PLoS ONE: MicroRNA-137 Bidrager til afdæmpet tumorigenese i Human Gastric Cancer ved Målretning AKT2

Abstrakt

miRNA spiller en vigtig rolle i tumorigenese. Denne undersøgelse fokuserer på at udforske effekter og reguleringsmekanisme af miRNA-137 på de biologiske adfærd af mavekræft. Totalt RNA blev ekstraheret fra væv af 100 patienter med gastrisk cancer og fra fire gastriske cancercellelinier. Ekspression af MIR-137 blev detekteret ved real-time PCR fra 100 patienter. Virkningerne af MIR-137 overekspression på gastriske kræftcellernes proliferation, apoptose, migration og invasion evne blev undersøgt in vitro og in vivo. Målgenet af MIR-137 blev forudsagt af Targetscan on line software, screenet ved dobbelt luciferasereportergen assay og påvist ved Western blot. Som et resultat af ekspressionen af ​​MIR-137 blev signifikant reduceret i gastrisk cancercellelinie HGC-27, HGC-803, SGC-7901 og MKN-45 samt i gastrisk cancer væv sammenlignet med GES-1 celle eller matchet hosliggende ikke -neoplastic væv ( s
< 0,001). Genindførelsen af ​​miR-137 ind i gastriske kræftceller var i stand til at hæmme celledeling, migration og invasion. In vivo eksperimenter viste, at MIR-137 overekspression kan reducere gastrisk cancer celleproliferation og metastase. Bioinformatik og Western blot-analyse indikerede, at MIR-137 fungerede som tumorsuppressor roller på gastriske kræftceller ved at målrette AKT2 og længere påvirker Bad og GSK-3β. Som konklusion MIR-137 som ofte nedreguleret i mavekræft er potentielt involveret i gastrisk cancer tumorgenese og metastase ved at regulere AKT2 relaterede signalveje

Henvisning:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et al. (2015) MicroRNA-137 Bidrager til afdæmpet tumorigenese i Human Gastric Cancer ved Målretning AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124

Academic Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Modtaget: August 15, 2014 Accepteret: 18. maj 2015; Udgivet: 23 juni 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Funding:.. Dette arbejde blev støttet af Medical videnskabelige og teknologiske forskningsprojekter af Henan-provinsen, Kina (2011030004)

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

mavekræft (GC) er den anden hyppig årsag til kræftdødsfald i verden [1]. Hidtil mekanismen af ​​gastrisk carcinogenese er stort set ukendt. Forskerne har forsøgt at studere GC fra den opfattelse af biokemi og molekylær biologi at nogle tumorsuppressorgener og tumorrelaterede gener er blevet rapporteret i GC. MikroRNA'er (miRNA) er endogent små ikke-kodende RNA på 18 ~ 22 nukleotider, som er blevet identificeret som posttranskriptionel regulatorer af genekspression [2, 3]. MiRNA spiller kritiske roller i masser af biologiske processer såsom spredning, udvikling, differentiering og apoptose. I mellemtiden har miRNA blevet valideret til at fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener under tumorigenese. For eksempel blev MIR-31 identificeret som et onkogen i esophageal pladecellecarcinom [4] og MIR-451 fungerer som en tumorsuppressor i human ikke-småcellet lungekræft [5]. Der er også mange microRNA blev identificeret i relation til mavekræft sker og udvikling [6-13]. Det er også blevet rapporteret, at overekspression af MIR-1, MIR-20a, MIR-27a, MIR-34a og MIR-423-5p kan anvendes som diagnostiske kriterier for mavecancer [14] .Derfor miRNA er potentiale kandidater af nye diagnostiske biomarkører eller terapeutiske mål for mavekræft.

