PLoS ONE: Snail-Reguleret MIR-375 inhiberer Migration og Invasion af Gastric Cancer Cells ved Målretning JAK2

Abstrakt

MikroRNA'er (miRNA) er blevet rapporteret til at spille en afgørende rolle i cancer invasion og metastase. Vores tidligere undersøgelse viste, at MIR-375 hyppigt nedreguleret i mavekræft undertrykker celleproliferation ved at målrette Janus kinase 2 (JAK2). Her har vi endvidere fundet, at ekspressionsniveauet af MIR-375 er væsentligt reduceret i metastatiske gastrisk cancer væv sammenlignet med de ikke-metastase kontroller. Ektopisk udtryk for miR-375 hæmmer migration og invasion af gastriske kræftceller delvist ved at målrette JAK2. Desuden er MIR-375-ekspression reguleres negativt af metastase associeret transkriptionsfaktor sneglen, som direkte binder til den formodede promotor af MIR-375. Desuden kan overekspression af sneglen delvist vende inhiberingen af ​​gastrisk cancer cellemigrering forårsaget af MIR-375. Tilsammen antyder disse data, at miR-375 kan blive negativt reguleret af Sneglen og involveret i gastrisk kræft celle migration og invasion potentielt ved at målrette JAK2

Henvisning:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Huang Z, Deng Y, du T, et al. (2014) Snail-Reguleret MIR-375 inhiberer Migration og Invasion af Gastric Cancer Cells ved Målretning JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10,1371 /journal.pone.0099516

Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA

Modtaget: Februar 7, 2014 Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet: 23 Juli 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Natural Scientific Foundation of China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 og 31100975), Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina (2013CB945603, 2012CB945004 og (2011CBA01001), Undervisningsministeriet Kina (20110101110103 og (20130101120001), Natural Scientific Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 og Y2100106), den 111 Project (B13026), grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (2014QNA7015) og Zhejiang Provincial Program til dyrkning af højt niveau Innovative Health talenter. det finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Metastase er den mest forfærdelige aspekter af kræft og er blevet undersøgt i mere end 100 år [1], [2]. I mavekræft, den høje dødelighed attributter hovedsageligt forsinket diagnose på grund af manglen på specifikke symptomer i tidligt stadium. Og metastase er ansvarlig for mavekræft dødelighed [3], [4]. Migration og invasion af kræftceller er væsentlige processer i løbet kræft metastatisk procession, der består af en række indbyrdes forbundne foranstaltninger, herunder spredning, detachement, omløb, transport, anholdelse i organer, overholdelse af karvæggen, ekstravasation, etablering af et mikromiljø, og spredning i fjerntliggende organer. I mavekræft celler invasion i det omgivende væv er et afgørende tidlig trin [3], [5]. Men mekanismerne i gastrisk cancerceller migration, invasion og metastase er ikke fuldt forstået.

I de senere år forskellige molekyler, fx vækstfaktorer, cytokiner, ekstracellulære matrix-remodeling molekyler, og nogle transskriptionsfaktorer såsom Snail, Twist og ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], er blevet afsløret for at drive udviklingen af ​​kræftceller migration, invasion og metastase. På det seneste er det blevet klart, at der ud over abnormaliteter i protein-kodende gener, ændringer i ikke-kodende gener kan også bidrage til migration kræftceller, invasion og metastase, såsom miRNA, som er en klasse af små enkeltstrengede ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer genekspression med stort potentiale og har været impliceret i reguleringen af ​​kræftceller migration, invasion og metastase som aktivatorer eller undertrykkere [12], [13], [14], [15], [16] . Til dato har et antal miRNA blevet undersøgt for at være impliceret i gastrisk cancer metastase progression, for eksempel MIR-218, MIR-9, MIR-7, og MIR-146a [6], [17], [18], [19]. Vi har undersøgt sammenhængen mellem specifikke fejlreguleret miRNA og specifik metastaser trin af mavekræft, som vil give indsigt i de potentielle mekanismer i gastrisk kræftceller migration, invasion og metastase.

