PLoS ONE: VEZT, ein Roman Vermeintliche Tumor Suppressor, unterdrückt das Wachstum und Tumorigenität von Magenkrebs

Abstrakt

Vezatin (VEZT), ein Adhärenzverbindungen Transmembranprotein, wurde als mutmaßliche Tumorsuppressor in unserer früheren Studie identifiziert. Allerdings bleibt die Rolle der VEZT in Tumorigenese schwer fassbar. Wir wollten seine epigenetische Regulation und biologische Funktionen bei Magenkrebs zu klären. In dieser Studie zeigen wir, dass das Expressionsniveau von VEZT bei lymphatischen Metastasierung beteiligt ist, die Tiefe von Krebs Invasion und TNM-Stadium in 104 Magenkrebs-Patienten. Hydrogensulfat-Sequenzierung Polymerase-Kettenreaktion (BSP) Methoden zeigten, dass VEZT in Geweben und entsprechenden Blut von Magenkrebs-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen hypermethyliert wurde. Helicobacter pylori
( H. Pylori
) Infektion induziert die Methylierung und Silencing VEZT in GES-1-Zellen. Wiederherstellen VEZT Ausdruck in MKN-45 und NCI-N87 Zellen Magenkrebs hemmte das Wachstum, Invasion und tumorigenesis in vitro und in vivo
. Globale Microarray-Analyse wurde die molekulare Basis der biologischen Funktionen von VEZT nach VEZT Transfektion in Kombination mit Echtzeit-PCR und Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Analyse angewandt. G-Protein-gekoppelten Rezeptor-56 (GPR56), Zellwachstum, Zellzyklus 42 (CDC42), Migration /Invasion und Transkriptionsfaktor-19 (TCF19), Fortschreiten des Zellzyklus wurden als direkte VEZT Zielgene identifiziert. TCF19, ein neues Ziel von VEZT wurde funktionell validiert. Die Überexpression von TCF19 in MKN-45-Zellen erhöhte Zellzyklus-Fortschritt und Wachstumsfähigkeit. Diese Studie liefert neue Einblicke in die Regulation des VEZT Gen, das ein potentielles Ziel für therapeutische Anti-Krebs-Strategien darstellen könnte

Citation. Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, ein Roman Vermeintliche Tumor Suppressor, unterdrückt das Wachstum und Tumorigenität von Magenkrebs. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10.1371 /journal.pone.0074409

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Received: 1. April 2013 beginnen; Akzeptiert: 1. August 2013; Veröffentlicht: 17. September 2013

Copyright: © 2013 Miao et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit teilweise wurde von der National Jugendliches Science Foundation of China (81101858), der Natural Science Foundation der Provinz Shandong China (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key-Forschungsprojekt von Shandong Wissenschaft und Technologie Kommission durch Zuschüsse unterstützt (2011GGB14158, 2007H2071), die Jugendliches Science Foundation der Provinz Shandong China (BS2010YY060). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache der männlichen Krebs-Todesfälle und die dritthäufigste Ursache für weibliche Krebs-Todesfälle weltweit [1]. Es ist ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit in der ganzen Welt [2]. In China gibt es 400.000 neue Fälle von Magenkrebs und 300.000 Todesfälle jährlich. Viele Fälle, die von Magenkrebs gelitten haben, mit extrem schlechten Ergebnis kurative Chance verloren [3]. Daher ist es, neue und wirksame Behandlungsmethoden zu entwickeln wesentlich für Magenkrebs Sterblichkeit verringern. Es ist bekannt, dass die Pathogenese von Magenkarzinomen multifaktoriell ist, die genetische Veranlagung und Umweltfaktoren enthält. Es gibt eine Reihe von genetischen Wechsel einschließlich Tumorsuppressorgene, Onkogene, Zelladhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktoren [4].

Obwohl die molekularen Mechanismen von Magen Karzinogenese bleiben unklar, epigenetische Silencing von tumorbezogenen Genen durch Promotor hypermethylation wurde vor kurzem als ein wichtiger Mechanismus der Tumorigenese entstanden. Der Promotor Hyper Profil unterscheidet sich in jeder Krebsart und innerhalb jedes Gen, Tumor Typ- und Gen-spezifischen Hyperprofilen aus, die in der entsprechenden molekularen Mechanismus der Tumorentstehung beteiligen. Die Identifizierung eines neuen Gens durch gezielte Promotor hypermethylation kann zur Inaktivierung der tumorunterdrückende Wege Einblicke in die Mechanismen bereitstellen und ist wichtig für die Identifikation von Tumormarkern in Magenkrebs [5,6].