MicroRNA-137 (miR-137) er blevet rapporteret til at være nedreguleret og spille roller som en tumor suppressor i kolorektal cancer og kræft i mundhulen [15, 16]. Men funktionen af ​​miR-137 og dens mekanisme underliggende gastrisk carcinogenese er stadig ikke helt klart. Chen et al viste, at MIR-137 kan spiller som tumorsuppressor ved at målrette Cdc42 til at regulere cellens cyklus i gastrisk cancer [17]. Alligevel er det klart for os, at microRNA regulerer biologiske adfærd ved multipel måde sti, der kunne være mere regulering mekanisme miR-137 mod GC tumorigenese. I denne undersøgelse målt vi ekspressionen af ​​MIR-137 i 100 patienter med gastrisk cancer og undersøgt den rolle, MIR-137 i gastriske cancerceller. Vi fandt nogle andre funktioner i miR-137 i GC samt anden sti måde, hvorpå miR-137 spillede en rolle tumorsuppressor i GC tumorigenese.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

Alle humane undersøgelser er blevet godkendt af den relevante etiske komité, og er derfor blevet udført i overensstemmelse med de etiske standarder. Alle personer gav deres informerede samtykke forud for deres optagelse i undersøgelsen.

Patienter og prøver

Humane mavekræft prøver blev indsamlet fra kirurgiske prøver fra 100 patienter (mandlige 56, kvindelig 44) med GC ved Cancer Institute og Hospital, First tilknyttede hospital af Henan University; Anden Hospital i Folkets Befrielseshær i Kina; Hebei Cancer Hospital. Ikke-tumorprøver fra makroskopiske tumor margin blev isoleret på samme tid og anvendes som de matchede hosliggende ikke neoplastiske væv. Alle prøver blev opdelt i to dele. Vævsprøver blev opsamlet straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Brugen af ​​vævsprøver for alle forsøg blev godkendt af den etiske bestyrelsen for Institut for Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences. Alle deltagere, forudsat at deres verbale informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og deres verbale informeret samtykke blev skrevet ned. Denne onsent proces blev ligeledes godkendt af den etiske bestyrelse. Fire gastriske cancercellelinier (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 og MKN-45) blev alle bevaret i vores laboratorium og opretholdt i DMEM eller 1640 med 10% FBS.

RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og real-time PCR-analyser

Total RNA fra væv og celler blev ekstraheret ved Trizol metoden (Ambion, USA) fuldstændigt følge anvisningerne. Enkeltstrengede cDNA blev syntetiseret ved M-MLV (Ambion, USA) under anvendelse af 2 ug totalt RNA som template. Oligo (dT) 18 blev anvendt til mRNA revers transkription mens stem-loop anvendes til miRNA. Real time-PCR (RT-PCR) blev udført ved Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) under anvendelse SYBR mix (Tiangen, Kina). PCR betingelse var: 95 ° C x 30 sek, efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C x 5S, 60 ° C x 34s. For mRNA'er, blev GAPDH anvendt som normaliseret kontrol. For miRNA blev U6 snRNA anvendes til miRNA kontrol. Den relative ekspression af MIR-137 blev beregnet ved 2-ΔΔCT metode. Primersekvenser er vist i tabel 1.

Plasmidkonstruktion

MIR-137 precursor sekvens genereret ved annealing og MIR-137-precursor-F og MIR-137-precursor-R forlængelse var i mellemtiden fordøjet af BamHI og BgIII, hvis produkter var indsætter i BamHI-BgIII fragment af pcDNA-GW /EmGFP-miR vektor (GenePharma, Kina). Ved mellemtiden var negativ kontrol også konstrueret.

Cell kultur og miRNA transfektion

De cellelinier HGC-27, SGC-7901 MKN-45 og GES-1 blev købt fra Cell Resource center of Institut for Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College (Beijing, Kina). De humane gastrisk cellelinier HGC-27, SGC-7901 og MKN-45 blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og human gastrisk epithel cellelinie GES-1 blev opretholdt i DMEM ( Gibco, BRL, UK) medier. MIR-137 mimic og scramble mimic som er ikke-homolog til det humane genom blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina) og transficeret ind i cellerne til en endelig oligonukleotid koncentration på 10 nmol /L. Alle celletransfektioner blev indført ved DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA) i overensstemmelse med producentens anvendte instruktioner. For hver celle transfektion blev udført to eller tre replikering eksperimenter.

