle Magenkrebs Linien AGS und MKN45 mit LV-hsa-mir-338. Im Vergleich mit der Expression von cont-miR wurde miR-338 überexprimiert deutlich in den AGS und MKN45 Zelllinien nach der Infektion mit LV-hsa-miR-338 (3A). Wir fanden auch, dass im Vergleich mit cont-miR die Expression von NRP1 war signifikant herunterreguliert im AGS und MKN45 Zelllinien nach der Infektion mit LV-hsa-miR-338 (3B). Die Zellen mit Zwangs Expression von miR-338 zeigten signifikant verringert Proliferation im Vergleich zu den Zellen mit forcierter Ausdruck von cont-miR (3C). Die miR-338-infizierten Zellen zeigten ebenfalls reduziert die Koloniebildung Fähigkeit: die Zahl der Herde in der miR-338-exprimierenden Zellen im Vergleich verringert wurde mit den cont-miR-infizierten Zellen (3D). Die Transwell Migration und Matrigel Invasion Assays gezeigt, dass miR-338 signifikant die Migration und Invasion Kapazitäten der AGS und MKN45-Zellen (3E) reduziert. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) -Analyse zeigte, dass die erzwungene Expression von miR-338 führen zur Magenkrebszellen Apoptose. Der Prozentsatz der gesamten apoptotischen Zellen (frühe apoptotische + späten apoptotischen) signifikant um 11% in Reaktion auf miR-338-Überexpression verglichen mit cont-miR-Überexpression in AGS-Zellen erhöht. Eine 10% ige Zunahme in der Anzahl der apoptotischen Zellen wurde in den MKN45-Zellen mit miR-338-Überexpression im Vergleich zu cont-miR (Abbildung 3F) beobachtet. miR-338 konnte die Expression von NRP1 durch direkte Hemmung NRP1 Transkript oder andere indirekte Schaltungen zu regulieren, so dass wir als nächstes festgestellt, ob die Reduktion der NRP1 Expression könnte die Hemmung von Magenkrebs Zellmigration, Invasion und Proliferation nach der erzwungenen Expression von Mir- beobachtet erklären 338. Wir gezwungen daher die Expression von miR-338 in AGS-Zellen zusammen mit einem Konstrukt, mit dem NRP1 kodierenden Sequenz aber die 3'UTR der NRP1 mRNA fehlt. Als Ergebnis ergab dieses Konstrukt eine NRP1 mRNA, die für miR-338 resistent war. Wir fanden heraus, dass Magenkrebs Zellmigration, Invasion, Proliferation und Apoptose in der AGS-Zelllinie wiederhergestellt wurden mit Zwangs miR-338 Expression und NRP1 Restauration (Abbildung 3G-3J). Diese Ergebnisse zeigen, dass miR-338 Magenkrebs-Zellmigration, Invasion und Proliferation hemmt und fördert Apoptose durch NRP1 Targeting.

Wirkung von miR-338 auf Signalwege in AGS-Zellen

Als nicht Tyrosin-kinase-Rezeptor, NRP1 kann die Expression der Phosphorylierung von Erk1 mäßig erhöhen /2, Akt und P38MAPK Tumorzellproliferation und Metastasierung zu fördern, sowie die Apoptose und Immunreaktionen zu dämpfen. Weil NRP1 ein stromabwärtiges Ziel von miR-338 ist, gingen wir davon aus, dass miR-338, die Expression der Phosphorylierung von Erk1 verringern könnte /2, Akt und P38MAPK. Wir fanden, dass die erzwungene Expression von miR-338 die Phosphorylierung von Erk1 inhibiert /2, aber die relativen Expressionsspiegel der Gesamt Erk1 /2 war nicht signifikant verändert. miR-338 könnte auch die Phosphorylierung der p38 MAPK und Akt (4A) zu verringern. miR-338 konnte die 3'UTR der NRP1 mRNA binden die Phosphorylierung von ERK1 /2, Akt und P38MAPK zu regeln; aber wir wussten nicht, ob miR-338 die 3'UTRs anderer Gene binden könnte eine gleiche Wirkung zu erzielen. So wurde rescue experiment durchgeführt und die Wiederherstellung der NRP1 Expression wurde durch Immunoblot-Analyse (4B) bestätigt. Wir fanden, dass die Phosphorylierung von ERK1 /2, Akt und P38MAPK wurden in den AGS-Zellen mit Zwangs miR-338-Expression und NRP1 Restauration (4C) nicht signifikant verändert. Daraus schließen wir, dass miR-338 die Phosphorylierung von ERK1 /2, P38 MAPK und Akt über NRP1 reguliert.