Kürzlich haben wir eine Adhärenzverbindungen Transmembranprotein, VEZT als Kandidat Tumor-Suppressor-Gen identifiziert. Wir wollten die epigenetische Regulation und biologische Funktionen von VEZT bei Magenkrebs zu klären. VEZT, ein allgegenwärtiges integralen Protein wird indirekt mit E-Cadherin-Catenin-Komplexes und Aktin-Zytoskelett [7,8] zugeordnet ist. Seine Funktionen sind vor allem in Epithelzellen untersucht. Der Verlust der VEZT ist zunehmend nachteilig auf die embryonale Entwicklung [9,10] und VEZT ist von entscheidender Bedeutung für die Integrität der zellulären Kreuzungen während der Langzeit mechanische Beanspruchung auf der Ebene der inneren Haarzellen als Reaktion auftritt Erhaltung zu klingen. Darüber hinaus ist die Innenohr spezifische VEZT bedingte Invalidierung führt zu progressive Taubheit [7]. VEZT ist stark in Gehirn exprimiert [8,11]. VEZT in dendritischen Dornen in Maus-Hippocampus-Neuronen angereichert. Mit VEZT knock-down und Knockout vor (D6cre) oder nach (CamKIIαcre) Geburt, reguliert VEZT Wirbelsäule Morphologie. Morphologische Veränderungen sind nicht mit beeinträchtigter synaptische Kontakte verbunden sind, aber postsynaptischen VEZT spielt eine entscheidende Rolle bei der morphologisch-funktionelle Reifung von exzitatorischen postsynaptischen Elemente [12].

Die Inaktivierung des VEZT Gen wurde in Magenkrebs identifiziert worden ist, und die Methylierung von CpG Inseln innerhalb der Promotorregion des Gens VEZT seiner Inaktivierung beitragen, wie durch einen früheren Studie von unserem Labor [13] bestimmt. Der Mechanismus der Methylierung und die genaue Rolle der VEZT in der Entwicklung von Magenkrebs sind derzeit nicht bekannt. Die Zielgene und verwandte Wege der VEZT noch nicht identifiziert worden. In dieser Studie untersuchten wir systematisch den Mechanismus der Methylierung und Methylierungsstatus des Promotors des Gens VEZT. Wir analysierten auch seine funktionellen Eigenschaften nach der Rekonstitution von VEZT Ausdruck in vitro und in vivo
.

Materialien und Methoden

Die Zelllinien und Gewebeproben

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, die immortalisierte humane Magenschleimhaut Zelllinie GES-1 (vom Institut für Viszeralchirurgie von Ruijin Krankenhaus angegliedert an der Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] und humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden in unserem Institut erhalten. Magenkrebszelllinien SNU-1 und N87 NCI-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten. Kurz gesagt wurden die Zellen in RPMI1640 mit 10% fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO _{2 gehalten.}

Primärmagentumor und normaler Magenschleimhaut Gewebe entweder an unserer Klinik Routine therapeutische Operation oder Magen-Darm-Endoskopie gesammelt wurden. Der Rest war H. pylori
Infektionsstatus wurde auf der Urease-Schnelltest bestimmt basierend wie zuvor beschrieben [18].

Ethik Statement

Eine schriftliche Einverständniserklärung in der Studie von allen Teilnehmern erhalten. 4-Wochen alten männlichen Balb /c Nacktmäuse wurden aus dem Experimental Animal Center der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) und gepflegt im Animal Laboratory Zentrum der Provinzkrankenhaus, angeschlossen an die Universität Shandong (Jinan, China) auf eine gekaufte 12.12 h Hell /dunkel-Zyklus (Licht bei 19 ab: 00) mit Futter und Wasser ad libitum. (: SHANS87492 Permit Number) Die Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am LKH, angeschlossen an die Universität Shandong genehmigt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des Landeskrankenhaus angeschlossen an die Universität Shandong genehmigt.

