PLoS ONE: Die Überexpression und Biologische Funktion von Ubiquitin-spezifische Protease 42 in Magenkrebs

Abstrakt

Ubiquitin-spezifische Protease 42 (USP42) ist ein Mitglied der deubiquitinierenden Enzyme (DUBs). Die Veränderungen der DUBs sind an der Pathogenese einer großen Vielzahl von Tumoren beteiligt ist. Allerdings gibt es nur wenige Studien über die Expression und biologische Funktion von USP42 in Magenkrebs (GC). Dabei wurden die Expressionsniveaus von USP42 signifikant höher in GC Geweben als in nicht-tumorösen Gewebe. USP42 Expression signifikant mit der Tumorgröße, TNM-Stadium, Lymphknotenmetastasen und Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit GC korreliert. Außerdem zum Schweigen zu bringen USP42 in zwei GC-Zelllinien, AGS und MKN-45, insbesondere gehemmt Zellproliferation, aber G1 Phase Verhaftung stimuliert. Die Proteine ​​der Förderung des Zellzyklus (Cyclin D1, Cyclin E1 und PCNA) wurden in USP42-Zellen unterdrückt nach unten geregelt. Außerdem Hemmung der USP42 in GC-Zellen beeinträchtigt Zellinvasion durch die Expression von Matrixmetalloproteinasen beeinflussen (MMPs) und epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) Regler. Abschließend konnte USP42 Überexpression ein potentieller prognostischer Marker für GC sein, das Überleben und die invasiven Eigenschaften von GC zu regulieren und kann ein neues therapeutisches Zielmolekül für diesen Tumor darstellen

Citation:. Hou K, Zhu Z, Wang Y, Zhang C, Yu S, Q Zhu, et al. (2016) Die Überexpression und Biologische Funktion von Ubiquitin-spezifische Protease 42 in Magenkrebs. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10.1371 /journal.pone.0152997

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republik Korea

Empfangen: 29. Dezember 2015; Akzeptiert: 22. März 2016; Veröffentlicht: 31. März 2016

Copyright: © 2016 Hou et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Alle relevanten Daten sind in der Papier

Finanzierung:.. die Autoren haben erklärt, dass keine: Diese Studie wurde von Scientific Research Project von Shanghai Municipal Kommission für Gesundheit und Familienplanung (20124321)

Konkurrierende Interessen unterstützt wurde konkurrierenden Interessen bestehen.

Einführung

Magenkrebs (GC) die fünfthäufigste Krebs ist [1] und die dritthäufigste Ursache für Krebstod [2]. Derzeit bekannte Hauptrisikofaktoren für GC gehören Helicobacter pylori (H. pylori) Infektion, Lebensumfeld, Ernährung, genetische und Immunfaktoren und chronischen Magenerkrankungen [3]. Die Prognose bei Patienten mit GC ist im allgemeinen schlecht, da der Tumor oft und die meisten Patienten sind ältere metastasiert hat (Durchschnittsalter über 70 Jahre) an der Zeit diagnostiziert wird. Die 5-Jahres-Überlebensrate für GC wird berichtet, dass weniger als 25% [4]. Es ist von großer klinischer Bedeutung empfindliche diagnostische und prognostische Marker von GC zu identifizieren, die molekularen Mechanismen der GC Entwicklung zu untersuchen und neue Therapieziele dieser Krankheit erforschen.

Ubiquitin-spezifische Protease 42 (USP42) ist ein Enzym deubiquitinierenden (DUB), die weit verbreitet in verschiedenen menschlichen Geweben exprimiert wird [5]. Ubiquitinierung, eine reversible post-translationale Modifikation, in mehreren zellulären Prozessen beteiligt ist, wie Zellzyklus, die DNA-Reparatur und Apoptose [6, 7]. Zunehmende Beweise haben gezeigt, dass veränderte DUB Funktion bei der Pathogenese einer großen Vielzahl von Tumoren beteiligt ist [8]. Die Überexpression von USP9X, USP9Y, USP10 und USP25 wurde bei Brustkrebs durch zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Proteomanalyse [9] offenbart. Einige Studien haben gezeigt, dass USP22 Überexpression der Tumorprogression und einer schlechten Prognose von Gliomen, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Gebärmutterhalskrebs und Lungenkrebs [10-13] gefördert. USP42 wurde zuvor gefunden worden, bei akuter myeloischer Leukämie neu angeordnet werden [14]. Jedoch nach unserer Kenntnis wurde keine Untersuchung auf ein Niveau als bemerkenswert höher in den Kontrollen gefunden wurden, auf dem Expressionsmuster und biologischen Funktionen von USP42 in GC.

In der vorliegenden Studie, USP42-mRNA-Spiegel in GC Geweben durchgeführt wurden . Weitere klinische Merkmale Analyse zeigte, dass Expression von USP42 mit Gesamtüberleben von GC Patienten in Verbindung gebracht wurde. Wir wendeten dann RNA-Interferenz (RNAi) Technologie, um die Expression von USP42 in zwei GC-Zelllinien (AGS und MKN-45-Zellen) zu klopfen, und untersuchte die Proliferation, Zellzyklus und invasive Kapazität in beiden Zelllinien. Unsere Daten deuten darauf hin, dass USP42 ein potenter Onkogen in GC ist, uns mit einem zukünftigen Ziel für die GC-Therapie.