Celleproliferation og apoptose assay

Celleproliferation blev udført ved CCK8 metode (DOJINDO, Japan). Kort fortalt blev ca. 5000 MIR-137 mimic transficerede celler og kapløbet celler henholdsvis podet i plader med 96 brønde og dyrket. Opformeringsrater blev bestemt ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 timer efter transfektion ved at tilføje 10 pi CCK8 regent og testet i henhold til manuskripterne. De apoptoseassays blev testet i HGC-27 og SGC-7901 cellelinier med eller uden MIR-137 overekspression af Apoptose Detektion Kit I (BD Biosciences, USA) og C6 flowcytometer (USA).

Cell migration og invasion analyser

Vi udførte den sårhelende assay til at teste celle migration evne med eller uden miR-137 transfektion. De kunstige sår blev produceret på sammenflydende cellemonolag med FBS free, under anvendelse af en 200 uL pipettespids 24 timer efter MIR-137 transfektion. Billederne blev henholdsvis taget ved 0, 12, 24 og 36 timer efter sår oprettelse.

Vi udførte derefter transwell assays til evaluering cellers invasion evne. 5 × 10 ^{4 celler suspenderet i 200 pi medium uden FBS blev placeret på den øverste kammer i hver indsats med 430μl af 1 mg /ml matrigel (Millipore, USA). 600μl medium med 10% FBS som den ernæringsmæssige tiltrækningsstof blev sat i det nedre kammer. Efter 24 timer blev cellerne fæstnet til den nedre flade af kammeret var kapacitetsomkostninger 20 min af 20% methanol og farvet i 10 minutter med 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Invasionen membraner blev derefter skåret ned og indlejret under dækglas. Vi tælles cellerne i 3 forskellige vision felter i stand med 20 × Magni fi kation, som derefter blev anvendt som det gennemsnitlige antal celler. Alle analyser blev udført i tre uafhængige forsøg.}

Animal eksperiment

De forsøg med dyr blev udført i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og de institutionelle etiske retningslinjer for dyreforsøg. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg af knasterne (kinesiske Academy of Medical Sciences) (Tilladelse nummer: C72-14-0664). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Scramble-transficeret og miR-137 overekspression HGC-27 celler (5 x 10 ^{6 celler) blev inokuleret s.c. i den dorsale flanker på BALB /c nøgne mus (hunner, nu /nu, 6 uger gamle), som alle blev købt fra Animal Centre of Henan University og opvokset i patogenfrie betingelser. Volumenet af tumoren blev målt i 5 uger. Alle mus blev dræbt og subkutant tumorer blev reseceret og vægten af ​​tumorer blev testet. Til in vivo metastase eksperimenter blev HGC-27-celler opsamlet 24 timer efter transfektion. Den celleviabilitetstest blev udført under anvendelse af et XTT-assay kit24 time efter transfektion ifølge producentens instruktioner (Roche, Tokyo, Japan). Derefter mus (hunner, nu /nu, 6 uger gamle) blev injiceret med HGC-27-celler med eller uden MIR-137 overekspression gennem halevenen med 2 × 10 5 celler i PBS. De HGC-27 celler blev ændret som stabilt kan udtrykke luciferase (bygget af GENECHEM, Shanghai, Kina). Cellerne blev kontrolleret i mikroskop for at sikre, at cellerne var i god stand. Efter seks uger blev Bioluminescens billeddannelse udføres med en IVIS Spectrum og image udstråling værdier blev normaliseret ved hjælp Living Image (Caliper Life Science, USA).}

Immunhistokemi

Væv blev indlejret i paraffin sektioner og behandlet 2 timer ved 65 ° C og derefter deparaffinised. Før du anvender de primære antistoffer ved 4 ° C natten over, vi foretaget antigenet hentning trin. Derefter blev objektglassene inkuberet med sekundært antistof ca. 2 timer ved 25 ° C konjugeret til HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kina). Liquid DAB + Substrat (zsgb-bio, Kina) blev anvendt til påvisning af HRP-aktivitet.