Verarbeitung von Lasermikrodissektion für Gewebe und Zellen

Die Gewebe wurden so schnell wie möglich nach der Resektion entfernt und fixiert Formalin, in Paraffin eingebettet und geschnitten in 8 um dicke Abschnitte für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung. Alle Gewebe wurden histologisch und erfahrenen Pathologen bestätigt die Diagnosen untersucht. Ein Teil jeder Probe wurde in Tissue-Tek eingebettet ^{® optimale Schnitt Temperatur ™ (OCT) -Verbindung Medium (VWR Scientific Products, San Diego, CA, USA) in einem Kryostaten und für die Mikrodissektion gefroren einrastet.}

Zellen und Gefrierschnitt Objektträger wurden kurz vor dem Laser Mikrodissektion (LCM) auf Eis gefärbt. Kurz gesagt, wurden die Schnitte Laser einen LM200-System (Olympus, Japan /Arcturus Engineering Inc, USA) unter Verwendung mikrodissezierten. Interessengebiete wurden unter mikroskopischer Führung ausgewählt und mit Ethylen-Vinyl-Thermoplast (EVA) Folie abgedeckt montiert auf optisch transparenten Deckel. Der Infrarot-Laser wurde durch Knopfdruck aktiviert werden, die den Film direkt über den Zielzellen schmilzt. Diese Schmelze bewirkt eine Bindung zwischen den Zellen und dem Übertragungsfilm zu bilden, der zwischen den Zellen und den Schiebern stärker als die Bindung wurde. Die Parameter für LCM verwendet enthalten einen Laser Durchmesser von 7,5 &mgr; m, Laserleistung von 50-60 mW. Fünftausend Laserpuls Entladungen pro Probe wurden verwendet, um "einzufangen" etwa 10 000 morphologisch Zellen von jeweils. Jede Bevölkerung wurde geschätzt auf > 95% "homogen", wie durch mikroskopische Visualisierung der erfassten Zellen bestimmt. Die Kappen mit gefangenen Zellen wurden dann montiert auf 0,5 ml microcentrifage Röhren. Nach Mikrodissektion kann die DNA, RNA oder Protein aus Aliquoten microdissected Proben extrahiert werden.

Methylierungsanalyse

Genomische DNA aus den microdissected Zellinien erhalten, Magenkrebsgewebe und Plasma (0,2 ml ) wurde unter Verwendung DNAzol (Invitrogen) gereinigt. Gereinigte DNA wurde mit Natriumbisulfit (Sigma, Phoenix, USA) behandelt und dann durch BSP oder spezifische Polymerase-Kettenreaktion (MSP), wie zuvor beschrieben [13,15] analysiert. Amplifizierte Bisulfit-PCR-Produkte wurden in einen TA-Vektor-System (Promega) subkloniert, nach Anweisungen des Herstellers. DNA-Sequenzierung wurde an drei Einzelklone (Sangong) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt und visualisiert Ethidiumbromid-Färbung verwendet wird. Die verwendeten Primer sind in Tabelle S1 zusammengefasst.

Elektronenmikroskopische Beobachtung

H. pylori-Stämme
NCTC11637 (beide CagA- und VacApositive) wurden von Professor Guo von der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Parasitologie, Institute of Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine zur Verfügung gestellt. H. pylori
Stämme wurden auf Columbia-Agar-Basis routinemäßig für 72 h kultiviert (bioMérieux, Frankreich) mit 5% Schafblut in Mischluft 10% CO enthält _{2, 5% O2 und 85% N 2 bei 37 ° C. Dann wandelten wir H. pylori
zu flüssigen Medium, das Hirn-Herz-Infusion (BD, US), 10% Schafblut, und die gleichen Antibiotika wie jene in Columbia-Agar-Basis verwendet. Das flüssige Medium wurde auf einem Schüttler (Forma Scientific, USA) mit einer konstanten Drehzahl von 120 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. H. pylori
wurden unter Verwendung eines Spektrophotometers (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japan) und gewaschen mit sterilem PBS (pH 7,4, 5000 rpm, 10 min) vor dem Gebrauch gezählt. GES-1-Zellen (4 × 10 ^{5) angebaut wurden bis zur Konfluenz auf Glasabdeckung gleitet in Sechs-Well-Platten, und dann wurden GES-1-Zellen mit H infiziert. pylori
bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100: 1. Nach Inkubation für 24 h wurden die morphologischen Veränderungen der GES-1-Zellen unter Verwendung eines H-800 Transmissionselektronenmikroskop beobachtet.}}

Real-time qRT-PCR analysis

Purified Gesamt-RNA erhalten wurde, aus den microdissected Zellen wurde gesamt-RNA unter Verwendung von Trizol-Lösung extrahiert. Reverse Transkription (RT) wurde in einem 20 &mgr; l Reaktion durchgeführt gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Qiagen). Real-time qRT-PCR-Analysen wurden durchgeführt Primer in Tabelle S1 aufgelistet werden. Transkript-Expressionsniveaus wurden durch Quantifizieren der Intensität des Produkts normalisierten PCR bestimmt Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) expression. Quantitative Messung der mRNA-Spiegel wurde unter Verwendung des ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt. Diese Daten wurden unter Verwendung des Vergleichs Ct-Methode analysiert.