miR-338 die epithelialen Phänotyps von Magenkrebs
Bestimmt

EMT ist ein wichtiger Mechanismus mit Krebs Invasivität und Metastasierung. Das Phänomen der EMT wird als Übergang von Epithelzellen definiert fibroblastoid- oder mesenchymalen ähnlichen Zellen. EMT wird durch den Verlust von epithelialen Marker und den Erwerb von mesenchymalen Komponenten aus. E-Cadherin, Occludin und Cytokeratin während EMT herunter reguliert, während N-Cadherin, Vimentin, Fibronectin und SCHNECKE upregulated werden. NRP1 verbessert das Signalisierung über drei Hauptwege, die in Verbindung gebracht wurden, um EMT, das heißt, TGF-β, Hh und HGF /cMet. Um die Rolle von NRP1 in Aufrechterhaltung der mesenchymalen Phänotypen von Magenzellen finden, geklopft wir die Expression von NRP1 durch RNA-Interferenz (RNAi) nach unten (Fig. 5A) und untersuchten die Expression von mesenchymalen Marker wie Fibronectin, Vimentin, N-Cadherin und SNAIL sowie die epithelialen Marker E-Cadherin, in AGS-Zellen. Wir fanden, dass die Expressionsniveaus von Fibronektin, Vimentin, N-Cadherin und Schnecke verringert wurden, aber die Expression von E-Cadherin wurde in den NRP1 abgereicherte Tumorzellen (Fig. 5B) erhöht. Das Ergebnis zeigt, dass NRP1 EMT Prozess bei Magenkrebs fahren kann. Da NRP1 ein nachgeschalteter Ziel von miR-338 ist, gingen wir davon aus, dass miR-338 die epitheliale Phänotyp von Magenkrebs bestimmen könnte. Um zu bestimmen, ob die molekularen Veränderungen, die typisch für eine reduzierte EMT trat in miR-338-exprimierende Zellen, untersuchten wir die Expression von mesenchymalen und epithelialen Marker in AGS-Zellen. Die Immunoblot-Analyse zeigte, dass die Expressionsniveaus von Fibronektin, Vimentin, N-Cadherin und Schnecke in den AGS-Zellen mit dem erzwungenen Expression von miR-338 verringert wurden. Darüber hinaus erhöht die erzwungene Expression von miR-338, die Expression von E-cadherin in dem AGS-Zelllinie, während die Steuerinfizierten Zellen E-Cadherin-negativen blieb. Wir fanden, dass miR-338 die Phosphorylierung von ERK1 /2, P38 MAPK und Akt über NRP1 geregelt; Daher war es notwendig, zu prüfen, ob miR-338 EMT über NRP1 regulieren könnte. Die Immunoblot-Analyse zeigte, dass die Expression der vorstehend mesenchymalen Marker in der miR-338-exprimierende Zellen auf das normale Niveau durch die Wiederherstellung der NRP1 Ausdruck (Fig. 5C) wiederhergestellt wurde. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass miR-338 EMT über NRP1 in Magenkrebszellen hemmen könnte.

miR-338 Tumorwachstum Vermindert und Unterdrückt D-MVA durch Targeting NRP1 In Vivo

Basierend auf den beobachteten Rückgang der wandernden, invasive und proliferative Verhalten in AGS und MKN45 infizierten Zellen mit LV-hsa-miR-338, untersuchten wir als nächstes die Rolle der miR-338 in Wachstum in vivo. subkutan Nacktmäuse mit gleichen Zahlen geimpft Wir (1 x 10 ^{6 Zellen pro Maus) von AGS-Zellen mit der erzwungenen Expression von miR-338 oder cont-miR, mit oder ohne NRP1 Restaurierung. Tumorinzidenz wurde alle zwei Wochen bewertet und Tumoren erschien in allen Mäusen. miR-338-Expression in den Nacktmäusen Tumoren wurde gemessen qRT-PCR, und wir fanden, dass miR-338 Expression signifikant in den Tumoren erhöht, dass miR-338 (6A) überexprimiert. Die erzwungene Expression von miR-338 deutlich hemmte das Tumorwachstum in vivo, aber die Überexpression von NRP1 konnte das Tumorwachstum (6B) wiederherzustellen. Als nächstes untersuchten wir NRP1 Ausdruck in den Nacktmäusen Tumoren durch Western-Blot und Immunhistochemie. Wir fanden heraus, dass NRP1 Expression signifikant in den Tumoren verringert, dass miR-338 überexprimiert; jedoch wurde NRP1 Expression in den Tumoren, die wiederhergestellt NRP1 (6C, 4D) überexprimiert. So entnehmen wir, dass miR-338 das Wachstum gehemmt Tumor in vivo NRP1 Ausdruck Eindämmung. NRP1 kann tumorangiogenesis steigern; daher die Hypothese aufgestellt, dass die erzwungene Expression von miR-338 über NPR1 hemmen tumorangiogenesis würde. Immunhistochemische Färbung für CD34 wurde verwendet, um die Anzahl und die morphologischen Eigenschaften der Blutgefäße innerhalb der einzelnen Tumor zu bewerten. Die Gefäße wurden durch Zählen der Anzahl von Strukturen mit diskreten Färbung innerhalb jedes Feld ohne Rücksicht auf die Behältergröße oder Durchgängigkeit aufgezählt. Die Gefäße in den Tumoren, die miR-338 überexprimiert waren subjektiv weniger als die cont-miR-überexprimierenden Tumoren; jedoch war die Anzahl der Gefäße in den Tumoren, die wiederhergestellt NRP1 (6E) überexprimiert. Das digitalisierte mikrovaskulären Bereich (D-MVA) wurde analysiert, um die Behältergröße und Durchgängigkeit in unserer Analyse der Tumorgefäße übernehmen durch eine Schätzung des integrierten Lumenfläche bietet und vermutlich der Blutfluss senkrecht zur Tumor Abschnitt. Die D-MVA wurde in den miR-338 überexprimiert Tumoren reduziert. Zu unserer Überraschung fanden wir, dass NRP1-überexprimiert Tumoren zeigten keine signifikant erhöhte Angiogenese, aber die Reduktion in D-MVA aufgrund miR-338-Überexpression wurde in den Tumoren wiederhergestellt, die NRP1 (6F und 6G) ​​überexprimiert. Wir spekulieren, dass NRP1 Ausdruck bereits in Magenkrebs nach oben reguliert wurde, so dass eine weitere überexprimiert NRP1 nicht signifikant Tumorgefäße erhöhen, sondern können Tumorgefäße wiederherzustellen, die von miR-338 reduziert wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-338 das Tumorwachstum reduziert und unterdrückt D-MVA durch NRP1 in vivo Targeting.}

