PLoS ONE: Abnahme des miR-202-3p Expression, einer neuartigen Tumor Suppressor, in Magenkrebs

Abstrakt

Schwellen Studien haben gezeigt, dass microRNAs bei der Entwicklung und Progression von Krebs beteiligt sind. Hier fanden wir, dass miR-202-3p wurde häufig herunterreguliert im Magenkrebsgewebe. Die Überexpression von miR-202-3p in Magenkrebszellen MKN-28 und BGC-823, deutlich unterdrückt die Zellproliferation und induzierte Zell-Apoptose sowohl In-vitro-
und in vivo
. Darüber hinaus war Gli1 Ausdruck häufig positiv bei Magenkrebs Gewebe und umgekehrt mit miR-133b-Expression korreliert. Wir zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Gli1 ein Ziel von miR-202-3p war und spielt eine wesentliche Rolle als Vermittler der biologischen Wirkungen von miR-202-3p bei Magenkrebs. MiR-202-3p hemmte auch die Expression von γ-Catenin und BCL-2. Zusammengenommen sind diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass miR-202-3p als neuartige Tumorsuppressor wirken kann bei Magenkrebs und seine Anti-Tumor-Aktivität die direkte Ausrichtung und die Hemmung der Gli1

Citation kann Attribut. Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J, et al. (2013) Abnahme von miR-202-3p Expression, einer neuartigen Tumor Suppressor, in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10.1371 /journal.pone.0069756

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

Received: 28. Februar 2013 beginnen; Akzeptiert: 11. Juni 2013 beginnen; Veröffentlicht am: 25. Juli 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde durch Zuschüsse von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Nr. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 und 81272749), Wissenschaft und Technologie Kommission der Stadt Shanghai (Nr. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 und 12PJ1406300), Schlüsselprojekte in der National Science and Technology Säulen-Programm von China (Nr 2011BA203191), Forschungsfonds für das Doktoratsstudium der Hochschulbildung von China (Nr 20110073110071), Key-Projekt von Shanghai Education Committee (Nr. 12ZZ102, 12ZZ105) und Innovation Stiftung für PhD Absolventen der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren und die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit [1]. Obwohl Fortschritte in der Behandlung, ist die Überlebensrate von Patienten mit GC enttäuschend ist, dies vor allem auf die geringe Zahl von spezifischen therapeutischen Ziele. Daher ist es entscheidend, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Entwicklung von Magenkrebs zu identifizieren.

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von kleinen (18-25 Nukleotide), nicht-kodierende, einsträngige endogenen RNAs. Sie unterdrücken die Proteinexpression durch in den 3'-untranslatierte Regionen (3'UTRs) von Zielgenen sich mit vollkommen oder unvollkommen komplementären Sequenzen interagieren. Studien in den letzten Jahren haben gezeigt, dass eine Dysregulation der miRNAs eine wichtige Rolle bei verschiedenen Krebsarten [1] spielen - [4], einschließlich GC [5] - [13]. Die Daten aus der Studie über miRNAs und deren Zielgene können spannende therapeutische Möglichkeiten bieten, [3].

Wir haben vor kurzem mehrere miRNAs dereguliert in GC, wie Herabregulation von miR-126 [14], miR-409-3p identifiziert [15], miR-625 [16], und Hochregulation von miR-21 [17], miR-301a [18]. Obwohl viele miRNAs identifiziert wurden mit GC Assoziieren, muss der Mechanismus dieser miRNAs in Magen tumorigenesis noch untersucht werden. In unserer bisherigen Arbeit, zahlreiche mutmaßliche miRNAs, die unterschiedliche Expression zwischen GC Geweben und ihren benachbarten Nicht-Tumorgewebe von 28 Patienten zeigten, wurden identifiziert [19]. Unter ihnen war miR-202-3p einer der signifikant verringert miRNAs. Doch die Rolle der miR-202-3p in GC wird selten untersucht.