Luciferase miRNA target reporter assay

Den fulde længde af 3'UTRs menneskelige Akt2 mRNA var hver PCR amplificeret og klonet ind i pMIR-REPORTTM Luciferase Reporter Vector (Ambion, USA) til at generere reporterne. Mutationer af de forudsagte frø regioner i de mRNA-sekvenser blev skabt under anvendelse af primere, herunder de muterede sites. HEK-293T-celle podedes på plader med 24 brønde (1 x 10 ^{5 celler pr brønd) dagen før transfektioner blev udført. Celler (-70% sammenflydende) blev transficeret med pRL-TK luciferase reportere (50 ng /brønd), PGL-3firefly luciferase (10 ng /brønd), og efterligne-137 (50 nmol /l, GenePharma, Shanghai, Kina) eller scramble (50 nmol /l) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase aktiviteter blev målt ved anvendelse af Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, USA).}

Western blotting

Proteiner blev separeret på 10% SDS-PAGE og derefter overført til 0,45 um PVDF-membraner (Amersham, UK). Membranerne blev inkuberet med 5% fedtfri tørmælk natten over ved 4 ° C og med anti-AKT2 monoklonalt antistof (Proteintech, USA) ved 1: 1000 fortynding; anti-Bad monoklonalt antistof (Bioworld, USA) ved 1: 500 fortynding; anti-GSK-3B-polyklonalt antistof (Bioworld, USA) ved 1: 1000 fortynding; anti-GAPDH-antistof (Proteintech, Chicago, USA) ved 1: 30.000 fortynding. Efter vask to gange med TBST blev membranerne inkuberet med gede-anti-kanin-antistof (zsgb-bio, Kina) ved 1: 5000 og 1:. 50000 fortyndinger i 2 timer

Statistik

Hver forsøg blev gentaget mindst tre gange. Students t-test (to-halet) og x ^{2 test blev udført, og statistisk signifikant blev sat til α = 0.05 to-side). Middel ± SD vises i figurerne.}

Resultater

MIR-137 er nedreguleret i gastriske kræftceller og kliniske prøver

Vi først undersøgt udtryk for moden miR -137 i 4 humane gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 og MKN-45) og gastrisk epitel celle (GES-1). Disse GC cellelinjer udviste ekstraordinært lavt ekspression af MIR-137 sammenlignet med GES-1-cellelinien (Fig 1A). For yderligere at undersøge forholdet af MIR-137 med GC forekomst, detekteres vi ekspressionen af ​​MIR-137 i 100 kliniske patienter (mænd 56, hun 44; gennemsnitsalder 53 år) af Taqman probe-drived realtids-PCR som beskrevet ovenfor. Ud af 100 GC prøver blev ekspression af miR-137 nedreguleret i 77 tilfælde (77%) sammenlignet med tilstødende væv, da afbrød blev oprettet som 1.5. I mellemtiden MIR-137 blev opreguleret i 23 tilfælde (23%) (fig 1B og 1C). Generelt ekspressionen af ​​MIR-137 i GC væv var lavere end i tilstødende væv i statistisk signifikante forskelle (p = 0,00079, parret t-test, to-halet, Fig 1C). Desuden har vi fundet en statistisk signifikant sammenhæng mellem ekspressionen af ​​MIR-137 og mavekræft kliniske stadium. De patienter, der har de lavere niveauer af miR-137-ekspression var forbundet med høj kvalitet og sen-fase tumorer (Fig 1D). Disse resultater viste, at ændringer af miR-137 kunne være involveret i mavekræft progression.