Diskussion

Mit Gen-Chips und Bioinformatik, wir voraus, dass die Ziel-miRNA von NRP1 war miR -338. Forschung hat gezeigt, dass die Expression von miR-338 in verschiedenen Tumoren variiert. Huang XH et al. zeigten, dass durch gezielte geglätteten Leber Invasion von Krebszellen unterdrückt miR-338-3p [20]. Darüber hinaus ist in Melanomen, miR-193a, miR-338 und miR-565 wurden bei Patienten mit einer BRAF-Mutation [21] gezeigt werden unterexprimiert. Aus diesen Daten entnehmen wir, dass miR-338 als Tumorsuppressor wirken könnten. Es gibt keine veröffentlichten Literatur darüber, ob miR-338 in Magenkrebs unterexprimiert wird. In unserer Studie wurden die Expression von miR-338 zunächst in 41 menschlichen Magenkrebsproben und 24 Proben von benachbarten normalen Schleimhaut Gewebe gemessen. Wir untersuchten dann die Expression von miR-338 in fünf Magenkrebszelllinien und in normalen Magenschleimhaut Zelllinien. Wir fanden, dass die Expression von miR-338 wurde herunterreguliert sowohl im Tumorgewebe und Krebszelllinien. Darüber hinaus könnte die überexprimiert miR-338 Magenkrebs-Zellmigration, Invasion und Proliferation hemmen und die Apoptose fördern. Inzwischen können diese kanzerogene Eigenschaften vollständig durch NRP1 Expression wieder hergestellt werden. Darüber hinaus schlug die Luciferase-Reporter-Assays, dass miR-338 Ziele direkt NRP1. Daraus schließen wir, dass miR-338 wirkt als potentieller Tumorsuppressor bei Magenkrebs, eine Funktion, die durch die Eindämmung der Expression von NRP1 erreicht wird.

Als Nicht-Tyrosin-Kinase-Rezeptor, NRP1 die mäßig erhöhen Expression der Phosphorylierung von Erk1 /2, Akt und P38MAPK. M Akagi et al. festgestellt, dass die Hemmung der NRP-1 die Expression der Phosphorylierung von Erk1 /2, Akt und P38MAPK [22] reduziert. Zusätzlich wurde gezeigt, Forschung, dass die Expression von ERK1 /2-Phosphorylierung hochreguliert wurde in NRP-1-überexprimierenden Zellen [23]. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass überexprimierten miR-338, die Expression der Phosphorylierung von Erk1 verringern könnte /2, Akt und P38MAPK, ein Effekt, der auf die Wiederherstellung NRP1 umgekehrt wurde. Die Aktivierung von ERK, Akt und P38MAPK in Verbindung mit Apoptose Widerstand /das Überleben der Zellen wurde in einer Vielzahl von Modellsystemen [24], [25], [26] gut dokumentiert.

• PLoS ONE: Beziehung zwischen P53-Status und Ansprechen auf die Chemotherapie bei Patienten mit Magenkrebs: Eine Meta-Analyse
• PLoS ONE: Expression des EGF-Familie in Magenkrebs: Das Herunterregulieren von HER4 und seine aktivierenden Liganden NRG4