I vores tidligere undersøgelse, miR-375 var signifikant nedreguleret i mavekræft og hæmmede gastriske kræftceller spredning ved at målrette JAK2 [20]. Interessant i den foreliggende undersøgelse har vi yderligere fundet, at ekspressionsniveauet af MIR-375 var endnu lavere i gastrisk cancer prøver fra metastase-positive patienter compaired med det fra metastase-fri patienter. Foreslog vi, at miR-375 kan have en kausal rolle i mavekræft metastaser. Vores undersøgelser afsløret, at ektopisk udtryk for miR-375 hæmmede migration og invasion af gastriske kræftceller også delvist ved at målrette JAK2. Vi yderligere bedt om at finde ud af hvordan miR-375-ekspression blev reguleret i mavekræft. Resultaterne viste, at miR-375 var et mål af metastaser associeret transkriptionsfaktor Sneglen og dens udtryk var omvendt korreleret med Snail i mavekræft. Overekspression af Snail kan delvis vende inhiberingen af ​​gastrisk cancer cellemigrering forårsaget af MIR-375. Således er vores resultater viser, at miR-375 hæmmer gastrisk migration og invasion kræftceller gennem Snail /miR-375 /JAK2 regulering vej.

Materialer og metoder

Kliniske prøver (Etik Statement) og celle linjer

Klinisk mavekræft prøver og deres pair-matchede ikke-maligne gastriske prøver fra 39 patienter, der gennemgår mavekræft resektion blev leveret af Sir køre køre Shaw Hospital (Hangzhou, Kina). Alle prøverne blev indsamlet med skriftligt samtykke fra de patienter, som tidligere [20] beskrevet. Begge gastrisk tumorvæv og tilstødende nontumorous gastrisk væv, der indsamles efter operationen var og opdelt i to dele. En blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart til yderligere anvendelse, blev en anden del lagres i formalin i patologi analyse. De involverede i vores undersøgelse patienter blev separeret i metastase-fri og metastase-positive grupper (9/30). De gastrisk cancer cellelinjer (AGS og MGC-803) og en ikke-malign gastrisk epitelcelle linje (GES-1) blev beskrevet tidligere [20].

RNA-ekstraktion

Total RNA fra gastrisk prøver og cellelinjer blev ekstraheret under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, TX, USA) ved at følge producentens protokol.

Kvantitativ realtids-PCR-analyse

ekspressionen af ​​mIR-375 blev analyseret under anvendelse af Taqman miRNA tests (Applied Biosystems, CA, USA) med specifikke primere (P /N: 4.373.151, Applied Biosystems). Revers transkriptionsreaktion blev udført startende fra 10 ng af total RNA under anvendelse af de loopede primere. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) blev udført ved hjælp af standard Taqman miRNA tests protokol om ABI7500 Real-Time PCR Detection System. Den ΔΔCt fremgangsmåde til relativ kvantisering blev anvendt til bestemmelse miRNA ekspression. Ct er den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen af ​​hver prøve passerer fast tærskelværdi. Den ACt blev beregnet ved at fratrække Ct af snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4.373.381, Applied Biosystems) fra Ct af miRNA af interesse. Den ΔΔCt blev beregnet ved at fratrække ACt for referenceprøven (parret ikke-malignt væv til kirurgiske prøver, normale væv og GES-1 celle til gastriske cancercellelinier) fra ACt af hver prøve. Fold ændring blev bestemt som 2 ^-ΔΔCt.

Migration og invasion assay

Celler blev transficeret med 20 nM pre-miR-375 eller negativ kontrol ved hjælp af transfektion Agent (Ambion, TX, USA) efter producentens protokol i plader med 24 brønde. 24 timer efter transfektion blev Transwell migration assay og Matrigel invasion assay udføres separat brug af 24-brønds Transwell skær med 8 um porestørrelse (Corning Costar Corp.). For Transwell migration assay, 2 × 10 ^{4 AGS eller 3 × 10 4 MGC-803 celler suspenderet i 100 pi tilsvarende dyrkningsmedium uden kalvefosterserum (FBS) blev fyldt i den øverste kammer i Transwell insert med ikke overtrukne membran. For Matrigel invasion assay, 5 x 10 4 AGS eller MGC-803 celler blev udpladet i 100 pi serumfrit medium i den øvre Matrigelcoatede kammer i stedet. I begge assays blev den nederste kammer indeholdende 600 pi medium med 20% FBS. Celler blev derefter lov til at migreret eller invaderet i 12 timer ved 37 ° C. Cellerne, som vandrede eller invaderet i bundkammeret blev fikseret, farvet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1000), visualiseret under fasekontrastmikroskop og fotograferet. Samlet antal af migrerede eller invaderede celler blev talt af IPP (Image-Pro Plus 6.0) software. Alle eksperimenter blev uafhængigt gentages mindst tre gange.}