Materialien und Methoden

Gewebeproben

Insgesamt 90 GC Patienten Chirurgie an der Klinik für Allgemeine Chirurgie, Volkskrankenhaus, Pudong New District (Shanghai, China) zwischen Februar 2007 und Juni 2009 wurden in dieser Studie unterzogen eingetragen sind. Das mittlere Alter der Patienten betrug 56 Jahre (Bereich: 34-68 Jahre). Alle Patienten wurden schriftliche Einverständniserklärung gegeben. Die Studie wurde von der unabhängigen Ethik-Kommission der Shanghai Pudong District Volkskrankenhaus (Shanghai, China) genehmigt. Tumorgewebeproben wurden von allen GC Patienten erhalten. Inzwischen 42 abgestimmt nicht tumoröse samples > 3 cm entfernt von dem Tumor gesammelt wurden. Alle chirurgischen Proben wurden in flüssigem Stickstoff unmittelbar nach der chirurgischen Resektion eingefroren und bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion gelagert.

Zelllinien

Die Zelllinien aus menschlichen Magenkrebs, einschließlich AGS, SGC-7901, BGC-823, MKN-28 und MKN-45 wurden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie, chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten. Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium (Gibco, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika, bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _{2 gehalten}

Silencing von USP42 von small interfering RNA (siRNA)

siRNA spezifisch für humanes USP42 (5'-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 '), wurden ausgewählt. Eine nicht-spezifische siRNA Scramble-Sequenz (SINC) wurde als negative Kontrolle verwendet. Die siRNAs wurden transfiziert transient in AGS oder MKN-45-Zellen unter Verwendung von lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Tests wurden 48 Stunden nach der Transfektion durchgeführt.

Real-time PCR

Die Gesamt-RNA extrahiert wurde mit Trizolreagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Reverse-Transkriptase-Reaktion wurde mit zufälligen Hexamer-Primer und ein hochgestelltes Reverse-Transkriptase (Invitrogen) durchgeführt. Die sich ergebende cDNA wurde als Matrize für die Echtzeit-PCR durchgeführt mit einem Standard SYBR Green PCR kit (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) auf ABI7300 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) Thermocycler verwendet. GAPDH wurde als Kontrolle der Eingangs RNA-Ebene verwendet. Alle Reaktionen wurden unter Verwendung der folgenden Zyklusparameter durchgeführt wird, 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 45 s. Auf spezifische Amplifikationsprodukt zu überprüfen, wurden die Produkte dann zur Dissoziation Kurvenanalyse unterzogen. Die Genexpression wurde mit der Δ Ct-Methode berechnet. Alle Daten stellen den Durchschnitt von drei Replikaten. Die Sequenzen spezifischen Primer waren wie folgt: USP42 mRNA vorwärts, 5'- ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 'und USP42 mRNA-Rückwärts, 5'ACGCAGATTGGAACAGAG-3'; GAPDH mRNA nach vorn, 5 'CACCCACTCCTCCACCTTTG-3' und GAPDH mRNA umgekehrt, 5 'CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'.

Antikörper und Western-Blot

Antikörper gegen CyclinD1, E-Cadherin, β Catenin, snail1 und GAPDH wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) erworben. Antikörper gegen USP42, CyclinE1, PCNA und MMP-9 wurden aus Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-MMP-2 wurde aus Epitomics (Burlingame, CA, USA). Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper wurden von Beyotime Biotechnology (Shanghai, China).

Zellen dreimal mit PBS gewaschen wurden und dann lysiert in vorgekühlten Radioimmunpräzipitation (RIPA) Assaypuffer auf Eis für 10 min. Nach dem Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation (12.000 g, 10 min), die Proteinkonzentration der Überstände wurde mittels BCA-Protein-Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Nach dem Kochen für 5 Minuten in Probenpuffer, gleiche Menge an Proteinen von verschiedenen Gruppen wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf auf eine Nitrocellulosemembran (Millipore, Bredford, USA) überführt. Nachdem mit 5% Magermilch blockiert, wurden die Membranen mit den primären Antikörpern bei 4 ° C über Nacht unter Schütteln inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit unter Rühren Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur entspricht. Reactive Protein wurde dann nachgewiesen unter Verwendung von ECL-Chemilumineszenz-System (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Zellproliferationsassays von CCK-8

Der CCK-8-Assay wurde durch Standardverfahren durchgeführt in 96-Well-Platten. Kurz gesagt, 3 x 10 ^{3 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Bei der angegebenen Zeitpunkt, CCK-8-Lösung (10 ul in 100 ul RPMI-1640-Medium) wurde 1 h in jede Vertiefung und inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerät erkannt.}