MIR-137 hæmmer celledeling in vitro og in vivo

Vi transficerede miR-137 efterligne i GC cellelinjer HGC-27 og SGC-7901, som begge viste stor transfektionseffektivitet (figur 2A). Resultaterne af CCK8 vækstassays ved 0, 1, 2, 3 og 4 d efter MIR-137 og scramble transfektion er vist i fig 2B. Sammenlignet med scramble transfektion MIR-137 transfektion signifikant reducerede proliferation af begge cellelinier (figur 2B). Derefter undersøgte vi effekten af ​​miR-137 på celle apoptose. De tidlige apoptotiske celler i kapløbet gruppen var omkring 10% i HGC-27 og 2,9% i SGC-7901, hvorimod efter miR-137 transfektion blev procentdelen af ​​tidlige apoptotiske celler steg til 17,5% i HGC-27 og 8,3% i SGC-7901, som i væsentlig grad viste forskel (figur 2C). Ud fra disse resultater kan det konkluderes, at miR-137 kunne undertrykke lungekræft celleoverlevelse ved at inducere tidlig apoptose.

For yderligere at verificere over resultaterne, en in vivo model blev konstrueret. Vi fandt, at tumorvækst var signifikant lavere i miR-137 overekspression mus end i kontrollerne (Fig 2D, 2E og 2G). Efter aftale med kurve tumorvæksten, vægten af ​​tumorer induceret af kapløbet celler var signifikant højere end den af ​​MIR-137 overekspression (fig 2F). Disse resultater bekræftede endvidere, at miR-137 overekspression kunne begrænse mavekræft proliferation in vivo.

MIR-137 hæmmer celle migration og invasion in vitro og in vivo

Vi yderligere vurderet virkningerne af miR-137 på celle migration og invasion, som var de vigtigste bestemmende faktorer for ondartet progression og metastaser. Virkningerne af miR-137 på cellemigration blev påvist ved en sårheling /scratch assay i HGC-27 og SGC-7901 celler. Begge af to cellelinier behandlet med MIR-137 mimic var markant mindre migrerende end scramble kontrol eller ubehandlede celler ved 12, 24 og 36 timer efter at ridse (Fig 3A). Desuden gennemførte vi celleinvasion assay til måling af de retningsbestemte invasions evner af cellerne efter MIR-137 overekspression. Som et resultat blev invasivitet af celler transficeret med MIR-137 mimic dramatisk faldt sammenlignet med scramble celler i HGC-27 og SGC-7901 (Fig 3B). Derefter blev in vivo eksperimenter anvendes til yderligere at vurdere dette resultat. Vi først påvist, at celler transficeret med MIR-137 mimic eller efterligner kontrol ikke viste en signifikant fald i cellelevedygtighed sammenlignet med ubehandlede celler. Også der er ingen forskel i cellelevedygtighed mellem cellerne transficeret med MIR-137 mimic sammenlignet med negativ kontrol (S2 Fig). Som vist i fig 3C, bioluminescerende billeddannelse af mus i MIR-137 overekspression gruppe viste en meget mindre billede. Også antallet af lunge metastase pr mus i MIR-137 udviste en signifikant lavere niveau sammenlignet med scramble gruppe, der indikerede, at MIR-137 kunne undertrykke metastase in vivo. Disse resultater viste, at MIR-137 spillede vigtige roller i reguleringen af ​​cellemigrering og invasionsevne i gastrisk cancer og foreslog, at nedregulering af MIR-137 kunne bidrage til tumormetastase i gastrisk carcinogenese.

MIR-137 målretter AKT2 i GC

miRNA udført biologiske funktioner gennem en negativ regulering af deres mål gener. Som forudsagt var der komplementaritet mellem har-miR-137 og AKT2 3'-UTR (figur 4A).