Scratch-sårheling assay

Celler blev transficeret som beskrevet tidligere og fik lov at vokse til konfluens. Cellerne blev derefter dyrket i tilsvarende medium uden FBS i 12 timer og derefter ridset med en pipettespids. Wound områder blev mærket og fotograferet ved 0 t, 12 timer, 24 timer og 36 timer henholdsvis. Satsen for migration celler blev vurderet af både fotografere og kvantificere migrerede afstand af celler flyttet fra sårkanten mod midten ved hjælp af IPP 6.0-system. Alle forsøg blev gentaget tre gange.

Konstruktioner Salg

Til fremstilling pGL3-375pro plasmid DNA sekvens, der indeholder PRI-MIR-375 (primær MIR-375) promotoren blev amplificeret ved RT-PCR under anvendelse af primerne 5'-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 'og 5'-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3' og derefter klonet ind pGL3-basic Vector (Promega). Til konstruktion af plasmid, der udtrykker Snail i celler, blev den åbne læseramme (ORF) sekvens af Snail klonet i mammale ekspressionsvektor pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) ved anvendelse af primerne 5'- ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 'og 5'-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3'. For ektopisk udtryk for FLAG-mærket JAK2 blev menneske JAK2 med kodende region klonet i pCMV-Tag 2C vektor. Til konstruktion af plasmid, der udtrykker MIR-375 i pattedyrceller, de parrede oligonukleotider baseret på den primære sekvens af har-MIR-375 og dets flankerende regioner blev klonet ind mammale ekspressionsvektor pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Alle konstruktioner blev bekræftet ved sekventering.

Luciferase assay

Fyrre tusinde celler blev podet i plader med 24 brønde 24 timer før transfektion. Celler blev transficeret med enten pGL3-375pro eller pGL3-Basic vektor. Den pRL-TK vektor (Promega, WI, USA), der indeholder Renilla
luciferase blev også cotransficeret som en reference kontrol. Firefly og Renilla
luciferaseaktiviteter blev målt ved hjælp af Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) 24 timer efter transfektion. Ildflueluciferase aktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.

statistiske analyser

Data er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SE) af tre uafhængige forsøg. Forholdet mellem ekspression af miR-375 og udtryk for Snail mRNA blev udforsket af Pearsons
korrelationskoefficient, som blev beskrevet tidligere [20]. Studerendes t
-test og X
^{2 test blev udført for at bestemme statistisk signifikans. P
< 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant}

Resultater

MIR-375 er dramatisk nedreguleres i mavekræft celler og væv fra metastase-positive patienter
.

for at finde ud af, om mIR-375 er forbundet med gastrisk cancer metastase, vi først opdaget ekspressionsniveauet for mIR-375 i primære gastrisk cancer væv fra metastase-positive og metastase-fri patienter. Sammenlignet med prøver fra metastase-fri patienter, ekspressionsniveauet af MIR-375 var næsten to gange reduktion i væv fra metastase-positive patienter ( P
< 0,05) (figur 1A). I tråd med dette resultat, blev udtrykket niveau af miR-375 i gastrisk cellelinjer negativt forbundet med evner migration og invasion celler. De metastatiske egenskaber af gastrisk epiteliale cellelinier (GES-1, MGC-803, AGS) blev karakteriseret. Som vist i figur 1C og 1D, migration og invasion evner af AGS-cellelinie var større end den af ​​MGC-803 og GES-1 cellelinjer ( P
< 0,01). Omvendt MIR-375 ekspression i AGS-celler var lavere end den for MGC-803 og GES-1-celler ( P
< 0,01) (figur 1B). I et ord, er miR-375 nedreguleret i gastrisk kræft væv fra metastase-positive patienter og gastriske kræftceller med større migration og invasion evner. Denne sammenhæng indikerer, at miR-375 kan have en kausal rolle i mavekræft metastaser.