Western Blotting

Das Gesamtprotein wurde aus den Zellen extrahiert microdissected. Signal Proteinextraktionspuffer 1 System (430-7.608-SDB) von Bio-Rad Corporation wurde für die Proteinextraktion in unseren Experimenten verwendet, und die Konzentration wurde durch das DC-Protein-Assay-Verfahren von Bradford (Bio-Rad) gemessen. Insgesamt 100 ug Protein aus jeder Probe durch 10% SDS-PAGE-Gel und übertragen auf eine äquilibrierte Polyvinylidendifluorid-Membran (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) Die Proteine ​​durch verstärkte Chemilumineszenz (Amersham Corporation Arlington Heights, IL detektiert wurden getrennt wurden nach der Inkubation, USA) mit spezifischen primären Antikörper VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2.000), AKT (1: 1.000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3.000), ATF3 (1: 2.000) und IRX5 (1: 2000) bei 4 ° C über Nacht und dann der sekundäre Antikörper. Proteinwerte wurden normalisiert auf die Gesamt GAPDH unter Verwendung eines monoklonalen anti-GAPDH-Antikörper (Sigma), wie zuvor [15] beschrieben.

Konstruktion des Expressionsvektors für VEZT und TCF19

VEZT und TCF19 Überexpressionsvektor pEGFP -N1-VEZT und pEGFP-N1-TCF19 wurden unter Anwendung des Überlappungs-PCR oder PCR-Verfahren konstruiert, die jeweils und die Primer für die zwei Vektoren verwendet werden, die in Tabelle S1 zusammengefasst. Die PCR-Produkte wurden durch direkte DNA-Sequenzierung und kloniert in den Säuger-Expressionsvektor pEGFP-N1, wie zuvor beschrieben [15] bestätigt. MKN-45 und NCI-N87 wurden Magenkrebszelllinien für die Überexpression Studien verwendet. Wir erhielten stabil Klone transfiziert durch G418-Selektion (Promega). Ein stabiler Transfektant des pEGFP-N1 leeren Vektor wurde als Kontrolle verwendet. Zur Transfektion wurde gemäß Komplexe von Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) und eines der Plasmide oben erwähnt hergestellt den Anweisungen des Herstellers, und diese Komplexe wurden direkt mit den Zellen in 24-well Zellkulturplatten in einer Dichte von 4 gemischt × 10 ^{4 Zellen pro Vertiefung. Die Höhe der VEZT oder TCF19 Expression nach der Transfektion wurde durch real-time PCR getestet.}

Invasion, Migration und Bildung endothelialer Gefäße Assays

Zellinvasion, Migration und endotheliale Assays Tubusbildung wurden MKN unter Verwendung von -45 und NCI-N87-Zellen. Zellkultur wurde in Transwell Kammern (Corning, NY, USA) durchgeführt. Für die Invasion Assay wurden die Einsatzmembranen mit verdünnter Matrigel (San Jose, CA, USA) beschichtet. Zellen (1 × 10 ^{5) wurden in die obere Kammer gegeben und wurden für 48 h kultiviert. Für den Migrationstest wurden die Membranen Einsatz nicht mit Matrigel beschichtet, jedoch wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Schließlich wurden die Membranen Insert geschnitten und mit Kristallviolett (0,04% in Wasser; 100 ml) gefärbt, und die migrierten Zellen wurden unter einem umgekehrten Mikroskop gezählt und fotografiert wurden}

In vitro-Angiogenese wurde bewertet, indem eine verwendet wird. Bildung endothelialer Gefäße Assay-Kit (San Diego, CA, USA). Kurz gesagt wurde jede Vertiefung von vorgekühltem 96-well-Kulturplatten mit einer dünnen Schicht aus ECM-Gel beschichtet. HUVECs wurden in Überständen von transfizierten Zellen gesammelt, resuspendiert. HUVECs (2 x 10 ^{4 Zellen /Vertiefung) wurden mit 300 ml der Überstände auf die polymerisierten ECM-Gel zugesetzt. Nach 18-stündiger Inkubation wurde das Rohr Bildungsfähigkeit durch Bestimmung der Rohrnummer, die Rohrlänge und die Anzahl der rohrförmigen Kreuzungsknoten in fünf zufälligen Feldern Bild Pro Plus-Software (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA) ausgewertet nach zu Mirshahi Methode [19].}