MiR-202-3p, frühere Namen hsa-miR-202, innerhalb einer chromosomalen fragilen Stelle befindet sich in 10q26. Das Löschen der fragilen Stelle hat mit Endometrium [20], Gehirntumoren in Verbindung gebracht worden [21], [22]. MiR-202 wurde berichtet, dass bei Brustkrebs dereguliert werden [23], [24], Gebärmutterhals-Plattenepithel-[25], Darmkrebs [26] und follikulärem Lymphom [27]. Petrocca et al. dass miR-202 gefunden wurde bei der chronischen Gastritis herunterreguliert [28]. MiR-202 wurde von 4-hydroxynoneal (HNE) in HL-60-Leukämiezellen [29] nach unten reguliert werden gezeigt. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte auch, dass miR-202 zielt direkt auf Proto-Onkogens MYCN, bei der Hemmung der Neuroblastom-Zellproliferation resultierende [30].

Hier haben wir eine allgemeine Abnahme des miR-202-3p Expressionsniveau demonstrieren in 150 GC Gewebe mit den nicht-Tumorgewebe verglichen und feststellen, dass die miR-202-3p Ebenen mit Tumorgröße und Patienten im Alter assoziiert sind. Außerdem haben wir entdeckt, zum ersten Mal, dass miR-202-3p das Wachstum hemmen könnte und durch direktes Targeting den Transkriptionsfaktor Apoptose von Zellen sowohl GC in vitro Karten und in vivo induzieren
Gli1 und Hemmung der Expression von Zielgenen Gli1 γ-Catenin und BCL-2.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern erhalten. Die Studie wurde von der Human Research Ethics Committee von Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), die Labortierethikkommission der RuiJin Hospital (LAEC 11-062) zugelassen. Tierverfahren wurden nach einem von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China genehmigten Protokoll durchgeführt.

Cell Culture

Human GC-Zelllinien SGC -7901 und BGC-823 wurden von Shanghai Institutes for Biological Sciences, chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. MKN-45 und MKN-28 Zelllinien wurden von der Japanese Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan) erhalten. NCI-N87, AGS, KATO III und SNU-1-Zelllinien wurden ursprünglich von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erworben. Menschliche embryonale Nierenzelllinie 293T (HEK-293T) wurde in unserem Institut erhalten. Die Zellen wurden aus der Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff gewonnen gespeichert und bei frühen Passagen verwendet. Alle Zellen wurden in RPMI-1640-Medium plus 10% fötalem Rinderserum (FBS) und kultiviert in 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre gehalten. Exponentiell wachsende Zellen wurden für Versuche verwendet.

Patientengewebe

Primär GC Gewebe und angepasst Nicht-Tumorgewebe wurden aus 150 GC Patienten erhalten radikale Gastrektomie an der Abteilung für Chirurgie, Ruijin Krankenhaus, Schule der Medizin, der Shanghai Jiao Tong University. Die Proben wurden schockgefroren direkt nach der Operation. Alle Proben wurden durch unabhängige pathologische Untersuchung bestätigt. Keiner der Patienten erhielten eine präoperative Behandlung. Für alle Patienten war klinisch-pathologischen Informationen verfügbar. Tumor-Klassifizierung nach der Internationalen Union Against Cancer (2009).

RNA-Isolierung und quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)

Gesamt-RNA wurde aus Zelllinien und Gewebeproben extrahiert Trizol mit Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Konzentrationen und Reinheit der RNA-Proben wurden durch Elektrophorese und spektrophotometrischen Verfahren gemessen. Die Expression von miR-202-3p und U6 small nuclear RNA (RNU6B) wurden in dreifacher Ausführung von der Stamm-Schleife RT-PCR-Verfahren unter Verwendung der Hairpin-it ™ miRNAs qPCR Quantifizierung Kit (Genepharma, Shanghai, China) mit spezifischen Primern getestet formiR-202-3p und U6 small nuclear RNA (RNU6B). Relative miRNA-Expression von miR-202-3p wurde normalisiert gegen die endogene Kontrolle, U6, die DDCT Methode. Die mRNA-Spiegel von Gli1 und GAPDH wurden in dreifacher Ausführung mit dem SYBR Green real time PCR (Applied Biosystems, USA) nach den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Quantifizierung wurde mit der DDCT relative Quantifizierung Verfahren mit menschlichen GAPDH als interne Kontrolle durchgeführt. Die folgenden Primer wurden verwendet: Gli1 (sense: 5'-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 '; Antisense: 5'-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3') [31] und GAPDH (sense: 5'-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 '; Antisense: 5'-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3'.)