Overekspression af miR-375 hæmmer gastrisk migration kræftceller og invasion

For at udforske den rolle, miR-375 i gastrisk cancer metastaser undersøgte vi effekten af ​​miR-375 overekspression på migration og invasion af AGS og MGC-803 gastriske cancerceller med lav endougenous udtryk for miR-375. Celler blev transficeret med enten MIR-375 precursor (MIR-375) eller precursor-negativ kontrol-oligonukleotider (negativt) eller ingen af ​​ovenstående (Mock). Transwell migration assay viste, at overekspression af MIR-375 spænder inhiberede migration af AGS (figur 2A, 2B) og MGC-803 celler (figur S1a, S1B). I overensstemmelse med disse resultater, scratch-sårheling assay viste også, at hastighederne af AGS (figur 2C, 2D) og MGC-803 celler (figur S1c, S1D) migrering til sårområdet blev væsentligt reduceret efter overekspression af MIR-375 . Vi yderligere anvendte Matrigel invasion assay og fundet, at overekspression af MIR-375 førte til en mere end to-fold reduktion i invasive egenskaber af AGS (figur 3a, 3b) og MGC-803 celler (figur 3C, 3D). Kollektivt, disse resultater viser, at overekspression af miR-375 er tilstrækkelig til at hæmme både migration og invasion evner gastriske kræftceller.

MIR-375-regulerede JAK2 er involveret i reguleringen af ​​gastrisk migration og invasion kræftceller

Vores tidligere undersøgelse har identificeret JAK2 som en downstream mål for miR-375 [20]. Her er vi interesseret i at studere, om JAK2 er involveret i reguleringen af ​​gastrisk migration og invasion kræftceller. Vi ansat vektor-baserede RNAi teknik til at udtømme endogene JAK2 og fandt, at migrations- og invasion aktiviteter af AGS (figur 4) og MGC-803 celler (Figur S2) begge blev hæmmet betydeligt. Samtidig undersøgte vi, om JAK2 kunne modvirke inhibering virkning af gastrisk migration og invasion cancerceller forårsaget af MIR-375. Celler blev co-transficeret med MIR-375 precursor og enten JAK2 overekspression vektor (MIR-375 + JAK2) eller kontrol tom vektor (MIR-375 + Vec). Overekspression af JAK2 klart fremmet celler migration og invasion som vist i figur 4 og S2. Således i overensstemmelse med vores hypotese, kan miR-375 hæmme migration og invasion af gastriske kræftceller delvist ved at målrette JAK2. Vi yderligere bestemt, at JAK2 overekspression har nogen virkning på ekspressionsniveauet af MIR-375 som vist i figur S3. Men vi kan ikke udelukke muligheden for, at dysregulering af miR-375 interfererer med andre mål, der er nødvendige for gastrisk migration og invasion kræftceller.

Snail nedregulerer miR-375 udtryk

Ovenstående resultater viser, at mIR-375 kan målrettes ved visse transkriptionsfaktorer, som er forbundet med cancer invasion og metastase proces. Naturligvis har vi fokus på, hvordan miR-375 ekspression reguleres. Vi fandt ud af en samtalte DNA-region opstrøms for PRI-MIR-375-genet, som blev rapporteret at indeholde PRI-MIR-375-genpromotoren [21]. Vi derefter udført Consite programmet (http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) og fandt, at der var seks bindingssteder af transkriptionsfaktor sneglen i DNA-området (figur 5A). DNA-regionen blev klonet i pGL3-Basic Vector (Promega) (pGL3-375pro) til måling af promotoraktiviteten. I overensstemmelse med data fra Walker gruppe [21], viste vores resultater, at denne DNA-region indeholder PRI-MIR-375-genpromotoren og kan styre luciferaseekspression (figur 5B). Luciferaseaktivitet blev effektivt undertrykt da pGL3-375pro vektoren blev cotransficeret med Snail ekspressionsvektor (Snail), men ikke når cotransficeret med den tomme kontrolvektor (Mock) (figur 5C). Desuden kunne sneglen overekspression reducere ekspressionsniveauet af MIR-375 med 46% (figur 5D). For at bestemme den kliniske relevans af disse resultater, vi yderligere korreleret ekspressionsniveauet for MIR-375 med sneglen mRNA-niveauet i de samme mavecancerpatienter. Som vist i figur 5E, var en særskilt omvendt korrelation fundet mellem ekspressionsniveauet af MIR-375 og sneglen mRNA ( P
< 0,05, r = -0.6). Derfor disse observationer viser, at Snail er en potentiel opstrøms regulator af miR-375 udtryk.