For at teste hypotesen om, at AKT2 kan være et mål for miR-137, en reporter plasmid huser den vilde -type 3'-UTR-regionen i AKT2 nedstrøms for den luciferase-kodende region (fig 4A, AKT2_WT) blev konstrueret. HEK-293T-celler blev cotransficeret med reporterplasmidet (AKT2_WT) og scramble. Som et resultat heraf viste MIR-137 transficerede celler en markant reduktion (≈58%) af luciferaseaktivitet (Fig 4B). Derefter blev det samme assay udført for en anden reporterplasmid indeholdende muterede AKT2 3'-UTR i MIR-137-bindingssteder. Som forventet blev inhiberingen af ​​luciferaseaktivitet ved MIR-137 delvist fjernet med bindingssted 1 eller bindende cite 2 mutanten og næsten afskaffet i AKT2_MUT dobbelte mutant, hvilket antyder, at den konserverede region var fuldt ud ansvarlig for MIR-137 funktion (fig 4B) .

for yderligere at undersøge samspillet mellem miR-137 og AKT2, HGC-27 og SGC-7901 celler blev transficeret med miR-137. AKT2 mRNA-ekspression blev bestemt ved real-time PCR. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem MIR-137-behandlede og scramble-behandlede eller ubehandlede HGC-27 og SGC-7901 celler (figur 4C). Derefter blev western blotting-analyse udført for at måle niveauet af AKT2 protein. Vi fandt, at ekspressionen af ​​AKT2 protein ned blev reguleret i MIR-137 behandlede HGC-27 og SGC-7901 celler, men ikke i scramble eller ubehandlede celler (Fig 4D). Disse data antyder, at MIR-137 direkte genkender 3'-UTR af AKT2 mRNA og hæmmer AKT2 oversættelse. Således nedregulerede MIR-137 i mavekræft inhiberer undertrykkelse af AKT2, som igen aftage tumorigenese.

AKT2 er medlem af AKT familien. Vi yderligere opdaget sine nedstrømseffektorer Bad og GSK-B. Som et resultat, p-Bad og p-GSK-B var naturligvis nedreguleret i MIR-137 behandlede HGC-27 og SGC-7901 celler sammenlignet med scramble-behandlede eller ubehandlede celler. Ingen signifikant ændring blev fundet i ikke-phosphoryleret Bad eller GSK (Fig 4E). Disse resultater tyder på, at den fremskyndede gastrisk kræft vækst celle var delvis skyldes de over-actived Akt veje. Udover at fremme celleproliferation, kunne actived Akt også phosphorylerer Bad på Ser112 og Ser136, blokering Bad-induceret celledød. I mangel af phosphorylering på disse steder, er Bad menes at interagere med Bcl-xl for at inducere celledød. I modsætning hertil kan Akt-medieret hyperphosphorylering af Bad fremme celleoverlevelse i cancerceller. Vores Western blotting resultater bekræftede ovenstående spekulationer om, at ændringen af ​​gastrisk kræft celle aktiviteter i tilstanden af ​​miR-137-transfekterede celler kan være et resultat af nedsat fosforylering af Bad. Derudover analyserede vi protein niveauer af AKT2 i 12 GC patientsin hvem miR-137 blev nedreguleret. Blandt disse prøver, AKT2 var opreguleret in9patientsin deres GC væv (Fig 4F).

Restaureringen af ​​AKT2 blyholdig til en aktivering af invasion og en undertrykkelse af apoptose

For yderligere at demonstrere rollerne for mIR-137 og AKT2 spillet under tumorigenese, undersøgte vi effekten af ​​restaureringen af ​​AKT2 i mIR-137 transficerede celler. Den vestlige blot vist, at AKT2 protein niveauet i AKT2 overekspression prøve tilsyneladende var højere end den negative kontrol, selv under undertrykkelse af miR-137. Restaureringen af ​​AKT2 blyholdig til en aktivering af invasion og en undertrykkelse af apoptose (figur 5).

Diskussion

miRNA er ofte indikeret at være ofte dysreguleret i menneskets forskellige kræftformer og nogle miRNA har endda blevet anvendt anvendes som terapeutiske mål for kræft. De undersøgelser, der henviser til forholdet mellem miRNA og kræft kunne hjælpe os med den forståelse af cancer.

Der er kun få undersøgelser henviser rolle miR-137 spilles i mavekræft. Det er blevet rapporteret, at MIR-137 er en negativ regulator af Cdc42 og ved at målrette hvilke inducere apoptose og cellecyklus G1 standsning i gastriske cancerceller [17]. Men reguleringen effekt af microRNA i kræft er ganske kompliceret. Det synes umuligt, at miR-137 regulerer mavekræft som det indre vej. I denne forskning, funktion og mekanisme, miR-137 regulerede mavekræft blev yderligere undersøgt.