In vivo Tumornacktmäuse Modell Lager

Tierversuche wurden genehmigt und durchgeführt nach den Richtlinien von Animal Care und Use Committee von Shanghai Pudong Bezirk Volkskrankenhaus (Shanghai, China). Zwölf Balb /c Nacktmäuse im Alter von 4-5 Wochen alt (SLAC Tier, Shanghai, China) wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten mit einem laminaren Luftstrom Rack und hatte kontinuierlichen freien Zugang zu sterilisierte Lebensmittel und autoklaviert Wasser. Die Experimente wurden nach 1 Woche der Akklimatisierung gestartet. AGS-Zellen (2 × 10 ^{6) wurden subkutan in die rechte Flanke von Nacktmäusen injiziert, um Xenotransplantat tumortragenden Modell etablieren. Zehn Tage nach der subkutanen Injektion wurden die Mäuse zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt (n = 6 /Gruppe) und IV injiziert USP42 siRNA oder sinc Formulierungen zweimal pro Woche enthält. Die kürzeste und längste Durchmesser des Tumors wurden mit einer Schieblehre gemessen in 4-Tages-Intervallen, und das Tumorvolumen (mm 3) wurde mit der folgenden Standard-Formel berechnet: (der kürzeste Durchmesser) 2 × (der längste Durchmesser ) × 0,5. 36 Tage nach Tumor Platzierung wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet und die Tumoren wurden gewonnen. Die Nassgewichte jedes Tumors untersucht. Während der Versuchsdurchführung wurden alle Mäuse täglich überwacht. Keine Mäuse vor dem experimentellen Endpunkt starb.}

Zellzyklusanalyse

Die Zellen trypsinisiert wurden, zweimal in PBS gewaschen und über Nacht bei 4 ° C in eiskaltem 70% Ethanol fixiert. Die Zellen wurden dann zweimal in PBS gewaschen und in Propidiumiodid (PI) Färbepuffer (5 &mgr; g /ml PI und 0,25 mg /ml RNase, Sigma, St. Louis, MO, USA) bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die Zellen wurden dann analysiert, ein unter Verwendung eines FACScan Durchflusszytometrie (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) verwendet wird. Der prozentuale Anteil der Zellen in G0 /G1, S und G2 /M-Phase wurden durch eine PI-Färbung bestimmt.

Zellinvasionsassays

die Zelle invasive Potential von Zellen zu messen, wurden Transwell-Assays durchgeführt unter Verwendung von eine Matrigel-beschichteten Boydenkammer (BD Biosciences). Zellen wurden über Nacht, geerntet und resuspendiert in einem serumfreien Medium serumausgehungerten. Zellen (1 × 10 ^{5) wurden dann in die obere Kammer zugegeben. Medium, das 10% FBS wurde in die untere Kammer gegeben. Nachdem die Zellen 24 Stunden bei 37 ° C inkubiert wurden, wurden die Zellen auf der oberen Oberfläche der Membran vollständig unter Verwendung von Spitzen Baumwolle entfernt. Die Wanderzellen an der unteren Fläche befestigt wurden in 4% Paraformaldehyd und gefärbt mit 0,5% Kristallviolett fixiert. Die Anzahl der migrierten Zellen auf der unteren Fläche der Membran wurde in fünf Feldern bei 100 × unter einem Mikroskop gezählt.}

Bioinformatik Analyse

Magenkrebs Datensätze wurden von der NCBI Gene Expression Omnibus Datenbank heruntergeladen (Access-ID: GSE26253) und das Krebs-Genom-Atlas (TCGA). Um die biologische Pfade untersuchen beteiligt bei Magenkrebs Pathogenese durch USP42 Weg, stellen Gene Anreicherungsanalyse (GSEA) wurde der öffentlich verfügbaren Software vom Broad Institute des MIT durchgeführt unter Verwendung von (http://www.broad.mit.edu/gsea/Software /software_index.html), wie zuvor beschrieben [15]. Für jedes Gen-Set definiert GSEA eine Bereicherung Score (ES), die die Korrelation zwischen dem Gen-Set und der Probe reflektiert.

Die statistische Analyse

Kaplan-Meier-Überlebensanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung von Medcalc ( mariakerke, Belgien). Das Statistische Paket für Sozialwissenschaften (SPSS) Version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) wurde für die weitere statistische Analyse verwendet. Ergebnisse der Experimente sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Student-t-Test wurde verwendet, um Werte von Test- und Kontrollproben zu vergleichen. Chi-Quadrat-Test wurde zu identifizieren Unterschiede zwischen kategorischen Variablen verwendet. Statistisch signifikante Unterschiede wurden definiert, um eine als mit P
. ≪ 0,05

Ergebnisse

• PLoS ONE: Schutz Rolle von Helicobacter-pylori-Infektion in der Prognose von Magenkrebs: Der Nachweis von 2.454 Patienten mit Ulcus Cancer
• PLoS ONE: Die Umlauf MicroRNA-26a in Plasma und sein Potential diagnostischen Wert in Gastric Cancer