Snail er involveret i reguleringen af ​​gastrisk migration kræftceller ved at målrette miR-375

For yderligere at belyse korrelation af miR-375 og Snail, vi studerede, om Snail er involveret i reguleringen af ​​gastrisk migration kræftceller ved at målrette miR-375. Vi anvendte vektor-baseret teknik til at opregulere sneglen ekspressionsniveau og fandt, at migration aktivitet af AGS-celler (figur 6) blev fremmet betydeligt. Samtidig studerede vi, om Snail kunne modvirke hæmning effekten af ​​migration gastrisk cancerceller forårsaget af miR-375. Celler blev co-transficeret med MIR-375 overekspression vektor og snail overekspression vektor (Snail + MIR-375). Overekspression af Snail klart fremmet celler migration og kunne delvis modvirke inhibering virkning migration gastrisk cancerceller forårsaget af MIR-375 som vist i figur 6. Således i overensstemmelse med vores hypotese, kan sneglen inhibere migreringen af ​​gastriske cancerceller delvis ved at målrette miR-375.

diskussion

miRNA er blevet rapporteret til at regulere tumor migration, invasion og metastase, herunder gastrisk kræft [6], [22]. MIR-375 er tidligere blevet påvist at spille en vigtig rolle i gastrisk cancerceller proliferation [20], [23]. Men de regulatoriske mekanismer fortsat uklare. I den foreliggende undersøgelse har vi yderligere udforsket funktion og potentielle mekanismer MIR-375 i migration og invasion af gastriske cancerceller. Vi fandt, at overekspression af miR-375 hæmmede proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller delvist ved at målrette JAK2. Det har været over et årti siden JAK2 først blev klonet [24]. JAK2 udtrykkes i næsten alle væv og associeret med mange patologiske skrider frem. Selv om det er indlysende, at JAK2 fungerer som et onkogen i både myeloproliferative sygdomme og nogle faste tumorer [25], [26], [27], ikke direkte involveret i JAK2 i migration cancer, har invasion eller metastase er rapporteret. Spændende, vores undersøgelse først påvist, at vælte JAK2 af RNAi hæmmede migrationen og invasion aktiviteter af gastriske kræftceller ligner den for overekspression af miR-375. Desuden kunne overekspression af JAK2 fremme migration og invasion af gastriske cancerceller. Således har vi antaget, at JAK2 kunne modvirke den hæmmende virkning på migration celler og invasion forårsaget af miR-375. I betragtning af den kritiske rolle miR-375 og JAK2 som master-regulatorer i gastrisk kræftceller spredning, migration og invasion, begge af dem har terapeutisk potentiale i mavekræft behandling. Derfor er det fortsat undersøges, om der er andre mål deltager i miR-375 medieret gastrisk metastaser.

Af særlig interesse, vi yderligere undersøgt, hvordan miR-375 involveret i gastrisk carcinogenese. Selv om der er en indlysende, at DNA-methylering og histondeacetylering er de mulige mekanismer involveret i nedregulering af miR-375 i gastrisk kræft [23]. Mekanismerne bag miR-375 dysregulering i mavekræft metastaser stadig dårligt forstået. Der er mulighed for en transkriptionel blokering af MIR-375-genekspression i denne proces. Her viser vi, at metastase associeret transkriptionsfaktor Sneglen er en potentiel opstrøms regulator af MIR-375-ekspression. Sneglen er en DNA-bindende zinkfinger-protein og er blevet rapporteret som transskriptionsrepressor [28]. Acumulating beviser viser, at Snail binder til E-kasser i promotoren for E-cadherin og undertrykker sin transskription at regulere tumor invasion udvikling [29]. Desuden blev overekspression af Snail i kræft fundet at være forbundet med lymfeknude metastase, tumor tilbagefald og prognose [30], [31], [32], [33], [34], [35]. I overensstemmelse med andre rapporter, vores undersøgelse fandt, at Snail mRNA overudtrykt i mavekræft væv sammenlignet med deres tilstødende ikke-maligne væv. Som promotoraktiviteten af ​​MIR-375 kunne undertrykkes ved Sneglen og overekspression af Snail kunne reducere MIR-375 ekspressionsniveauet signifikant, vi yderligere fundet en tydelig omvendt korrelation mellem ekspressionsniveauet af MIR-375 og niveauet af Snail mRNA i gastrisk cancer prøver. Snail er også fundet at være involveret i reguleringen af ​​gastrisk migration kræftceller ved at målrette miR-375.