For det første opdaget vi udtryk for miR-137 ud af 100 patienter, og fandt, at ekspressionen af ​​miR-137 er betydeligt ned -regulated i kræft prøve. Desuden har vi fundet en statistisk signifikant sammenhæng mellem ekspressionen af ​​MIR-137 og mavekræft kliniske stadium. Disse resultater viste, at ændringer af MIR-137 kunne være involveret i gastrisk cancer progression. Vi har forsøgt at finde forholdet mellem miR-137 og patienternes alder og køn, men ingen statistiske resultat blev fundet. Da nærværende undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​miR-137 blev nedreguleret i de fleste af GC væv sammenlignet med tilstødende væv (77%), kunne vi overveje om diagnosen og prognostiske brug af miR-137. Yderligere validering i prospektive studier er berettiget, og mere tilgængelige prøver kilder, såsom miR-137-berigede tumorafledte exosomer fra blod, bør undersøges. Desuden bør det bemærkes, at i nogen grad det afskårne værdi (afskåret = 1,5) vi valgte kunne være endnu vilkårlig. Når det blev sat højere, kunne der være færre patienter med MIR-137 nedreguleret i cancervæv. Men selv i denne tilstand, der var ca. 23% af de kræftformer har høj MIR-137-ekspression. Dette kan skyldes den individuelle forskel blandt patienter, at nogle individer kan have forskellige genekspression mønster under tumorigenese eller cancer progression.

Som ekspressionen af ​​MIR-137 i GC væv var lavere end i tilstødende væv i statistisk signifikante forskelle (p = 0,00079), kunne vi spekulere, at dette udtryk karakteristisk var forbundet med udvikling af kræft. Denne spekulation blev bekræftet ved in vitro og in vivo undersøgelser, at MIR-137 negativt kan regulere celleproliferation, migration og invasion. MIR-137 ekspressionsniveauet kan holde på et højt niveau i en lang periode efter transfektion både i gastrisk cancer cellelinjer, slutstadium xenotransplantattumorer og inmetastatic placering i lungerne (S1A Fig-S1c Fig). Imidlertid overekspressionen metode fører til meget høje ekspressionsniveauer af MIR-137 (Fig 2A). Dette høje niveau af MIR-137 kan forårsage yderligere effekter. For eksempel, miR-137 er en negativ regulator af Cdc42 og målretning som induktion af apoptose og cellecyklus G1 anholdelse i gastriske cancerceller [17]. Da MIR-137 i vores undersøgelse blev opreguleret tusindvis af gange, kan det føre til inhibering af andre mål, såsom Cdc42. Det er klart, i dette studie kan vi ikke udelukke, at de tumor suppressor virkninger af miR-137 blev formidlet ved at undertrykke andre målgener.