transiente Transfektion von miRNA-Mimetika

Mir- 202-3p nachahmt (dsRNA Oligonukleotide) und negative Kontrolle mimics1 (NC) (sense: 5'-UUC UCC GAA ACG CGU GUC UTT-3 ', Antisense: 5'-ACG CAC UGA GUU CGG AGA ATT-3') wurden gekauft von Genepharma (Shanghai, China). Zellen wurden in 6-Well-Platten am Tag vor der Transfektion 40% Zellkonfluenz im Moment der Transfektionseffizienz zu gewährleisten. Die Transfektion von miRNA imitiert in Zellen wurde durchgeführt, mit Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß dem Verfahren des Herstellers. Die miRNA imitiert wurden bei einer Endkonzentration von 100 nM verwendet.

Cell Proliferation Assay

Bei 24 h nach der Transfektion mit miRNA imitiert, Zellen (2 × 10 ^{3 Zellen /Well ) wurden in 96-well Platten ausgesät und 72 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde in dreifacher Ausführung durch wasserlösliche Tetrazoliumsalz (WST) Assay unter Verwendung des Zellzählung Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) und gemessen nach Angaben des Herstellers Anweisung bewertet.}

Koloniebildung in Weichagar-Assay

miRNA nachahmt transfizierten Zellen wurden mit 0,3% weichen Agarose (A9045, niedrige Geliertemperatur, Sigma-Aldrich, USA) in RPMI 1640 10% resuspendiert FBS und überlagert auf 0,4% verfestigten Agar in RPMI 1640, das 10% FBS enthält, in 6-Well-Platten (1 x 10 ^{3 Zellen /Vertiefung) bei 24 h nach der Transfektion. Die Platten wurden für 2 Wochen inkubiert. Kolonien mindestens 50 Zellen enthielten, wurden gezählt.}

Apoptosis Analyse

Einen Tag vor der Transfektion mit miRNA imitiert, 1 x 10 ^{6 Zellen wurden in 6-Well-Platten. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und gefärbt mit AnnexinV /PI Doppel Färbekit (BD Biosciences, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Apoptotische Zellen wurden in Triplikaten bewertet und mittels Durchflusszytometrie dreimal unabhängig wiederholt auf einem FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).}

retrovirale Transfektion für stabile Zelllinien

genomischen Region, die enthalten das primäre Transkript von miR-202-3p wurde in die EcoRI-XhoI-Stelle des modifizierten pMSCV-GW-RfA-PGK-EGFP retroviraler Vektor geklont. Negative Kontrollvektoren hatte keinen Einsatz. HEK 293T-Zellen (1 × 10 ^{6 /Vertiefung) wurden in Platten mit 6 Vertiefungen am Tag vor der Transfektion ausgesät. Zehn ug von retroviralen Konstrukt enthalten, entweder miR-202-3p oder kein Einsatz, 2 ug gag /pol und 2 ug VSVG waren Co-Transfektion in HEK 293T-Zellen unter Verwendung von Lipofectamin ™ 2000 Reagenz und Opti-MEM I reduziert Serum-Medium in jedem Teller. Viren wurden bei 48 h und 72 h nach der Transfektion durch virale Sammelmedium (RPMI-1640 mit 10% hitzeinaktiviertem FBS + 1% Glutamin +20 mM Hepes) geerntet. Infektionen von MKN-28-Zellen wurden in Gegenwart von 8 ug /ml Polybren in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte durchgeführt. Zellen wurden bei 1500 rpm Spin bei Raumtemperatur für 30 min infiziert. Virus-enthaltende Überstand wurde nach 2 h entfernt. Positive Zellen wurden auf GFP-Expression durch FACS-Sortierung ausgewählt und RV-miR-202-3p und RV-miR-Steuerung jeweils benannt. MiR-202-3p Expression wurde durch qRT-PCR bestätigt.}