Som konklusion, vi har identificeret, at miR-375 aberrant blev udtrykt i mavens kræft væv fra metastase-positive patienter eller gastrisk cancer celler med større migration og invasion aktiviteter sammenlignet med væv fra metastase-fri patienter eller ikke-invasiv gastrisk epitelcellelinie GES-1 hhv. Overekspression af miR-375 reducerede gastriske migration og invasion kræftceller aktiviteter i det mindste delvist ved at målrette JAK2. Desuden kan Snail være en opstrøms regulator af miR-375, som negativt regulerer ekspressionen af ​​miR-375 og var involveret i reguleringen af ​​gastrisk migration kræftceller ved at målrette miR-375. Sammen vore resultater tilvejebringer et ubeskrevet pathway, i hvilken en transskriptionsfaktor Sneglen regulerer ekspressionen af ​​MIR-375, som undertrykker dens direkte mål JAK2, hvilket fører til at inhibere migrering og invasion af gastriske cancerceller. Vores data viser, at restaurering af miR-375 eller hæmning af Snail eller JAK2 kan være nyttige terapeutiske strategier for mavekræft behandling. Det vil helt sikkert være meget interessant til yderligere at udforske potentielle effektivitet af disse molekyler rettet mod miR-375, JAK2 eller Snail i behandlingen af ​​mavekræft. Et andet interessant emne for fremtidig forskning vil være at identificere andre mulige mål af miR-375, og mere specifikt den mulige inddragelse af JAK2 i mavekræft metastaser.

Støtte oplysninger
figur S1.
Ektopisk udtryk for miR-375 undertrykker migration af MGC-803 celler. MGC-803-celler transficeret med MIR-375 precursor (MIR-375), negativ kontrol (negativ) eller ingen af ​​de ovennævnte (Mock) blev underkastet Transwell migration assay (A) og ridser sårheling analyse (C). (A) Repræsentative områder af invasive celler på undersiden af ​​membranen, som blev fikseret og farvet med DAPI. (B) Samlet antal af migrerede celler på undersiden af ​​membranen blev talt af IPP 6.0 software. (C) migration cellerne til sårede område blev fotograferet ved mikroskopi ved 0 timer, 12 timer, 24 timer og 36 timer efter sårdannelse. De stiplede linjer angiver de områder, der mangler celler. (D) Satsen for migration blev undersøgt ved at måle afstanden af ​​celler flyttet fra sårkanten mod midten i 36 timer efter at ridse. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SE af mindst tre uafhængige forsøg. Barer, 50 uM. * P
< 0,05, ** P
< 0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099516.s001
(TIF)
Figur S2 .
Overekspression af JAK2 vender miR-375-induceret hæmning af MGC-803 celler migration og invasion. Cellerne transficeret med de anførte vektorer eller oligonukleotider blev reageret Transwell migration (A) eller Matrigel invasion assay (C). For redning forsøg til MIR-375 overekspression blev udført ved ektopisk ekspression af JAK2 uden 3'-UTR i MIR-375-behandlede celler. (A, C) Repræsentative områder af cellerne på bunden kammer ved 12 timer efter migration eller invasion blev vist. Målestokke 50 uM. (B, D) Det samlede antal af migrerede eller invasive celler fra ni tilfældigt udvalgte felter blev talt af IPP 6.0. * P
< 0,05, ** P
< 0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099516.s002
(TIF)
Figur S3 .
JAK2 har ingen effekt på miR-375-ekspression. AGS og MGC-803 celler blev transficeret med JAK2 overekspression vektor eller kontrol vektor og underkastet RT-PCR-analyse for ekspressionsniveauet af MIR-375. Niveauet af RNA U6 blev brugt som kontrol
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099516.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Effekt Evaluering af Subtotal og alt Gastrectomies i Robotic Surgery for mavekræft sammenlignet med i Open og laparoskopisk resektion: en meta-analyse
• PLoS ONE: antitumorvirkninger af en sirtuin Inhibitor, Tenovin-6, mod mavekræft Cells via Død Receptor 5 Up-forordningen