das Zellwachstum und Soft-Assay
Agar Koloniebildung

Magenkrebszellen (2 x 10 ^{3-Zellen) wurden in 96 mit 100 &mgr; l Kulturmedium -multiwell Platten einen Tag bei 37 ° C in 5% CO _{2. Die Zellen wurden für 24 mit dem Plasmid transfiziert, 48, 72, 96 und 120 Stunden. Die Zellzahl wurde mit der Zellzählung Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan) bewertet. Kurz gesagt, CCK-8 (10 ul) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 1 h Inkubation bei 37 °, Extinktion bei 450 nm wurde mit der ARVO MX-Plattenleser (PerkinElmer, Massachusetts, USA) gemessen. Die Anzahl der Zellen wurde bei 450 nm durch die relative Extinktion bestimmt.}}

Magenkrebszellen wurden mit Trypsin behandelt, um Einzelzellsuspensionen von 3 x 10 ^{3-Zellen, und dann wurden in Platten mit sechs Vertiefungen in komplettem plattierten Kulturmedium 0,3% Agar oben auf 0,6% Agar geschichtet enthält. Die Platten wurden bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO _{2 für 16 Tage inkubiert. Kolonien mindestens 50 Zellen enthielten, wurden erzielt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von fünf zufällig erzielte Felder dargestellt.}}

Tumorwachstum in Nacktmäusen

Zellen (1 × 10 ^{6 Zellen in 100 ml) von Krebszellen Linien mit leerem Vektor oder einem VEZT Expressionsvektor transfiziert wurden gesammelt und subkutan in die rechte Flanke Regionen von 4-Wochen alten männlichen Balb /c Nacktmäuse (chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China) beimpft. Tumorknoten wurden alle 4 Tage mit einer Schieblehre gemessen. Die Mäuse wurden nach 1 Monat getötet. Tumorwachstumskurven und Wachstumshemmung Raten wurden berechnet. Zwei Mäuse für die Versuchs- und Kontrollgruppen wurden verwendet, und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt wie zuvor beschrieben [15,16].}

Globale cDNA-Mikroarray-Analyse und Zielgen Verifikations

Purified Gesamt-RNA von den microdissected Zellen erhalten. Das gesamte menschliche Genom Oligo-Microarray (Agilent, Santa Clara, CA, USA) verwendet. Nach der Hybridisierung und dem Waschen wurden die Mikroarray-Objektträger mit einem Agilent DNA-Mikroarray-Scanner gescannt. Die resultierenden Textdateien extrahiert von Agilent Feature Extraction Software (Version 9.5.3) wurden zur weiteren Analyse in die Agilent Genespring GX-Software (Version 7.3) importiert. Unterschiedlich wurden exprimierten Gene durch fold change-Screening identifiziert. Für Zielgen Überprüfung haben wir real-time PCR und Chromatinimmunpräzipitation Test. Die Primer für die Zielgene sind in Tabelle S1 aufgeführt.

durchflusszytometrische Analyse der Zellzyklus

Einen Tag vor der Transfektion wurden 1 x 10 ^{6 Zellen von MKN-45-Zellen wurden ausgesät in 6-Well-Kulturplatten ohne Antibiotika. Die Zellen wurden mit einem leeren Vektor oder einem TCF19 Expressionsvektor. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und über Nacht in 70% Ethanol bei -20 ° C fixiert und dann mit 250 &mgr; g /ml Propidiumiodid (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich) gefärbt und 5 mmol /L EDTA in PBS (pH 7,4) für 30 min. Der Zellzyklus-Analyse wurde durch FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) durchgeführt.}

Die statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit SPSS15.0 Software durchgeführt (SPSS Inc, USA). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei getrennten Experimenten ausgedrückt. Die Korrelation zwischen VEZT Expression in den Tumoren und klinisch-pathologische Variablen wurde mit dem Kruskal-Wallis-Rank-Test und der Mann-Whitney-U-Test berechnet. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden analysiert unter Verwendung des Student-t-Test und Chi-Quadrat-Test. Ein Wert von p
< 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Die Identifizierung und Charakterisierung neuer N-Glycan-basierten Biomarkern in Gastric Cancer
• PLoS ONE: Ein genetischen Polymorphismus in TOX3 ist im Zusammenhang mit Überleben von Magenkrebs in einem chinesischen Population