Så fandt vi, at miR-137 fungerer som et tumorsuppressorgen gennem målrettet AKT2 , som er medlem af AKT familien. Genoprettelsen af ​​AKT2 forårsager opregulering af AKT2 i MIR-137 transficerede celler, hvilket er langt højere end den scramble. Dette kan skyldes, at AKT2 overekspression vendt proteinniveauet MIR-137 undertrykt. Vigtigere, genoprettelse af AKT2 regulerer apoptose og invasion af gastriske cancerceller, hvilket fører til en aktivering af invasion og en undertrykkelse af apoptose (figur 5). Denne redning eksperiment giver yderligere bevis for, at miR-137 aktive celle apoptose og negativt regulere celle invasion ved at målrette AKT2. In vivo eksperimenter viste også, at MIR-137-ekspression er negativt i forhold til AKT2 ekspression (S1D Fig og S1E Fig). AKT er en afgørende faktor PI3K /AKT sti måde. Den nedregulering af AKT2 yderligere påvirker dens downstream-protein Bad og GSK-3B, at p-Bad og p-GSK-B naturligvis ned blev reguleret. Bad kan spille sine roller ved phosphorylering og yderligere reguleret cellens skæbne [18]. GSK-3B, som også er kendt som GSK-3β normalt, styrer cellen indvandring og invasion. Afslutningsvis har vi identificeret en sammenhæng mellem miR-137 og AKT2 der er en ny bestanddel af mavekræft tumorigenese. MIR-137 har vist sig at være relateret til AKT2 regulering [19]. I hepatocellulært carcinom, miR-137 hæmmer kræft cellevækst og metastase via direkte rettet mod AKT2 [20]. Faktisk har vi e screenet 8 gener som potentielle mål for miR-137 (S1 tabel). Men AKT2 er den eneste direkte mål for miR-137 efter dobbelt luciferasereportergen assay og western blot undersøgelse. Fra figur 4D kan vi finde thatmiR-137 kan påvirke AKT2 og p-AKT2in både HGC-27 og SGC-7901 celler. Men interessant nok i SGC-7901 phosphorylering status var tilsyneladende påvirket mere. Dette fænomen kan konsekvent overholdes i de tre gentagne blots vi udførte. Vi trækkes at der kunne være på grund af den særlige egenskab af forskellige kræftceller. Der kan være specifik regulering sti måde miR-137 i SGC-7901, som undertrykte phosphorylering status AKT2.However, fra den nuværende forskning, kan vi ikke fuldt ud forklare denne mekanisme. Når vi valgte de patienter, der har lav udtryk for miR-137 i deres GC væv at påvise AKT2 protein udtryk, fandt vi de fleste af disse patienter (9/12) har høj AKT2 niveau i deres GC væv. Dette resultat antydede, at MIR-137 kunne målrette AKT2 hos patienter. Der var også tre patienter, der har lav ekspression af AKT2 i GC væv selvom ekspressionen af ​​MIR-137 er lav. Dette resultat kan skyldes den individuelle forskel blandt patienter.

Afslutningsvis vores udtryk og funktionelle undersøgelser antydede, at MIR-137 er ofte nedreguleret i gastrisk cancer kan virke som en tumorsuppressor i GC-celler, genindføre ekspression på GC-celler undertrykt gastrisk cancer celleproliferation, migration og invasion ved direkte målretning AKT2. Således er vores værker er et godt supplement til det tidligere arbejde, og er nyttigt for os at forstå miR-137 reguleringsmekanisme i kræft.

Støtte Information
S1 Fig. MIR-137 og AKT2 ekspression efter transfektion.
A. MIR-137-ekspression i HGC-27-celler og SGC-7901 celler 72 timer efter transfektion. B. miR-137 udtryk i end-stage xenotransplantattumorer. C. MIR-137-ekspression i metastatiske lokalisering af mus lunger. D. AKT2 ekspression i metastatiske lokalisering af mus lunger. Vi blandede de fem lunger sammen i den samme gruppe. E. AKT2 ekspression i metastatiske lokalisering af mus lunger. Vi har registreret den Akt2 proteinekspression i hver mus hhv. 30 pg totalt protein blev anvendt for hver prøve
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 Fig. Cellernes levedygtighed assay før metastaser eksperiment
cellelevedygtighed blev udført 24 timer efter transfektion
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 Fig. Adensitometric analyse af figur 4E
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF)
S1 tabel. . Potentielle målgener af miR-137
De potentielle målgener af miR-137 blev forudsagt af online software og opdaget af dobbelt luciferasereportergen assay og vestlige bloting
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124. S004
(DOCX)

anerkendelser

forfatterne takker Dr. Chengyuan Feng fra Cancer hospital, kinesiske academy of lægevidenskab for teknisk bistand og artiklen revision.

• PLoS ONE: Identifikation og karakterisering af CXCR4-positiv mavekræft Stamceller
• PLoS ONE: De mikroRNA-217 Funktioner som en potentiel tumorsuppressor i Gastric Cancer ved at målrette GPC5