Tumorwachstum in Nacktmäusen

Männliche Balb /c nu /nu-Mäuse im Alter von sechs Wochen (Institut für Zoologie der Chinesischen Akademie of Sciences) wurden zu einem bestimmten Pathogen-freie Umgebung in der Animal Laboratory Unit School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, China untergebracht. Die Mäuse erhielten humane Pflege und die Studienprotokolle wurden nach einem Protokoll genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China. Die Zellen (100 &mgr; l, 2 × 10 ^{6 Zellen) von stabil transfizierten Linien RV-miR-202-3p oder RV-miR-Kontrolle wurden gesammelt und subkutan in Mäuse geimpft. Sechs Mäuse wurden für jede Gruppe verwendet. Mäuse wurden wöchentlich überprüft und Tumorknötchen wurden mit einer Schieblehre gemessen. Tumorvolumen (V) wurde unter Verwendung der Gleichung V = 4 /3π × L /2 × (W /2) geschätzt 2 ist, wobei L die Mittelachse der Länge und W die Mittelachse width.The Tumorzellen wurden auf Wachstum 5 Wochen und Tumorwachstumskurven erlaubt und Hemmen Raten wurden berechnet. Nachdem die Mäuse getötet worden waren, wurden alle Tumortransplantaten ausgeschnitten, gewogen, geerntet, fixiert und eingebettet. Jedes Experiment wurde zweimal durchgeführt.}

TUNEL Analyse

Das Terminal Nukleotidyltransferase vermittelte nick end labeling-Assay (TUNEL) wurde nach den Anweisungen des Herstellers des DeadEnd ™ Kolorimetrische TUNEL-System-Kits (Promega, USA). Die Gewebe wurden in 10% neutralisiert Formalin und eingebettet in Paraffin Blöcken befestigt. Sektionen (4 &mgr; m) wurden dann zur Untersuchung vorbereitet. Nach Entparaffinierung wurden die Schnitte mit 20 behandelt g /ml Proteinase K für 10 min mit 0,3% H _{2 O 2 in Methanol für 10 min und 0,1% Triton X-100 in 0,1% Natriumcitrat für 2 min auf Eis. Dann wurden die Schnitte mit TUNEL Reaktionsgemisch bei 37 ° C für 60 min inkubiert. Weitere Inkubation mit Peroxidase-konjugierter Antikörper wurde 30 min bei 37 ° C durchgeführt wird. Die Schnitte wurden mit Diaminobenzidin-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur gebeizt und dann mit Hämatoxylin gegengefärbt.}

Immunohistochemistry

Sektionen (6 mm dick) von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumor specimenswere entparaffiniert in Xylol und in abgestuften Alkohol rehydratisiert. Endogene Peroxidase wurde unter Verwendung von 3% H _{2 O 2 für 10 Minuten blockiert. Folgende Antigen-Retrieval in Citrat-Puffer (pH 6,0) wurden die Gewebeschnitte mit normalem Ziegenserum inkubiert unspezifische Antikörper zu blockieren Bindung (20 min bei Raumtemperatur). Die Schnitte wurden dann mit Gli1 Antikörpern (1:50 sc-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) bei 37 ° C in humidchambers für 2 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit Peroxidase-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden die Objektträger für 5 Minuten mit DAB Substrat für weniger als 30 min mit PBS inkubiert und gespült. Hämatoxylin wurde für Gegenfärbelösung verwendet.}

Konstruktion von Plasmiden und Luziferase-Aktivitätstest

A 203 bp volle Länge des Wildtyp (WT) Gli1-3'UTR oder mutierten Gli1-3 ' UTR (mut) wurde die mutmaßliche miR-202-3p Bindungsstelle enthält, synthetisiert (Sangon, Shanghai, China). Nach der Verdauung durch SpeI und HindIII wurden die Fragmente von Wildtyp und Mutante Gli1-3'UTR in die SpeI und HindIII-Stellen von PMIR-Report Luziferase-Vektor (Applied Biosystems) und PMIR /Gli1 und PMIR /Gli1 /mut genannt, beziehungsweise. DNA-Sequenzierung wurde verwendet, um die Konstrukte zu verifizieren.

HEK-293T-Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen 24 h vor der Testleistung ausgesät. In jede Vertiefung 100 ng PMIR /Gli1 oder PMIR /Gli1 /mut, 2 ng pRL-TK (Promega, Madison, WI, USA), die Renilla-Luciferase und 100 nM miRNA imitiert wurden unter Verwendung von Lipofectamine ™ 2000 Reagenz und Opti-MEMI cotransfiziert reduziert Serum-Medium. Relative Luciferase-Aktivität wurde berechnet, 48 h nach der Co-Transfektion mit Dual-Glo Luciferase Assay (Promega, USA) gemß dem Verfahren des Herstellers. Firefly Luziferase-Aktivität wurde normalisiert auf Renilla-Luciferase-Aktivität.

Western-Blot-Analyse

Zellen und Tumor wurden lysiert unter Verwendung von M-PER Reagenzien und Halt Protease Inhibitor Cocktail-Kits (Pierce, USA). Die Proteinkonzentration der Zelllysate wurde unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA) quantifiziert. Protein wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und geblottet auf 0,22 &mgr; m-Polyvinylidendifluorid-Membranen (Millipore, MA, USA). Die folgenden spezifischen Antikörper wurden verwendet: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-Catenin (1:2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, USA) und GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Protein-Spiegel wurden auf insgesamt GAPDH normalisiert

Bau von Gli1 Expressionsplasmids und Transfektion

Durch die Verstärkung cDNA von MKN-28 unter Verwendung der folgenden Primer:. Sinn (5 'AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ') und Antisense (5'-ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), in voller Länge Gli1 wurde erhalten, verdaut durch EcoR V und Not I und kloniert in pcDNA3.1-Vektor (Invitrogen) und benannte pcDNA3 0,1-Gli1. DNA-Sequenzierung wurde verwendet, um die Konstrukte zu verifizieren.

Zellen wurden in 6-Well-Platten am Tag vor der Transfektion 80-90% Zellkonfluenz im Moment der Transfektionseffizienz zu gewährleisten. In jede Vertiefung wurden die Zellen mit 250 pmol von miR-202-3p nachahmt oder Kontrolle, zusammen mit 4 ug pcDNA3.1-Gli1 oder pcDNA3.1 leeren Vektor transfiziert, von Lipofectamine 2000 WST-Test unter Verwendung wurde bei 24 h durchgeführt nach der Transfektion, während die Apoptose-Analyse wurde bei 48 h nach der Transfektion durchgeführt.

Statistische Analyse

Kontinuierliche Variablen wurden unter Verwendung des Student-Vergleich t
Test für normalverteilte Variablen und Wilcoxon Rangsummentest für nonnormally verteilte Variablen. Die Beziehung zwischen den miR-202-3p Expressionsniveaus und klinisch-pathologische Parameter wurde mit der Pearson-Chi-Quadrat-Test analysiert. Alle Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen. Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung von PASW Statistics 18.0 Software (IBM, USA) durchgeführt. Ein zweiseitiges Wert von P
. ≪ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: prognostischen Wert von Survivin in Patienten mit Magenkrebs: Eine systematische Überprüfung mit Meta-Analysis
• PLoS ONE: Verminderte Expression von AZGP1 ist im Zusammenhang mit einer schlechten Prognose bei primären Magen Cancer